HPLC II. Indah Solihah

HPLC II

2 HPLC-2011

Teknik Elusi



Isokratik:

- teknik elusi menggunakan komposisi fase

gerak tetap (polaritas tetap) selama proses kromatografi berlangsung



Gradien:

- teknik elusi menggunakan komposisi fase

gerak yang berubah-ubah (polaritas berubah) selama proses kromatografi berlangsung

3 HPLC-2011

4 HPLC-2011

Eluen=

campuran

A + B

50 % B

5 HPLC-2011

30 % B

6 HPLC-2011

Teknik Gradien

Dengan mendasarkan data pada teknik isokratik di atas, kemudian dilakukan

7 HPLC-2011

8 HPLC-2011

Normal-Phase HPLC

[ Fase diam lebih polar dibanding fase gerak ]

 Senyawa polar:

- terelusi belakangan (t_R panjang)

- semakin non-polar fase gerak,

t_R senyawa polar makin panjang

 Solven:

- campuran metilen klorid, dietileter, kloroform

 Eluent strength:

9 HPLC-2011

Reversed-Phase HPLC

 Senyawa polar:

- terelusi lebih dahulu

 Semakin polar fase gerak, senyawa non-polar lebih kuat tertahan

 Solvent: Campuran metanol, asetonitril, tetra- hidrofuran

 Eluent strength:

- dimodifikasi dengan air

(Kellner dkk., 1998)

Reversed-Phase HPLC

Perkirakan urutan elusi, dari pertama sampai terakhir, pada steroid-steroid berikut ini dari kolom ODS dg fase gerak

metanol/air (70:30)

Nandrolone

Detektor

Bagaimana Memilih detektor dan Apa pertimbangannya

???

Detektor HPLC

Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu:

detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan tidak

bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa;

detektor yang spesifik yang hanya akan

mendeteksi analit secara spesifik dan selektif,

seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan elektrokimia.

Detektor HPLC

Bulk property detector (BPD) :

- mengukur sifat solute dan fase gerak

contoh : detektor indeks bias ( RI )

 Solute property detector (SPD) :

- hanya mengukur sifat solute

- 1000 kali ≥ sensitif dibanding BPD

Syarat Detektor :

• _{Cukup sensitif}

• _{Stabilitas dan reprodusibilitas tinggi} • _{Respon linear terhadap solut}

• Waktu respon pendek sehingga tidak bergantung flow rate (kec.alir)

• _{Mudah digunakan}

Detektor UV

• Detektor ini bekerja pada λ tertentu dimana pelarut tidak menyerap sinar pada λ tersebut sedangkan sampel menyerap dengan kuat.

• Ada dua jenis detektor UV : detektor dengan

satu panjang gelombang (254 nm) dan detektor dengan λ yg dapat diubah-ubah antara 200-700 nm

• Detektor mempunyai jangka kepekaan yg lebar

• Detektor ini hanya bekerja jika senyawa mempunyai kromofor

Detektor UV

Untuk keperluan analisis komponen utama dalam sampel secara HPLC-UV diperlukan minimal nilai



senyawa harus ≥ 10 M-1_{. cm}-1

pada  ≥ 185 nm.

 Untuk keperluan trace analisis secara HPLC-UV diperlukan minimal nilai



senyawa harus ≥ 1000 M-1_{. cm}-1

Untuk trace analisis secara HPLC deteksi UV, senyawa dengan nilai



senyawa  100 M-1_.

UV / Visible detector

Advantages

• High sensitivity & small sample volume required

• Can be used with gradient elution

• Is relatively cheap and not sensitive to temperature

• Sensitive to large number of organic compounds

Disadvantages

• Does not work with

compounds that do not absorb light at this wavelength region

• Cannot be used with the solvents having large

absorption in the UV region

• Cannot be used for the sample components which cannot be absorbed in the UV region

Detektor PDA

• _{Mampu memberikan kumpulan kromatogram}

secara simultan pada panjang gelombang yg berbeda dlm sekali proses (single run)

• _{Pada kromatogram dapat pula ditampilkan}

spektrum UV shg dpt digunakan untuk memilih λmaks utk sistem HPLC

• Spektrum dan kromatogram yang dihasilkan ditampilkan sbg plot 3 dimensi (absorbansi, panjang gelombang, dan waktu)

Detektor Fluoresensi

• _{Merupakan detektor yg paling peka, tetapi}

hanya dapat dipakai untuk senyawa yg bisa berfluorisensi, karena itu kadang2 solut

diubah menjadi turunan senyawa yg berfluorisensi sebelum dikromatografi

26 HPLC-2011

Detektor UV

vs

Fluorescen

UV

27 HPLC-2011

Luminescence

Bagaimana terjadinya fluorescensi ???

Fluorescene detection

• Compared to UV-VIS detectors fluorescence detectors offer a higher sensitivity and selectivity that allows to quantify and identify compounds and impurities in complex matrices to extremely low concentration levels

(trace level analysis)

• Fluorescence detectors sense only those

substances that fluoresce

excitation

Mobile phase

emission

basic principles of HPLC - 1

HPLC-2011 29

Derivatisasi

Apa arti derivatisasi …

?

Apa tujuannya …

?

Bagaimana caranya …

?

30 HPLC-2011

Tujuan Derivatisasi

Derivatisasi adalah reaksi suatu senyawa

dengan pereaksi (agen) penderivat untuk menghasilkan derivat (turunan) senyawa ybs

Menghasilkan senyawa yang tadinya tidak bisa

dideteksi menjadi bisa dideteksi (senyawa

non-kromofor  senyawa berkromofor)

Meningkatkan daya deteksinya (senyawa

berkromofor UV  senyawa berkromofor fluorescensi)

Syarat reaksi derivatisasi

1. Produk yang dihasilkan harus mampu menyerap baik sinar UV-Vis atau membentuk senyawa

berfluoresen sehingga dapat dideteksi dengan spektrofluorometri;

2. Proses derivatisasi harus cepat dan

menghasilkan produk yang sebesar mungkin (100 %);

3. Produk hasil derivatisasi harus stabil selama proses derivatisasi dan deteksi;

4. Sisa pereaksi untuk derivatisasi harus tidak menganggu pemisahan kromatografi.

32 HPLC-2011

Captopril

N HS COOH CH₃ O

Dapatkah Captopril dianalisis secara HPLC dengan detektor UV ?

33 HPLC-2011

Derivatisasi dg

p

-Br fenacylbromide

E t i l a m i n Captopril p -Br fenacylbromide N HS COOH CH₃ O C-CH₂-Br Br O +

34 HPLC-2011 Hasil derivatisasi : Captopril +

p

-Br Fenacylbromide N HS CH₃ O Br O O C-O-CH₂-C

35 HPLC-2011

Gabapentin

C

OH

O

H

₂

N

Dapatkah Gabapentin dianalisis secara HPLC dengan detektor UV atau Fluorescen ?

HPLC-2011 36

Derivatisasi

dg

Dansilklorid

Fluorescent derivative + R-NH₂ O=S=O Cl N CH₃ H₃C - HCl O=S=O NH N CH₃ H₃C R Dansil klorid

Contoh Senyawa

Asli

Yang

38 HPLC-2011

39 HPLC-2011

Asam Salisilat

C

O

O

H

As.Salisilat - Fluorescensi

C

O

O

H

Papaverin HCl

N CH₂ OCH₃ OCH₃ H₃CO H₃CO _.HCl

Riboflavin

N N NH N _O OH OH OH CH₂-CH-CH-CH-CH₂OH O H₃C H₃C

Detektor Indeks Bias

• _{Indeks bias solut dan pelarut harus berbeda} • Detektor mengukur perbedaan antara indeks

bias pelarut murni dan indeks bias pelarut yg keluar dari kolom, perbedaan ini disebabkan oleh adanya solut.

• Detektor ini tidak dapat dipakai untuk elusi

bergradien karena indeks bias sistem berubah selama kromatografi

Refractive index (RI) detection

• The ability of a compound or solvent to deflect light provides a way to detect it

• The RI is a measure of

molecule’s ability to deflect light in a flowing mobile phase in a flow cell relative to a static mobile phase contained in a reference flow cell

• The amount of deflection is proportional to concentration

• The RI detector is considered to be a universal detector but it is not very sensitive

Detektor Elektrokimia

• _{Detektor ini menggunakan sifat redoks solut}

untuk mengukur kehadiran solut tersebut.

• Memiliki kepekaan yg tinggi

• _{Fase gerak harus polar dan mengandung}

Detektor Spektrometri Massa

• _{Untuk identifikasi senyawa murni} • _{GC-MS : terjadi pola fragmentasi}

• _{LC-MS : tdk terjadi pola fragmentasi} • Data berupa berat molekul, terkadang

49 HPLC-2011

Bentuk Kromatogram

Bentuk kromatogram (peak) ada berma-

cam-macam, a.l:

- tailing, fronting (leading)

- asimetri, simetri

- pecah

Possible cause: Possible solution:

Dead volume in flow path

Check all fittings, especially post-column and at the column head

Mobile phase too weak

Remake mobile phase or increase acid

concentration Peak Tailing

Possible cause: Possible solution:

Overloading of column

Dilute sample 1:10 and rerun or use a larger capicity column

Column is poorly packed

Run high organic through column, then equilibrate and retry, or replace column

HPLC-2011 51

Peak asymmetry - tailing

HPLC-2011 52

Peak Asymmetry vs Tailing

Baca:

Snyder dkk., 1997

HPLC-2011 54

55 HPLC-2011

Pengatasan Peak Tailing

Tambahkan 30 mM:

- Trietilamin (utk seny. basa)

- Amonium asetat (utk seny. asam)

 Bila Tailing masih tetap ada, gantilah trietil-

amin dengan:

10 mM dimetiloktilamin atau dimetiloktil- amin asetat

 Kurangi jumlah sampel hingga < 1 g

Bagaimana mekanisme kerja TEA mencegah tailing ?

56 HPLC-2011

Tailing Senyawa Basa

Pada RP-HPLC, residu silanol [ Si-OH ] dalam

kolom yang bersifat asam, akan berikatan kuat

dengan senyawa basa [ R-NH₂ ] yang melewati

kolom tersebut.

Agar tidak terjadi tailing, ditambahkan amin modifier ke dalam campuran fase gerak, misal:

trietilamin [ TEA ].

TEA akan me-masking residu Si-OH, sehingga

saat senyawa basa melewati kolom tidak terjadi ikatan yang terlalu kuat, hingga akhirnya dapat

57 HPLC-2011

Penggunaan TEA

Perhatikan jumlahnya, jangan terlalu banyak.

Bila terlalu banyak akan menghilangkan fungsi residu silanol pada kolom RP-18.

Untuk hal tersebut, lakukan optimasi !

Perhatikan:

pencucian kolom sesudah digunakan pemisahan dengan

Possible cause: Possible solution:

Overloading of column Dilute sample 1:10 and rerun

Retention time too long Modify gradient so that peaks elute earlier

Extra-column volume too large

Reduce tubing diameters and lengths where possible, particularly post-column

"Dead" volume Check all connections for proper fit

Detector time too slow Increase detector Hz rate

Possible cause: Possible solution:

Overloading of column Dilute sample 1:10 and rerun or use a higher capacity column

Sample volume too large Inject less than 1/6 of the column volume, or increase sample concentration

Dead volume in flow path Check all fittings, in particular post-column and at the column head

Problems internal to column Run high organic through column, equilibrate and retry, or replace column

Clogged sample filter Replace filter

Kromatografi Adsorpsi

• _{Pemisahan menggunakan fase normal} • _{Sering terjadi tailing}

• _{Fase gerak dimodif dengan penambahan}

pelarut polar (air, metanol, etanol)

Kromatografi Partisi

• _{Pemisahan menggunakan fase terbalik} • _{Pemisahan dilakukan untuk senyawa2 yg}

bersifat asam lemah atau basa lemah

• _{Fase gerak harus dijaga pH-nya dengan buffer}

Kromatografi Penukar Ion

• _{Fase diam dapat menukar kation atau anion}

dg fase gerak

• Fase gerak mengandung air untuk proses ionisasi

• Retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak

Kromatografi Eksklusi Ukuran

• _{Prinsip pemisahan berdasarkan ukuran}

molekul fase gerak

• Digunakan untuk memisahkan senyawa dg BM>2000 dalton

• Fase diam berupa silika atau polimer yg bersifat porus