7
DETEKSI KERAGAMAN IN VITRO PLANLET LILI (Lilium, L) HASIL MUTASI DENGAN ISOZIMAbstrak
Keragaman genetik tanaman hasil mutasi dapat dibedakan menggunakan penanda isozim. Tujuan penelitian ini ialah mendapatkan hasil analisis yang polimorfik planlet hasil induksi mutasi dengan menggunakan isozim. Penelitian menggunakan 4 macam enzim yaitu AAT (Aspartate aminotransferase), ACP (Acid phosphatase), EST (Esterase) dan PRX (Peroxidase). Bahan yang dianalisis berupa daun planlet lili cv. Sorbon hasil iradiasi sinar Gamma, daun planlet lili cv. Purple Maroon(PM) dan Frutty Pink(FP) hasil mutasi induksi mutagen kimia EMS. Hasil analisis isozim menunjukkan bahwa keempat enzim yang digunakan menghasilkan pola pita yang polimorfik. Enzim AAT menghasilkan satu pola pita untuk lili cv.PM dan FP, serta 4 pola pita untuk lili cv.Sorbon. Enzim ACP menghasilkan 2 polapita untuk lili cv.PM, 4 pola pita lili cv. Sorbon serta 3 pola pita lili cv.FP. Hasil dengan enzim EST, diperoleh 3 pola pita dengan pola yang berbeda pada lili cv. PM, Sorbon dan FP. Enzim PRX menghasilkan 4 pola pita yang berbeda pada lili cv.PM, Sorbon dan FP.
Kata kunci : Isozim, AAT, ACP, EST , PRX. Abstract
Genetic variability were distinguished by isozyme. The objective of this study was to obtain polymorphism of lily planlet which it induced by mutation using isozyme. This study used four enzymes, there were AAT (Aspartate
aminotransferase), ACP (Acid phosphatase), EST (Esterase) and PRX
(Peroxidase). Leaves of lily plantlets cv. Sorbon, Frutty Pink (FP) and Purple Marron (PM) were used as materials. All of lily cultivars were induced by mutagent. Polymorphism were obtained from four enzymes. AAT enzyme produced 1 polymorphic band for lily cv. PM and FP, 4 polymorphic bands for lily cv. Sorbon. ACP enzyme was produced 2 polymorphic bands for lily cv. PM, 4 polimorphic bands for lily cv. Sorbon and 3 polymorphic bands for lily cv. FP. The different polymorphic bands were achieved by EST enzyme for lily cv. PM, Sorbon and FP, each cultivar had 3 polymorphic bands. PRX enzyme showed 4 polymorphic bands for lily cv. PM, Sorbon and FP.
Key words : Isozyme, AAT, ACP, EST, PRX. Pendahuluan
Keragaman genetik suatu populasi atau sifat- sifat tertentu tanaman dapat diamati secara morfologi maupu n secara molekuler. Polimorfisme sifat morfologi tanaman antara lain warna bunga, warna biji, bentuk biji, bentuk daun, warna daun dan karakter lain yang secara visual mudah dilihat. Penanda morfologi ini memiliki keterbatasan yaitu dipengaruhi lingkungan. Pada tanaman tahunan, penanda morfologi juga kurang menguntungkan karena sifat morfologi seperti bunga, buah dan biji baru dapat diamati setelah tanaman berbunga dan berbuah yang memerlukan waktu cukup lama. Salah satu penanda lain yang dapat digunakan untuk membedakan adanya keragaman ialah isozim atau isoenzim (Hartana 2003).
Isozim merupakan enzim- enzim yang mempunyai molekul kimia yang berbeda, namun mengkatalisis reaksi kimia yang sama. Polimorfisme isozim berupa molekul- molekul protein berbeda, fenotipenya ditunjukkan dalam bentuk pita- pita dan pola pita yang berbeda. Polimorfisme ini diperoleh melalui gel elektroforesis dengan pewarnaan dengan pewarna specifik untuk setiap enzim. Kegunaan isozim antara lain (1) untuk mengetahui keragaman genetik didalam maupun antar populasi tanaman, (2) penanda hasil persilangan atau mutasi, (3) penanda sifat ketahanan atau kerentanan tanaman terhadap penyakit dalam program seleksi (Hartana 2003). Analisis isozim ini juga digunakan untuk membedakan keragaman hasil hibridisasi interspecifik antara Lilium nobilissimum dan L.regale dengan menggunakan enzim esterase (EST), acid phosphatase (ACP), glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6-PDH), malate dehydrogenase (MDH), dan peroxidase (PRX) (Obata et al. 2000).
Bahan dan Metode
Analisis keragaman planlet lili hasil mutasi induksi dilakukan di laboratorium Biologi Pusat Studi Ilmu Hayati IPB Bogor pada bulan November 2012. Analisis isozim dilakukan dengan 4 macam enzim yaitu AAT (Aspartate
aminotransferase), ACP (Acid phosphatase), EST (Esterase) dan PRX
(Peroxidase). Bahan yang digunakan ialah daun planlet lili hasil mutasi induksi yang terdiri atas 3 varietas lili yaitu lili oriental cv. Frutty Pink, Sorbon dan lili asiatik cv. Purple Maroon. Bahan untuk analisis isozim diantaranya buffer elektroda, buffer gel, pewarna serta pati untuk elekroforesis. Alat yang digunakan meliputi cawan petri dan penumbuknya, alat elektroforesis, gel mold tray, pemotong gel dan bak pewarnaan serta kamera.
Tahapan analisis isozim terdiri pengambilan sampel tanaman, pembuatan buffer pengestrak, pembuatan buffer gel dan elektrode, pembuatan gel pati, ekstrasi enzim, elektroforesis, pembuatan larutan pewarna, pencucian dan fiksasi serta dokumentasi dan interpretasi pola pita. Metode analisis berdasarkan metode “Soltis dan Soltis” (1989).
Hasil dan Pembahasan
Planlet lili hasil mutasi induksi dengan EMS (Ethylmethanosulfonate) dan irradiasi sinar Gamma menunjukkan hasil yang beragam. Keragaman ini ditunjukkan dengan polimorfisme pola pita hasil analisis isozim dengan
menggunakan 4 macam enzim yaitu AAT (Gambar 7.1), ACP (Gambar 7.2), EST (Gambar 7.3) dan PRX (Gambar 7.4).
Gambar 7.1 menunjukkan bahwa planlet lili asiatik cv. Purple Maroon memiliki 1 pola pita. Planlet lili kontrol dengan planlet lili yang diinduksi dengan EMS 0.1, 0.2, 0.3 dan 0.5 ml/l tidak menunjukkan adanya pola pita yang polimorfik, namun polimorfik pada planlet lili yang diinduksi EMS 0.4 ml/l. Planlet kontrol dan hasil mutasi dengan EMS 0.1, 0.2, 0.3, 0.5 ml/l tidak menghasilkan pola pita dengan enzim AAT, namun planlet hasil mutasi EMS dengan 0.4 ml/l menghasilkan 1 pola pita. Hasil ini menunjukkan bahwa planlet yang diinduksi EMS 0.4 ml/l berbeda dan terdapat polimosfisme pada analisis isozim menggunakan enzim AAT .
Hasil analisis isozim planlet lili oriental cv. Frutty Pink menggunakan enzim AAT menghasilkan 1 pola pita. Planlet lili yang tidak diinduksi dengan EMS menghasilkan 2 pita, sedangkan planlet hasil induksi EMS tidak menghasilkan pita (Gambar 7.1). Hasil ini menunjukkan adanya keragaman antara planlet lili yang diinduksi EMS dengan planlet lili yang tidak diinduksi EMS. Perbedaan konsentrasi EMS pada kalus lili Oriental cv. Frutty Pink tidak berpengaruh dalam menginduksi keragaman.
Analisis isozim dengan enzim AAT pada planlet lili Oriental cv. Sorbon hasil induksi sinar Gamma menunjukkan adanya keragaman dan menghasilkan 4 pola pita. Pola pita 1 terdiri atas 2 pita, pola pita 2 terdiri 1 pita, pola pita 3 terdapat 4 pita serta pola pita 4 terdiri 1 pita (Gambar 7.1). Dosis irradiasi 30 Gray dan 50 Gray menghasilkan pola pita yang sama. Perlakuan dosis tersebut memiliki pola pita yang berbeda dengan perlakuan dosis irradiasi 10 Gray, 20 Gray dan planlet yang tidak diiradiasi. Hasil ini menunjukkan bahwa keragaman dapat ditingkatkan melalui iradiasi sinar Gamma.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Pola Pita Planlet Lili Hasil Mutasi Induksi
AAT
Gambar 7.1 Profil pola pita planlet lili hasil induksi mutasi dengan analisis isozim menggunakan enzim AAT.
Keterangan:
1.PM- Kontrol 8.SB-Kontrol 15.FP-Kontrol 2.PM- EMS 0.1 ml/l 9.SB-10 Gy 16.FP-EMS 0.1 ml/l 3.PM-EMS 0.2 ml/l 10.SB-20 Gy 17.FP-EMS 0.2 ml/l 4.PM-EMS 0.3 ml/l 11.SB-30 Gy 18.FP-EMS 0.3 ml/l 5.PM-EMS 0.4 ml/l 12.SB-40 Gy 19.FP-EMS 0.4 ml/l 6.PM-EMS 0.5 ml/l 13.SB-50 Gy 20.FP-EMS 0.5 ml/l 7.PM-10 Gy 14.FP-10 Gy
Analisis isozim dengan enzim ACP menunjukkan adanya polimorfisme pada lili yang diinduksi mutasi baik dengan EMS maupun iradiasi sinar Gamma (Gambar 7.2). Polimorfisme hasil analisis isozim dengan enzim ACP planlet lili asiatik cv. Purple Maroon menghasilkan 2 pola pita, yaitu pola pita 1 dengan 1 pita dan pola pita kedua dengan 3 pita ( Gambar 7.2). Planlet lili Asiatik cv. Purple Maroon yang dinduksi mutasi dengan EMS 0.5 ml/l berbeda dengan planlet yang dinduksi dengan EMS 0.1, 0.2, 0.3 dan 0.4 ml/l. Planlet lili dengan induksi EMS 0.5 ml/l memiliki 3 pita yaitu pola pita kedua, sedangkan planlet dengan EMS 0.1, 0.2, 0.3 dan 0.4 ml/l menghasilkan 1 pita yaitu pola pita pertama.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Pola Pita Planlet Lili Hasil Mutasi Induksi
ACP
Gambar 7.2 Profil pola pita planlet lili hasil mutasi induksi dengan analisis isozim menggunakan enzim ACP.
Keterangan:
1.PM- Kontrol 8.SB-Kontrol 15.FP-Kontrol 2.PM-EMS 0.1 ml/l 9.SB-10 Gy 16.FP-EMS 0.1 ml/l 3.PM-EMS 0.2 ml/l 10.SB-20 Gy 17.FP-EMS 0.2 ml/l 4.PM-EMS 0.3 ml/i 11.SB-30 Gy 18.FP-EMS 0.3 ml/l 5.PM-EMS 0.4 ml/l 12.SB-40 Gy 19.FP-EMS 0.4 ml/l 6.PM-EMS 0.5 ml/l 13.SB-50 Gy 20.FP-EMS 0.5 ml/l
7.PM-10 Gy 14.FP-10 Gy
Planlet lili oriental cv. Frutty Pink yang diinduksi dengan EMS menghasilkan keragaman. Keragaman ini ditunjukkan dengan adanya polimorfisme pada hasil analisis isozim dengan enzim ACP. Hasil analisis menunjukkan adanya 4 pola pita ( Gambar 7.2). Pola pita 1 terdapat 1 pita, pola pita 2 terdapat 2 pita, pola pita 3 terdiri 1 pola pita dan pola pita 4 tidak menghasilkan pita. Planlet yang tidak diinduksi mutasi berbeda dengan perlakuan mutasi induksi EMS, dengan menghasilkan 1 pita yaitu pola pita pertama. Planlet yang diinduksi EMS 0.1 ml/l menghasilkan 2 pita yaitu pola pita kedua, planlet yang diinduksi EMS 0.2, 0.4 dan 0.5 ml/l tidak menghasilkan pola pita (pola pita 4) sedangkan planlet dengan induksi EMS 0.3 ml/l menghasilkan 1 pita yaitu pola pita ketiga.
Planlet lili oriental cv. Sorbon hasil mutasi induksi dengan sinar Gamma menunjukkan keragaman berdasarkan analisis isozim dengan enzim ACP dengan 5 pola pita (Gambar 7.2). Pola pita pertama pada planlet yang tidak diiradiasi tidak menghasilkan pita, sedangkan planlet yang diiradiasi dengan 10 Gray menghasilkan 1 pita yaitu pola pita kedua, hasil irradiasi 20 Gray menghasilkan 2 pita yaitu pola pita ketiga. Planlet hasil mutasi induksi dengan irradiasi sinar Gamma 30 Gray menghasilkan 4 pita yaitu pola pita keempat serta hasil induksi 40 gray sama dengan 50 Gray dengan menghasilkan 3 pita yaitu pola pita kelima. Hasil ini berbeda dengan penelitian sebelumnya (Obata et al. 2000) bahwa enzim ACP yang digunakan dalam analisis isozim pada Lilium nobilissimum dan L.
regale tidak menghasilkan zymogram yang jelas.
Analisis isozim planlet lili hasil induksi mutasi menggunakan enzim EST menghasilkan pola pita yang polimorfik (Gambar 7.3). Planlet lili Asiatik cv. Purple Maroon menghasilkan 3 pola pita yaitu pola 1 terdiri atas 2 pita, pola pita 2 dengan 1 pita, pola pita 3 dengan 2 pita dan planlet yang tidak diinduksi mutasi tidak menghasilkan pita (Gambar 7.3). Planlet lili yang berasal dari kalus dengan induksi dengan EMS 0.1 dan 0.3 ml/l, menghasilkan jumlah pita yang sama yaitu pola pita pertama. Perlakuan EMS 0.2 dan 0.4 ml/l menghasilkan jumlah pita 1 yaitu pola pita kedua, sedangkan planlet lili hasil induksi EMS 0.5 ml/l menghasilkan 2 pita yaitu pola pita ketiga. Hasil ini menunjukkan bahwa perlakuan EMS dapat meningkatkan keragaman, yang dibuktikan dengan adanya perbedaan jumlah pita dan pola pitanya.
Hasil analisis isozim pada planlet lili oriental cv. Frutty Pink menunjukkan hasil yang polimorfik dengan menghasilkan 3 pola pita (Gambar 7.3). Pola pita 1 terdiri atas 1 pita, pola pita 2 dengan 2 pita dan pola pita 3 dengan 2 pita. Perlakuan mutasi induksi dengan EMS 0.2, 0.3, 0.4 ml/l dan planlet tanpa induksi EMS menghasilkan pola pita yang sama yaitu pola pita pertama. Perlakuan mutasi
induksi dengan EMS 0.1 ml/l menghasilkan 2 pita yaitu pola pita kedua, serta EMS 0.5 ml/l menghasilkan 2 pita yaitu pola pita ketiga
Gambar 7.3. Profil pola pita planlet lili hasil mutasi induksi dengan analisis isozim menggunakan enzim EST .
Keterangan:
1.PM- Kontrol 8.SB-Kontrol 15.FP-Kontrol
2.PM-EMS 0.1 ml/l 9.SB-10 Gy 16.FP-EMS 0.1 ml/l 3.PM-EMS 0.2 ml/l 10.SB-20 Gy 17.FP-EMS 0.2 ml/l 4.PM-EMS 0.3 ml/l 11.SB-30 Gy 18.FP-EMS 0.3 ml/l 5.PM-EMS 0.4 ml/l 12.SB-40 Gy 19.FP-EMS 0.4 ml/l 6.PM-EMS 0.5 ml/l 13.SB-50 Gy 20.FP-EMS 0.5 ml/l 7.PM-10 Gy 14.FP-10 Gy
Polimorfisme juga diperoleh pada planlet lili Oriental cv.”Sorbon” hasil induksi mutasi dengan sinar Gamma (Gambar 7.3). Polimorfik ditunjukkan dengan adanya 3 pola pita, yaitu pola pita 1 dengan 1 pita pada planlet yang tidak diiradiasi, planlet hasil iradiasi 40 Gy dan 50 Gy. Planlet hasil iradiasi sinar Gamma 10 Gy menghasilkan 2 pita pada pola pita kedua serta planlet dengan irradiasi 20 Gy dan 30 gy menghasilkan jumlah pita yang sama yaitu 2 pita pada pola pita ketiga. Hasil ini sejalan dengan penelitian Obata et al. 2000 bahwa dengan enzim EST menunjukkan zymogram yang cukup jelas berbeda dan tanaman hibrid mempunyai pita yang dimiliki kedua tetuanya Lilium
nobilissimum dan L.regale.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Pola Pita Planlet Lili Hasil Mutasi Induksi
EST
Gambar 7.4. Profil pola pita planlet lili hasil mutasi induksi dengan analisis isozim menggunakan enzim PRX.
Keterangan:
1.PM- Kontrol 8.SB-Kontrol 15.FP-Kontrol 2.PM-EMS 0.1 ml/l 9.SB-10 Gy 16.FP-EMS 0.1 ml/l 3.PM-EMS 0.2 ml/l 10.SB-20 Gy 17.FP-EMS 0.2 ml/l 4.PM-EMS 0.3 ml/l 11.SB-30 Gy 18.FP-EMS 0.3 ml/l 5.PM-EMS 0.4 ml/l 12.SB-40 Gy 19.FP-EMS 0.4 ml/l 6.PM-EMS 0.5 ml/ 13.SB-50 Gy 20.FP-EMS 0.5 ml/l 7.PM-10 Gy 14.FP-10 Gy
Analisis isozim dengan enzim PRX pada planlet lili Asiatik cv. Purple Maroon induksi EMS menunjukkan hasil yang polimorfik dengan 3 pola pita (Gambar 7.4) . Pola pita pertama terdiri atas 2 pita pada planlet yang tidak diinduksi dengan EMS dan planlet yang diinduksi dengan EMS 0.1ml/l. Planlet dengan induksi EMS 0.2, 0.3 dan 0.4 ml/l menunjukkan pola pita yang sama yaitu pola pita kedua dengan 2 pita sedangkan induksi EMS 0.5 ml/l menghasilkan 1 pita pada pola pita ketiga.
Analisis isozim dengan menggunakan enzim PRX pada planlet lili oriental cv Frutty Pink yang diinduksi dengan EMS menunjukkan hasil yang polimorfik (Gambar 7.4). Jumlah pola pita yang dihasilkan ada 3 pola yaitu pola pita pertama dengan 2 pita, pada planlet yang tidak diinduksi EMS dan planlet yang diinduksi EMS 0.1, 0.4 dan 0.5 ml/l. Pola pita kedua dengan 3 pita pada planlet lili dengan induksi EMS 0.2 ml/l. Pola pita ketiga dengan 4 pita diperoleh pada planlet dengan induksi EMS 0.3 ml/l.
Hasil analisis isozim planlet lili oriental cv. Sorbon dengan enzim PRX menunjukkan pola pita yang polimorfik (Gambar 7.4). Enzim PRX menghasilkan
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
Pola Pita Planlet Lili Hasil Mutasi induksi
PRX
3 pola pita. Pola pita pertama terdiri atas 2 pita pada planlet yang tidak diiradiasi, irradiasi 20 dan 30 Gy. Pola pita kedua terdiri dari 3 pita pada planlet yang diiradiasi 10 dan 50 Gy. Pola pita ketiga terdiri dari 2 pita yaitu planlet yang diiradiasi sinar Gamma 40 Gy. Penelitian Obata et al. 2000, menunjukkan hasil yang berbeda, enzim PRX yang digunakan dalam analisis keragaman Lilium
nobilissimum dan L.regale tidak menghasilkan zymogram yang jelas.
Gambar 7.5. Dendogram planlet lili hasil induksi mutasi.
Berdasarkan hasil analisis isozim di lakukan pengelompokan dengan dendrogram. Hasil menunjukkan bahwa planlet lili cv.Sorbon hasil iradiasi 20 Gy dan 40 Gy terdapat pada kelompok yang sama, dengan tingkat kesamaan 75%, sedangkan planlet kontrol, 10 Gy, 30 Gy dan 50 Gy berada pada kelompok yang berbeda. Planlet lili Oriental cv. Frutty Pink hasil induksi EMS 0.4 dan 0.5 ml/l berada pada kelompok yang sama dengan lili Asiatik cv. Purple Maroon hasil induksi EMS 0.2 ml/l dan 0.3 ml/l dengan tingkat kesamaan 95%.
Simpulan
1. Polimorfisme hasil analisis isozim dapat digunakan sebagai penanda adanya keragaman pada tanaman hasil induksi mutasi.
2. Pada enzim yang berbeda dihasilkan pola pita yang berbeda. Coefficient 0.50 0.62 0.75 0.87 1.00 W PM-K PP-E4 PP-E5 PP-E2 PM-E1 PM-E2 PM-E3 SB-10Gy PP-E3 PM-E4 PM-10Gy SB-K PM-E5 SB-20Gy SB-40Gy PP-E1 PP-K SB-30Gy PP-10Gy SB-50Gy
