BAB V PEMBAHASAN
Pada praktikum isolasi protein, organ yang digunakan adalah insang dari ikan mas (Cyprinus carpio). Pada isolasi protein dikenal adanya dua prinsip yaitu homogenisasi dan fraksinasi. Homogenisasi merupakan pengeluaran protein dari organ serta pencampuran reagen dengan organ target. Fraksinasi dilakukan melalui sentrifugasi, yaitu pemisahan protein dari membran dan organel lain berdasarkan berat molekulnya. Menurut Fatchiyah, dkk (2012), untuk menganalisa protein yang ada di dalam sel diperlukan prosedur fraksinasi sel yaitu (1) memisahkan sel dari jaringannya, (2) menghancurkan membran sel untuk mengambil kandungan sitoplasma dan organelnya serta (3) memisahkan organel-organel dan molekul penyusunnya. Prosedur (1) dan (2) dinamakan homogenasi dapat dilakukan dengan menggunakan alat yang paling sederhana seperti homogeniser atau mortal sampai alat yang paling mutakhir seperti pemakaian vibrasi dan sonikasi tergantung pada bahan yang akan dihomogenasi. Prosedur (3) dilakukan dengan menggunakan sentrifus dengan kecepatan dan lama sentrifugasi tertentu. Sebagian besar protein merupakan molekul yang mudah rusak bila tidak berada pada kondisi fisiologisnya. Karena itu, untuk mempertahankan struktur dan fungsi protein, fraksinasi dilakukan pada suhu rendah (0-4°C) dalam buffer dan pH tertentu (tergantung dari jenis protein yang akan dianalisa).
Pada tahapan isolasi protein, organ insang ikan mas (Cyprinus carpio) ditimbang sebanyak 0,5 gram dengan menggunakan neraca analitik dan dicuci tiga kali dengan PBS (Phosphat Buffer Saline). Menurut Michael, et al (2016), fungsi PBS (Phosphat Buffer Saline) ialah untuk pengenceran, mencuci suspensi sel, pembilasan, serta bahan aditif untuk media kultur sel. 1 liter PBS mengandung NaCl, Na2H2PO4, NaH2PO4, dan aquades (Mohan, 2003). PBS ini juga digunakan untuk membantu penghalusan sampel, sebagai ringer, buffer, dan mencegah sel-sel pecah akibat tekanan osmosis (Martin, et al, 2006). Hal yang perlu diperhatikan dalam proses penghalusan sampel adalah penghalusan sampel tidak boleh terlalu lama agar protein tidak rusak. Selanjutnya dilakukan penambahan PBS Tween – PMSF. Tween merupakan bahan yang bersifat seperti detergen. PBS
Tween dicampur dengan PMSF (Phenyl Methyl Sulfonyl Flouride) dengan perbandingan 9:1. PMSF terbuat dari Tris Base, EDTA, NaCl, PMSF dan NP40. PMSF bekerja sebagai inhibitor protease, dalam hal ini PMSF menghambat kerja enzim protease agar tidak melisiskan protein (Yulianti, 2006). Sampel kemudian dipipet dan dimasukkan ke tabung Eppendorf 1,5 ml agar lebih mudah dalam pengukuran. Setelah itu, sampel disonifikasi dengan sonikator selama 10 menit. Sonifikasi merupakan proses pemecahan membran dengan bantuan gelombang ultrasonik (Mohan, 2003), dan sonifikasi ini dilakukan dengan alat sonikator.
Tahapan selanjutnya adalah sampel disentrifus dengan kecepatan 6000 rpm selama 15 menit pada suhu 4°C. Proses sentrifus dilakukan pada suhu ini agar protein tidak terdenaturasi. Fatchiyah, dkk (2012) juga menjelaskan bahwa untuk mempertahankan struktur dan fungsi protein, fraksinasi dilakukan pada suhu rendah (0-4°C). Pada proses sentrifus pertama ini yang diambil adalah supernatannya karena berat molekul debris sel lebih berat daripada protein sehingga debris sel akan mengendap dibawah dan protein akan berada di bagian atas. Supernatan yang telah diambil dimasukkan ke Eppendorf baru dan diukur volumenya untuk selanjutnya ditambahkan dengan ethanol PA dengan perbandingan 1:1. Penambahan Ethanol PA berfungsi untuk tahapan presipitasi (Fatchiyah, dkk, 2012). Setelah ditambahkan Ethanol PA sampel kemudian divortex agar homogen dan didiamkan di freezer selama 24 jam supaya etanol bisa terpresipitasi dengan sempurna.
Setelah diinkubasi di freezer selama 24 jam, sampel kembali disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4°C selama 15 menit dan kemudian etanol dibuang lalu sampel dibiarkan dalam keadaan terbuka di kulkas. Sampel kemudian ditutup dengan aluminium foil dan dimasukkan ke dalam kulkas (4°C selama 24 jam). Setelah 24 jam, sampel dikeluarkan dari kulkas dan ditambahkan dengan Tris-HCl pH 6,8. Menurut Rawat, et al (2016), Tris HCl berfungsi untuk menjaga pH protein. Setelah ditambahkan Tris-HCl, sampel dikocok sampai tercampur dan disimpan dalam freezer. Sampai pada tahapan ini, yang didapat adalah berupa supernatan dalam tabung.
Tahapan selanjutnya setelah didapatkan crude protein adalah analisis kualitatif dan kuantitatif dari crude protein tersebut. Analisis kuantitatif dilakukan dengan menggunakan nanodrop spektrofotometer. Nanodrop spektrofotometer merupakan alat untuk mengukur kuantitas hasil isolasi DNA, RNA, dan protein serta kontaminasi sampel. Spektrofotometer terdiri dari spektrometer di bagian atas dan fotometer di bagian bawah. Prinsip kerjanya adalah spektrometer akan menembak sinar yang selanjutnya akan diserap oleh bahan dan diukur oleh fotometer. Sinar yang diserap oleh protein adalah sinar dengan panjang gelombang 280 nm. Dari hasil pengukuran menggunakan nanodrop spektrofotometer, diketahui bahwa konsentrasi protein pada organ insang ikan mas (Cyprinus carpio) adalah sebesar 16,891 mg/ml, 22,690 mg/ml, 13,285 mg/ml, dan 13,456 mg/ml. Konsentrasi protein dalam organ insang ini tergolong lebih tinggi dibandingkan dengan organ-organ ikan mas yang lain seperti otot, ginjal, lambung dan usus.
Pengujian crude protein secara kualitatif dilakukan dengan menggunakan elektroforesis SDS-PAGE (Sodium Dodesil Sulfat – Polyacrylamide Gel Electrophoresis). Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik, atau bisa diartikan sebagai suatu metode untuk memisahkan molekul (Protein atau DNA berdasarkan berat molekulnya menggunakan medium listrik. Protein nantinya bergerak dari muatan negatif ke positif. Elektroforesis SDS-PAGE hanya melihat pita protein untuk selanjutnya diketahui berat molekulnya (Mayangsari, 2012). Dalam elektroforesis SDS-PAGE, digunakan dua macam gel yaitu separating gel 12,5% yang berfungsi menahan protein supaya tetap berada di sumuran sebelum dilakukan elektroforesis dan stacking gel 3% yang berfungsi memisahkan protein berdasarkan berat molekul. Bahan-bahan separating gel 12,5% diantaranya Akrilamide-Bis 30%, Tris-Cl 1,5 M pH 8,8, dH2O, SDS (Sodium Dodesil Sulfat) 10%, APS (Ammonium Persulfate) 10% dan TEMED (Tetramethylethyl diamine). Bahan untuk stacking gel 3% sama dengan bahan untuk separating gel 12,5%, hanya saja Tris-Cl yang digunakan adalah 0,5M dengan pH 8,8.
Bahan-bahan untuk membuat stacking gel maupun separating gel sebagian besar memiliki fungsi yang sama. Akrilamide-Bis 30% berfungsi sebagai bahan utama pembuat gel dan bahan ini tersusun dari Akrilamide dan bis-Akrilamide. Tris-Cl berfungsi sebagai buffer. dH20 berfungsi sebagai campuran bahan gel. SDS 10% berfungsi menguraikan ikatan disulfida dalam protein. APS dan TEMED berfungsi membentuk radikal bebas yang membantu polimerisasi akrilamid Bis 30% (membentuk ikatan polimer). Hal yang perlu diperhatikan adalah APS 10% dan TEMED harus dimasukkan secara bersamaan lalu diaduk.
Tahapan selanjutnya adalah running elektroforesis, dan alat yang digunakan adalah chamber elektroforesis. Larutan Running Buffer yang terdiri dari glisin (sebagai penghantar listrik), Tris Base (sebagai buffer),SDS, dan aquades diatur dalam pH 8,8 (dikondisikan sesuai kisaran pH protein yaitu 6,5-8,5) dan dituangkan ke dalam chamber elektroforesis. Selanjutnya RSB (Reducing Sample Buffer) dicampurkan dengan sampel (perbandingan 1:1) di dalam tabung eppendorf untuk kemudian dididihkan selama 5 menit pada suhu 100°C agar bisa ereaksi dengan sempurna. Isolat yang telah tercampur dengan RSB dimasukkan ke dalam sumuran gel. Reducing Sample Buffer (RSB) berfungsi untuk disosiasi protein dan tersusun dari 0,3 M Tris HCl pH 6,8 (sebagai buffer), Gliserol 25% (menambah berat molekul protein supaya tidak mengambang di gel, SDS 10% (menguraikan ikatan disulfida dan menyamakan muatan protein menjadi muatan negatif, β-mercaptoetanol (bekerja sinergis dengan SDS 10% untuk merusak ikatan disulfida, dan Bromophenol Blue (sebagai Tracking Dye dan pewarna yang berikatan dengan protein dan menjadi pewarna pita protein. Selanjutnya marker protein dimasukkan dalam salah satu sumuran. Set alat elektroforesis kemudian di set dengan voltase 130V, kuat arus 60mA, dan waktu 90 menit dan dilakukan elektroforesis hingga tracking dye 0,5 cm diatas dasar.
Setelah elektroforesis selesai, gel hasil elektroforesis diletakkan di wadah plastik dan diberi larutan staining hingga terendam untuk selanjutnya di shaker dengan shaking rotary selama 30 menit lalu larutan staining dibuang. Bahan untuk staining adalah Methanol absolut (untuk mengendapkan protein), CBB (Coomasie
Brilliant Blue) sebagai bahan pewarna utama gel dan CBB akan berikatan dengan pita protein yang ada, serta asam asetat glasial (membantu kerja CBB). Tahap selanjutnya adalah destaining I selama 15 menit dan destaining II selama overnight. Bahan larutan destaining sama dengan larutan staining hanya saja tidak mengandung CBB.
Tahapan selanjutnya adalah penghitungan berat molekul protein. Pada organ insang, tidak dapat dilakukan penghitungan berat molekul protein karena pita protein tidak dapat teramati dengan jelas pada gel. Hal ini disebabkan proses elektroforesis yang terlalu lama. Karena tidak bisa dilakukan perhitungan berat molekul protein untuk insang, makan dilakukan perhitungan berat molekul protein untuk organ lain yaitu usus. Elektroforesis dengan kondisi protein yang sudah terdisosiasi dapat dipakai untuk memperkirakan berat molekul suatu protein. Berat molekul tersebut dapat ditentukan dengan mengukur mobilitas molekul protein dalam gel poliakrilamid (yang mengandung SDS) berdasarkan kurva standar berat molekul dari protein standart. Protein standar yang diketahui berat molekulnya dapat dielektroforesis dan mobilitasnya pada gel poliakrilamid dapat diukur. Mobilitas rate (Mr atau Rf) diukur dengan memakai rumus berikut (Fatchiyah, dkk, 2012).
Perhitungan berat molekul protein dilakukan dengan bantuan program Microsoft Excel dan SPSS 16.0. Dari hasil perhitungan berat molekul protein, diketahui bahwa berat molekul protein dari sampel usus ikan mas (Cyprinus carpio), adalah sebesar 138,32 kDa, 116,36 kDa, 97,88 kDa, 92,40 kDa, 77,73 kDa, 61,73 kDa, 58,27 kDa, 51,92 kDa, 43,69 kDa, 34,69 kDa, 32,75 kDa, 26 kDa,18,40 kDa, 14,62 kDa, 13,02 kDa, dan 8,7 kDa dari total 16 pita protein yang terbentuk. Berbagai jenis protein pada suatu sampel akan terpisah-pisah pada gel poliakrilamid yang tergantung pada mobilitasnya, dengan demikian pada jalur pergerakan protein akan didapatkan jajaran protein yang disebut sebagai pita protein yang akan memisah berdasar ukuran BM protein (Gunanti, 2010).Pada
penelitian Gunanti (2010) menjelaskan bahwa tebal dan tipisnya pita protein pada hasil SDS-PAGE disebabkan karena terdapat perbedaan secara genetik antara protein tersebut. Tebal dan tipisnya pita-pita protein pada gel yang berisi sampel serum juga dapat dikarenakan perbedaan konsentrasi protein dalam sampel.
Kesulitan atau kendala yang dihadapi selama praktikum diantaranya adalah kesulitan memperkirakan batas gel dan membuat sumuran yang baik (yang tidak terlalu dangkal), serta terlalu lama ketika elektroforesis sehingga pita proein tidak bisa teramati di gel yang mengakibatkan berat molekul protein tidak bisa dianalisis. Solusi yang bisa dilakukan diantaranya berhati-hati dan teliti dalam memperkirakan batas gel dan membuat sumuran sehingga sumuran yang dihasilkan tidak terlalu dangkal serta lebih memperhatikan waktu untuk tahapan elektroforesis dengan benar, agar nantinya tidak terlalu lama sehingga mengakibatkan pita proein tidak bisa teramati di gel dan mengakibatkan berat molekul protein tidak bisa dianalisis
BAB VI SIMPULAN
1. Pada isolasi protein dikenal adanya dua prinsip yaitu homogenisasi dan fraksinasi. Homogenisasi merupakan pengeluaran protein dari organ serta pencampuran reagen dengan organ target. Fraksinasi dilakukan melalui sentrifugasi, yaitu pemisahan protein dari membran dan organel lain berdasarkan berat molekulnya.
2. Elektroforesis adalah teknik pemisahan molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik, atau bisa diartikan sebagai suatu metode untuk memisahkan molekul (Protein atau DNA berdasarkan berat molekulnya menggunakan medium listrik. Protein nantinya bergerak dari muatan negatif ke positif. Elektroforesis SDS-PAGE hanya melihat pita protein untuk selanjutnya diketahui berat molekulnya.
3. Berat molekul protein dari sampel usus ikan mas (Cyprinus carpio), adalah sebesar 138,32 kDa, 116,36 kDa, 97,88 kDa, 92,40 kDa, 77,73 kDa, 61,73 kDa, 58,27 kDa, 51,92 kDa, 43,69 kDa, 34,69 kDa, 32,75 kDa, 26 kDa,18,40 kDa, 14,62 kDa, 13,02 kDa, dan 8,7 kDa dari total 16 pita protein yang terbentuk.
Daftar Rujukan
Fatchiyah, Sri, W., Estri, L.A. & Sofi, P. 2012. Buku Analisis Teknik Analisis Biologi Molekuler. Malang: Jurusan Biologi Universitas Brawijaya.
Gunanti, M., Ulia, F., Sri, D. 2010. Karakterisasi protein Larnea cyprinacea dengan metode elektroforesis SDS PAGE. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan, 2(1), 61-66.
Martin, N.C., Pirie, A.A., Ford, L.V., Callaghan, C.L., McTurk, K., Lucy, D & Scrimger, D.G. 2006. The use of phosphate buffered saline for the recovery
of cells and spermatozoa from swabs. Science & Justice, (Online), 46(3);179:184, (www.scienceandjusticejournal.com), diakses 10 Desember 2016.
Mayangsari, Yunika. 2012. Electrophoresis. Yogyakarta: Universitas Gajah Mada. Michael Lichtenauer., MD, Stefanie Nickl., MD, Konrad Hoetzenecker., MD, Andreas Mangold., MD, Bernhard Moser., MD, Matthias Zimmermann., MD, Stefan Hacker., MD, Tina Niederpold., MD, Andreas Mitterbauer., MD & Hendrik Jan. Phosphate Buffered Saline Containing Calcium and Magnesium Elicits Increased Secretion of Interleukin-1 Receptor Antagonist. Journal Of Lab Medicine, (Online), 40(5): 290-293, (http://labmed.oxfordjournals.org/), diakses 10 Desember 2016.
Mohan, Chandra. 20303. Buffers : A Guide For The Preparation And Use Ofbuffers In Biological Systems. Germany: Calbiochem.
Rawat, S., Geeta, J., Annapurna, D., Arunkumar, A.N. & Karaba, N. 2016. Standardization of DNA Extraction Method from Mature Dried Leaves and ISSR-PCR Conditions for Melia dubia Cav. —A Fast Growing Multipurpose Tree Species. American Journal of Plant Sciences, (Online), 7: 437-445, (http://file.scirp.org), diakses 10 Desember 2016.
Yulianti, Evy. 2006. Pengembangan Teknik Isolasi DNA Tumbuhan Menggunakan Detergen Komersial. Dipresentaskan dalam SEMINAR NASIONAL MIPA 2006 dengan tema” Penelitian, Pendidikan, dan Penerapan MIPA serta Peranannya dalam Peningkatan Keprofesionalan Pendidik dan Tenaga Kependidikan” yang diselenggarakan oleh FakultasMatematika dan Ilmu Pengetahuan Alam UNY, Yogyakartapada tanggal 1 Agustus 2006.
Hasil Analisis Nanodrop s
