BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian tentang validasi metode analisis metoprolol dalam plasma manusia secara KLT-Densitometri menggunakan jenis penelitian non-eksperimental yang bersifat deskriptif. Survei deskriptif dapat didefinisikan suatu penelitian yang dilakukan untuk mendeskripsikan atau menggambarkan suatu fenomena yang terjadi di dalam masyarakat (Notoatmojo, 2010).
B. Definisi Variabel Operasional
Tabel 3.1 Definisi Variabel Operasional
Variabel Pengukuran Satuan
Metoprolol dalam plasma Menggunakan KLT-Densitometri Konsentrasi dalam
μg/ml
Kadar/tingkat kadar metoprolol dalam plasma
Menggunakan KLT-Densitometri Konsentrasi dalam μg
C. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan bulan Mei sampai Juli 2017 di Laboratorium Biologi Farmasi Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto.
D. Alat dan Bahan 1. Alat
Densitometer (Camag), chamber (Camag), lampu UV 254 nm (Camag), silica gel 60 F254 spektrofotometer Uv-Vis, (Shimadzu
UVPC-1601); neraca analitik (Shimadzu ATX 224), neraca semimikro, vortex (ika®), sentrifugator (Eppendrof 5418), mikropipet 1-10 µ L (Socorex), mikropipet 10-100 µ L (Socorex), mikropipet 100-1000 µ L (Socorex), pH stick (Merck KG2A), oven (Memert), aerator (Galaxi Co., LTD), lemari
2. Bahan
Standar metoprolol (Sigma-Aldrich, Germany), metanol pro analisis (Merck KG2A), kloroform pro analisis, natrium hidroksida,
amoniak, aquabidest (PT Ikapharmindo Putramas). 3. Kondisi kromatografi
Shareef dkk (2009) meneliti bahwa fase gerak yang digunakan terdiri dari metanol : kloroform : amoniak sebanyak 6:4:0,2 (v/v/v). Analit akan dideteksi pada 282 nm oleh sinar UV. Volume yang ditotolkan sebanyak 10 µl.
E. Cara penelitian
1. Pembuatan larutan standar/baku metoprolol
Metoprolol baku ditimbang dengan seksama 20 mg dan dilarutkan dengan methanol ad 10 ml, sehingga didapatkan volume larutan standar 2000 μg/ml.
2. Optimasi Fase Gerak
Optimasi fase gerak dilakukan dengan cara mencoba-coba perbandingan fase gerak yang berbeda. Optimasi dilakukan dengan cara menotolkan metoprolol baku 2000 µg/ml pada silika gel 60 F254 sebanyak
10 µl. Lalu dielusi menggunakan campuran pelarut kloroform : metanol : amoniak dengan perbandingan yang berbeda-beda yaitu:
4 : 6 : 0,2 v/v 1 : 9 : 0,2 v/v 5 : 5 : 0,2 v/v
3. Pembuatan Fase Gerak
Fase gerak yang digunakan adalah campuran antara metanol, kloroform, dan amonia dengan perbandingan 6:4:0,2 dimasukkan ke dalam chamber yang tertutup rapat dan dikocok hingga tidak ada gelembung di dalamnya.
4. Pembuatan NaOH 0,5 N
5. Penentuan Panjang Gelombang Maksimum
Larutan standar metoprolol yang telah dibuat ditotolkan sebanyak 10 μl pada lempeng KLT yaitu silica gel 60 F254 yang sebelumnya telah
diaktifkan dengan cara dioven selama ± 10 menit dengan suhu 1100 C. Setelah penotolan selesai, lempeng dielusi dengan fase gerak metanol:kloroform:amonia (6:4:0,2) yang telah dijenuhkan. Lalu, setelah elusi selesai lempeng dikeluarkan dari dalam chamber dan dideteksi menggunakan densitometer, sehingga diperoleh panjang gelombang maksimal 282 nm.
6. Pembuatan Kurva Baku
fase diam berupa silica gel 60 F254 ukuran 7×8 cm dengan batas atas 0,5
cm dan batas bawah 1 cm dan diaktifkan dengan cara dioven selama 10 menit dengan suhu 110o C. Larutan yang ada di dalam vial ditotolkan masing-masing sebanyak 10 µ L dengan jarak penotolan masing-masing 1 cm. Setelah penotolan selesai, lempeng KLT dimasukkan ke dalam chamber yang berisi fase gerak metanol:kloroform:amonia (6:4:0,2) yang telah dijenuhkan. Proses elusi diamati, setelah selesai lempeng KLT diangkat dari dalam chamber dan dideteksi menggunakan densitometer. Selanjutnya data luas area dicatat dan dibuat kurva hubungan antara kadar metoprolol dengan luas area.
7. Validasi Metode
Validasi metode adalah suatu proses yang menunjukkan bahwa prosedur analitik telah sesuai dengan penggunaan yang dikehendaki. Validasi dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang dilakukan akurasi, spesifik, reprodusibel, dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Parameter analisis yang ditentukan pada validasi adalah akurasi, presisi, limit deteksi, limit kuantitasi, dan linearitas (Harmita, 2004).
a. Linearitas
Uji linearitas diambil dari kurva baku metoprolol yang sudah diperoleh. Hasil absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menghitung nilai koefisien korelasi (r), slope (kemiringan), dan nilai intersep. Koefisien korelasi yang digunakan sebagai nilai linearitas. Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y = a + bx. Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai b = 0 dan r = +1 atau -1 bergantung pada arah garis (Harmita, 2004).
dibuat adalah 0,5-16 µ g. Langkah pertama yaitu menyiapkan 500 µl plasma, masukkan ke dalam masing-masing 6 tabung dan ditambahkan baku metoprolol 2000 µg/ml masing-masing 25, 50, 100, 200, 400, dan 800 µl. Lalu ditambahkan 500 μl NaOH 0,5 N dan dicek pH masing-masing tabung agar pH berada pada kisaran 12-13 menggunakan pH stick. Kemudian ditambahkan 1000 μl kloroform ke dalam masing-masing tabung, divortex selama 1 menit dan disentrifugasi ± 10 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Setelah selesai disentrifugasi, diambil lapisan kloroform bagian bawah masing-masing tabung dan dimasukkan ke dalam vial. Lapisan atas diekstraksi kembali dengan kloroform sebanyak 1000 µl, divortex selama 1 menit dan disentrifugasi ± 10 menit. Setelah selesai disenrifugasi, lapisan bagian bawah diambil dan digabungkan dengan hasil ekstraksi pertama di dalam vial yang sama. Larutan yang ada di vial diuapkan dengan dialiri udara dari aerator sampai tidak ada larutan yang tersisa di dalam vial. Setelah kering, ditambahkan dengan metanol 500 µl ke dalam masing-masing vial dan divortex selama 1 menit. Fase diam disiapkan berupa silica gel 60 F254 ukuran 7×8 cm dengan batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1
cm dan diaktifkan dengan cara dioven selama 10 menit dengan suhu 110o C. Larutan yang ada di dalam vial ditotolkan sebanyak 10 µ L dengan jarak penotolan masing-masing 1 cm. Lalu dielusi dengan eluen metanol:kloroform:amonia (6:4:0,2) dan dideteksi dengan densitometer.
Perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dilihat pada persamaan di bawah (Harmita, 2004).
1) Batas deteksi
Karena k = 3 atau 10 simpangan baku (sb) = sy/x, maka Q =
2) Batas Kuantitasi
Dimana Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)
k = 3 untuk batas deteksi & 10 untuk batas kuantitasi
Sb = simpangan baku respon analitik dari blangko S1 = arah garis linier (kepekaan arah) dari kurva
antara respon terhadap konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a + bx)
c. Presisi
Pengujian presisi dilakukan dengan mengambil 1 konsentrasi di tengah yaitu 2500 µg/ml. Percobaan diulangi sebanyak 6 kali. Sebanyak 500 μl plasma dimasukkan ke dalam masing-masing 6 tabung dan ditambahkan baku metoprolol 2000 µg/ml masing-masing 625 μl. Lalu ditambahkan 500 μl NaOH 0,5 N dan dicek pH masing-masing tabung agar pH berada pada kisaran 12-13 menggunakan pH stick. Kemudian ditambahkan 1000 μl kloroform ke dalam masing-masing tabung, divortex selama 1 menit dan disentrifugasi ± 10 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Setelah selesai disentrifugasi, diambil lapisan kloroform bagian bawah masing-masing tabung dan dimasukkan ke dalam vial. Lapisan atas diekstraksi kembali dengan kloroform sebanyak 1000 µl, divortex selama 1 menit dan disentrifugasi ± 10 menit. Setelah selesai disenrifugasi, lapisan bagian bawah diambil dan digabungkan dengan hasil ekstraksi pertama di dalam vial yang sama. Larutan yang ada di vial diuapkan dengan dialiri udara dari aerator sampai tidak ada larutan yang tersisa di dalam vial. Setelah kering, ditambahkan dengan metanol 500 µl ke dalam masing-masing vial dan divortex selama 1 menit. Fase diam disiapkan berupa silica gel 60 F254 ukuran 7×8 cm dengan batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1
eluen metanol:kloroform:amonia (6:4:0,2) dan dideteksi dengan densitometer.
Kemudian ditentukan nilai relative standar deviation (RSD). Pada kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya adalah 16% dan pada kadar part per bilion (ppb) adalah 32% (Harmita, 2004).
d. Akurasi
Disiapkan 6 buah tabung untuk melakukan uji akurasi. Sebanyak 500 μl plasma dimasukkan ke dalam masing-masing 6 tabung dan ketiga tabung ditambahkan baku metoprolol 2000 µg/ml sebanyak 625 µl. Lalu ditambahkan 500 μl NaOH 0,5 N dan cek pH masing-masing tabung agar pH berada pada kisaran 12-13 menggunakan pH stick. Kemudian ditambahkan 1000 μl kloroform ke dalam masing-masing tabung, divortex selama 1 menit dan disentrifugasi ± 10 menit dengan kecepatan 8000 rpm. Setelah selesai disentrifugasi, lapisan kloroform bagian bawah masing-masing tabung diambil dan dimasukkan ke dalam vial. Lapisan atas diekstraksi kembali dengan kloroform sebanyak 1000 µl, divortex selama 1 menit dan disentrifugasi ± 10 menit. Setelah selesai disenrifugasi, lapisan bagian bawah masing-masing tabung diambil dan digabungkan dengan hasil ekstraksi pertama di dalam vial yang sama. Larutan yang ada di vial diuapkan dengan dialiri udara dari aerator sampai tidak ada larutan yang tersisa di dalam vial. Setelah kering, ditambahkan dengan metanol 500 µl ke dalam masing-masing vial dan divortex selama 1 menit. Fase diam disiapkan berupa silica gel 60 F254 ukuran 7×8 cm dengan batas atas 0,5 cm
dan batas bawah 1 cm dan diaktifkan dengan cara dioven selama 10 menit dengan suhu 110o C. Larutan yang ada di dalam vial ditotolkan sebanyak 10 µ L dengan jarak penotolan masing-masing 1 cm. Lalu dielusi dengan eluen metanol:kloroform:amonia (6:4:0,2) dan dideteksi dengan densitometer. Masing-masing konsentrasi diulang pekerjaannya sebanyak 3 kali.
Recovery dihitung dengan membandingkan jumlah metoprolol terukur terhadap jumlah metoprolol teoritis. Kriteria penerimaan akurasi untuk suatu metode adalah 80-120% (Harmita, 2004).
f. Selektivitas (Selectivity)
Uji selektivitas dilakukan dengan cara menyiapkan larutan baku metoprolol konsentrasi 2000 µg/ml dan plasma darah manusia. Fase diam disiapkan berupa silica gel 60 F254 ukuran 4×8 cm dengan
batas atas 0,5 cm dan batas bawah 1 cm dan diaktifkan dengan cara dioven selama 10 menit dengan suhu 110o C. Standar metoprolol ditotolkan sebanyak 10 µl, dilanjutkan dengan plasma dan standar metoprolol yang dicampur dengan plasma. Lalu dielusi dengan eluen metanol:kloroform:amonia (6:4:0,2) dan dideteksi dengan densitometer. Diamati puncak metoprolol pada densitogram untuk melihat kemungkinan adanya gangguan dari komponen lain dalam plasma.
F. Analisis Hasil
