10 MATERI DAN METODE
Lokasi dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi Bagian Teknologi Hasil Ternak, Laboratorium Ilmu Produksi Perah, Laboratorium Terpadu, Departemen Ilmu Produksi dan Teknologi Peternakan, dan Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Sampel susu kambing segar diperoleh dari peternakan kambing perah di wilayah, Ciampea, Bogor. Penelitian ini berlangsung dari bulan Maret hingga Desember 2011.
Materi
Bahan-bahan utama yang digunakan pada penelitian ini adalah susu kambing segar yang didapat dari pemerahan di pagi hari dan kultur bakteri Salmonella Typhimurium ATCC 14028 koleksi Bagian Teknologi Hasil Ternak. Media dan bahan-bahan kimia yang digunakan pada penelitian ini diantaranya Plate Count Agar (PCA), Salmonella and Shigella Agar (SSA), Nutrient Broth (NB), Buffered Peptone Water (BPW), kristal violet, safranin, lugol iodin, etanol 96%, etanol 70%, akuades, akuades bebas CO2, asam asetat glasial, kloroform, kristal kalium iodida, natrium
tiosulfat 0,02 N, larutan kanji, akrilamid 30%, (pewarna elektroforesis) bis, Amonium Peroksodisulfat (APS), glisin 0,192 M, Tris buffer 0,025 M, Tris buffer 1,4 M, HCl, SDS 0,1%, mercapto, gliserol, bromfenol biru, TEMED, metanol 50%, asam asetat 12%, formalin 0,05%, akuabides, Na2S2O3, AgNO3, dan Na2CO3.
Peralatan utama yang digunakan adalah seperangkat alat UV dengan dosis masing-masing reaktor 2,25 kGy yang terdiri atas tiga reaktor UV dengan dosis total 6,75 kGy, seperangkat alat HPEF sistem kontinyu yang pembangkit tegangan tingginya berasal dari koil mobil dengan kuat medan listrik 31,67 kV/cm (Lampiran 48). Pada alat HPEF tersebut, terdapat treatment chamber yang terdiri atas dua elektroda stainless steel yang dipisahkan oleh insulator akrilik. Elektroda berukuran panjang 60 mm dan lebar 15 mm. Peralatan lainnya yang digunakan adalah cawan petri, pembakar bunsen, laminar air flow, vortex mixer, pipet mikro dan tip, magnetic stirrer, labu erlenmeyer, botol schott, milkotester (mini master), pH meter, spektrofotometer, jarum öse, gelas objek, pipet tetes, dan mikroskop.
11 Prosedur
Penelitian ini terdiri atas dua tahap yaitu penelitian pendahuluan dan penelitian utama. Penelitian pendahuluan terdiri atas optimasi metode ultraviolet, penyegaran kultur bakteri, pewarnaan Gram, dan estimasi populasi Salmonella Typhimurium. Penelitian utama terdiri atas persiapan susu kambing rekontaminasi, aplikasi kombinasi UV dan HPEF pada susu kambing segar, aplikasi kombinasi UV dan HPEF pada susu kambing rekontaminasi, serta uji fisik, kimia, mikrobiologis, bilangan peroksida dan elektroforesis molekul protein susu kambing.
Optimasi Aplikasi Metode Ultraviolet
Sebanyak 1000 ml sampel susu kambing segar dihomogenkan dan diambil sebanyak ±50 ml untuk pengujian kualitas fisik, kimia dan mikrobiologis (total plate count). Sisa sampel susu kambing dimasukkan ke dalam separating funnel dan dialirkan melalui reaktor UV dengan empat taraf perlakuan dosis berbeda, yaitu 0 kGy (kontrol), 2,25 kGy (1 reaktor), 4,50 kGy (2 reaktor), dan 6,75 kGy (3 reaktor). Sampel susu kambing diambil dari masing-masing perlakuan sebanyak ±50 ml untuk pengujian kualitas fisik, kimia dan mikrobiologisnya. Taraf perlakuan dosis UV dengan penurunan jumlah total bakteri terbaik dan tidak memengaruhi kualitas fisik dan kimia susu kambing, akan diambil untuk dikombinasikan dengan perlakuan High Pulsed Electric Field (HPEF).
Penyegaran Kultur Bakteri
Penyegaran kultur bakteri Salmonella Typhimurium ATCC 14028 bertujuan untuk mendapatkan bakteri uji dengan umur 24 jam. Sebanyak 1 ml bakteri S. Typhimurium yang sebelumnya telah ditumbuhkan dalam media Nutrient Broth (NB) diambil dan diinokulasikan ke dalam 9 ml NB steril, kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 °C.
Pewarnaan Gram (Fardiaz, 1989)
Pewarnaan Gram diperlukan untuk pemeriksaan keseragaman bakteri uji yang akan digunakan. Sampel bakteri dari koloni yang homogen dibuat preparat pada gelas objek kemudian difiksasi dengan pembakar bunsen. Olesan bakteri ditetesi dengan kristal violet dan didiamkan selama satu menit, kemudian dibilas dengan akuades. Setelah kering, preparat tersebut ditetesi dengan lugol iodin dan didiamkan selama
12 dua menit, kemudian dibilas dengan akuades dan dikeringudarakan. Preparat dicuci dengan etanol 96% tetes demi tetes selama 30 detik, kemudian segera dicuci dengan akuades dan dikeringkan. Selanjutnya preparat ditetesi dengan safranin selama 30 detik lalu dibilas akuades. Preparat dikeringkan lalu diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 100 kali dengan bantuan minyak imersi. Bakteri Gram negatif akan berwarna merah, sedangkan bakteri Gram positif akan berwarna biru atau ungu. Perhitungan Populasi S. Typhimurium
Perhitungan populasi S. Typhimurium diperlukan untuk penentuan jumlah S. Typhimurium yang akan direkontaminasikan ke dalam susu kambing sehingga dicapai populasi 105 per ml susu kambing. Sebanyak 1 ml kultur S. Typhimurium umur 24 jam yang telah ditumbuhkan pada NB diukur nilai optical density-nya (OD) dengan alat spektrofotometer pada panjang gelombang 620 nm. Sebanyak 1 ml S. Typimurium yang sama, dihitung jumlah populasinya dengan cara dipupukkan dalam media Salmonella and Shigella Agar (SSA) yang diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 °C. Standarisasi populasi S. Typhimurium yang direkontaminasi dilakukan melalui nilai OD kultur.
Aplikasi Kombinasi UV dan HPEF pada Susu Kambing Segar
Sebanyak 1000 ml sampel susu kambing segar dihomogenkan dan diambil sebanyak ±50 ml untuk pengujian kualitas fisik, kimia dan mikrobiologis (jumlah total bakteri). Sisa sampel susu kambing dimasukkan ke dalam separating funnel dan diberi perlakuan dosis UV sesuai dengan hasil penelitian pendahuluan dan dikombinasikan dengan metode HPEF dengan taraf perlakuan frekuensi 0 (kontrol), 10, 15, dan 20 Hz. Setiap taraf perlakuan frekuensi diambil sebanyak ±50 ml sampel susu untuk pengujian kembali kualitas fisik, kimia dan mikrobiologis (jumlah total bakteri). Taraf perlakuan frekuensi dengan penurunan jumlah total bakteri terbanyak dan tidak memengaruhi kualitas fisik dan kimia susu kambing, terpilih untuk tahap perlakuan kombinasi UV dan HPEF pada susu kambing yang direkontaminasi S. Typhimurium.
Persiapan Susu Kambing yang Direkontaminasi S. Typhimurium
Sebanyak 1000 ml susu kambing segar disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 115 °C selama 3 menit. Setelah susu kambing steril didinginkan, lalu direkontaminasikan
13 dengan bakteri kultur uji Salmonella Typhimurium berumur 24 jam yang ditumbuhkan pada media NB dan dengan distandarisasi pada populasi 105 cfu/ml susu kambing. Sampel susu kambing yang telah direkontaminasi diambil sebanyak ±5 ml untuk dihitung jumlah populasi awal S. Typhimurium sebelum diberi perlakuan, sebagai verifikasi.
Aplikasi Kombinasi UV dan HPEF pada Susu Kambing yang Direkontaminasi S. Typhimurium
Susu kambing yang telah direkontaminasi bakteri uji S. Typhimurium dimasukkan ke dalam separating funnel. Susu dialirkan melewati reaktor ultraviolet sesuai dengan hasil penelitian pendahuluan dan dilanjutkan dengan perlakuan HPEF mengacu hasil aplikasi kombinasi UV dan HPEF pada susu kambing segar.
Uji Kualitas Fisik Susu Kambing
Nilai pH (AOAC, 2007). Nilai pH yang diamati adalah nilai pH susu kambing segar sebelum dan setelah mendapat perlakuan dosis UV, juga nilai pH susu kambing segar sebelum dan setelah perlakuan kombinasi UV dan HPEF. Kalibrasi pH meter dilakukan terlebih dahulu dengan buffer pH 4 dan 7. Pengukuran dilakukan dengan cara pencelupan elektroda pH meter ke dalam sampel susu kambing dan skala dibaca setelah angka yang ditampilkan stabil.
Berat Jenis Susu Kambing Segar (SNI 01-2782-1998). Sebanyak 250 ml susu kambing bersuhu antara 21-30 °C dimasukkan ke dalam gelas ukur dengan perlahan tanpa ada pembentukan buih. Laktodensimeter dicelupkan perlahan-lahan dan nilai berat jenis dapat dibaca pada skala yang tertera pada laktodensimeter. Angka yang tertera pada laktodensimeter disetarakan pada suhu 27,5 °C.
Uji Kualitas Kimia Susu Kambing
Komposisi kimia susu kambing diukur dengan alat milkotester (mini master). Alat milkotester diatur untuk pengujian susu kambing/domba. Sampel susu kambing dihomogenkan dan diambil sebanyak ±20 ml, lalu pipa milkotester dicelupkan, kemudian alat pengatur milkotester diputar sehingga sampel susu kambing memasuki alat untuk dianalisis. Milkotester akan memberikan sinyal yang menunjukkan bahwa alat tersebut telah selesai menguji komposisi kimia susu. Setelah hasil pengujian
14 terhadap parameter kualitas susu dicatat, sampel susu dapat dikeluarkan kembali dengan memutar alat pengatur milkotester ke posisi semula. Hasil analisis komposisi kimia susu kambing yang ditampilkan di layar milkotester, meliputi kadar protein, kadar lemak, kadar laktosa, kadar garam, bahan kering tanpa lemak, titik beku, dan berat jenis.
Bilangan Peroksida (SNI-3555-1998). Pengujian bilangan peroksida bertujuan untuk mengetahui tingkat oksidasi lemak susu kambing akibat perlakuan UV. Lemak susu kambing diekstrak dengan metode maserasi heksana. Sebanyak 0,3 – 5,0 g sampel lemak susu kambing dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan ditambahkan 20 ml asam asetat glasial, 25 ml etanol 95% dan 55 ml kloroform. Sebanyak 1 g kristal kalium iodida ditambahkan kemudian disimpan di tempat gelap selama 30 menit dan ditambahkan 50 ml akuades bebas CO2. Semua campuran tersebut dititrasi
dengan larutan standar natrium tiosulfat 0,02 N dengan larutan kanji digunakan sebagai indikatornya. Penetapan blanko dilakukan dan bilangan peroksida dalam sampel dihitung dengan rumus sebagai berikut:
Keterangan:
V1 = volume natrium tiosulfat 0,02 N yang terpakai untuk mentitrasi sampel (ml)
V0 = volume natrium tiosulfat 0,02 N yang terpakai untuk mentitrasi blanko (ml)
T = normalitas natrium tiosulfat yang digunakan m = bobot sampel yang digunakan.
Elektroforesis (Laemmli, 1970). Elektroforesis bertujuan untuk mengetahui keberadaan fraksi-fraksi molekul protein susu kambing. Metode tersebut terdiri atas dua tahap yaitu pembuatan gel, running, pemisahan, dan pewarnaan.
Pembuatan Gel. Pembuatan gel diawali dengan pembuatan larutan stok SDS-PAGE. Larutan A yaitu larutan stok akrilamid dibuat dengan komposisi 75 g akrilamid 30% b/v, 2 g bis dan 250 ml H2O. Larutan A ini diletakkan di dalam botol gelap dan
disimpan pada suhu 4 °C. Bahan pembuat gel yang digunakan adalah amonium peroksodisulfat (APS) sebanyak 1 g yang dilarutkan dalam 10 ml H2O. Bufer
15 ditambahkan HCl hingga dicapai pH 8,3 kemudian ditambahkan 2 g SDS 0,1% b/v dan ditepatkan volumenya hingga 2 liter. Larutan B yaitu stok bufer gel pemisah dibuat dengan komposisi 1 g SDS dan 45,5 g tris bufer 1,4 M, kedua campuran ini dilarutkan dan ditepatkan pHnya hingga 8,8 menggunakan HCl, dan ditambahkan akuades hingga volumenya 250 ml. Stok bufer gel pengumpul yang digunakan terdiri atas 15,1 g Tris bufer 1,4 M dan dilarutkan dengan HCl hingga pH 6,8, kemudian ditambahkan 1 g SDS dan ditepatkan volumenya hingga 250 ml. Persiapan dilanjutkan dengan pembuatan stok (double strength) buffer sampel yang terdiri atas 2 ml mercapto, 4 ml gliserol, 0,3 g tris bufer, 2 ml bromfenol biru (0,1% b/v dalam air). Campuran tersebut dilarutkan dengan akuades pada volume kurang dari 20 ml, ditambahkan HCl hingga pH menjadi 6,8, kemudian ditambahkan 0,92 g SDS dan ditepatkan volumenya hingga 20 ml. Gel dibuat dengan cara mengombinasikan larutan stok yang telah dibuat sebelumnya. Kombinasi larutan dalam pembuatan gel meliputi 6,25 ml larutan stok akrilamid, 4,1 ml bufer gel pemisah, 4,4 ml akuades, 0,15 ml SDS 10% (b/v), 10 ml APS 10% (b/v) dan 25 ml TEMED.
Pewarnaan. Larutan pewarna yang digunakan adalah silver staining (pewarna perak). Bahan pembuat pewarna perak ini terdiri atas fixation solution (larutan fiksasi), washing solution (larutan pencuci), sensitizing solution (larutan pemeka) untuk membuat lebih sensitif, staining solution (larutan pewarna) dan developing solution (larutan pengembang) untuk memunculkan pita protein. Larutan fiksasi terdiri atas 125 ml metanol 50%, 30 ml asam asetat 12%, 0,125 ml formalin 0,05%, dan dilarutkan dengan 95 ml akuabides, kemudian disimpan pada suhu ruang. Larutan pencuci terdiri atas 100 ml etanol 20% dan 400 ml akuabides, disimpan pada suhu ruang. Sensitizing solution (larutan pemeka) yang digunakan adalah 0,05 g Na2S2O3 yang dilarutkan dalam 250 ml akuabides, disimpan pada suhu ruang.
Larutan pewarna terdiri atas 0,1 g AgNO3 dilarutkan dengan 50 ml akuabides dan
ditambahkan 38 ml formalin, kemudian disimpan pada suhu 4 °C. Larutan pengembang terdiri atas 3 g Na2CO3, 25 ml formalin, 1 ml Na2S2O3 dan dilarutkan
dalam 50 ml akuabides. Khusus untuk larutan pewarna dan larutan pengembang harus dalam keadaan segar. Pembuatan gel yang telah selesai dilakukan, dilanjutkan dengan pewarnaan. Gel direndam dalam larutan fiksasi selama dua jam sambil diagitasi pelan-pelan dan didiamkan sampai 24 jam. Gel kemudian dicuci dengan
16 larutan pencuci selama 20 menit tanpa diagitasi, pencucian ini diulang hingga 3 kali. Gel dibilas dengan akuabides selama 10 detik, lalu direndam dalam larutan pemeka selama satu menit, dan dibilas kembali dengan akuabides sampai tiga kali dengan masing-masing pembilasan selama 20 detik. Gel direndam dalam AgNO3 0,1% dan
diinkubasi di dalam lemari pendingin selama 20 menit. Gel dicuci kembali dengan akuabides selama 20 detik dan diulang dua kali. Gel dipindahkan ke wadah lain dan dicuci kembali dengan akuabides selama 10 detik. Gel direndam dalam larutan pengembang hingga pewarnaan cukup. Gel diangkat dan didiamkan selama 5 menit, kemudian dicuci kembali dengan akuabides. Hasil dari gel yang telah selesai mendapatkan perlakuan pewarnaan kemudian dipindai.
Uji Kualitas Mikrobiologis Susu Kambing
Perhitungan Jumlah Total Bakteri pada Susu Kambing Segar (SNI 01-3141-1998). Sebanyak 1 ml sampel susu segar dipipet kemudian dimasukkan ke dalam tabung reaksi berisi 9 ml Buffered Peptone Water (BPW) sebagai pengenceran sepersepuluh (P-1). Pengenceran desimal selanjutnya dilakukan dengan memipet sebanyak 1 ml dari tabung P-1 untuk diencerkan lagi ke dalam 9 ml BPW sehingga didapatkan pengenceran seperseratus (P-2). Pengenceran yang sama terus dilakukan hingga diperoleh P-7. Pemupukan dilakukan terhadap pengenceran P-5, P-6, dan P-7 secara duplo dengan cara dipipetkan sebanyak masing-masing 1 ml ke dalam cawan petri steril dan dipupukkan dengan media Plate Count Agar (PCA) steril dengan suhu sekitar 37-40 °C sebanyak 12-15 ml. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara cawan petri digerakkan membentuk angka delapan sebanyak enam kali. Setelah agar mengeras, cawan petri diletakkan dalam inkubator dengan posisi terbalik pada suhu 37±1 °C selama 24 jam. Koloni mikroba yang terbentuk dihitung berdasarkan Standard Plate Count (SPC).
Perhitungan Jumlah Bakteri Salmonella Typhimurium (SNI 01-3141-1998). Sebanyak 1 ml sampel susu kambing rekontaminasi diambil menggunakan pipet mikro kemudian dimasukkan ke dalam 9 ml Buffered Peptone Water (BPW) sebagai pengenceran sepersepuluh (P-1). Pengenceran desimal selanjutnya dilakukan dengan memipet sebanyak 1 ml dari tabung P-1 untuk diencerkan lagi ke dalam 9 ml BPW sehingga didapatkan pengenceran seperseratus (P-2). Pengenceran tersebut terus
17 dilakukan hingga diperoleh P-5. Pemupukan dilakukan terhadap pengenceran P-3, P-4, dan P-5 secara duplo dengan cara dipipetkan sebanyak masing-masing 1 ml ke dalam cawan petri steril dan dipupukkan dengan media Salmonella and Shigella Agar (SSA) steril dengan suhu sekitar 37-40 °C sebanyak 12-15 ml. Campuran tersebut dihomogenkan dengan cara cawan petri digerakkan membentuk angka delapan sebanyak enam kali. Setelah agar mengeras, cawan petri diinkubasi dengan posisi terbalik pada suhu 37±1 °C selama 24 jam. Koloni mikroba yang terbentuk dihitung berdasarkan Standard Plate Count (SPC).
Bagan Alir Penelitian
1. Optimasi Metode Ultraviolet
Susu kambing segar Pengujian kualitas fisik, kimia dan mikrobiologis (TPC)
Diberi perlakuan UV dengan dosis berbeda 2,25 kGy (1 reaktor); 4,50 kGy (2 reaktor); 6,75 kGy (3 reaktor); kontrol: 0 kGy
Pengujian kualitas fisik, kimia dan mikrobiologis (TPC)
Hasil terpilih dikombinasikan dengan metode HPEF
2. Penentuan Frekuensi HPEF
Susu kambing segar Pengujian kualitas fisik, kimia dan mikrobiologis (TPC)
Perlakuan UV dengan dosis terpilih Perlakuan HPEF dengan frekuensi
berbeda 10, 15, 20 Hz; kontrol: 0 Hz
Pengujian kualitas fisik, kimia dan mikrobiologis (TPC), serta
bilangan peroksida dan elektroforesis protein susu Hasil terpilih digunakan pada penelitian utama
3. Penelitian Utama
Susu kambing segar Disterilisasi menggunakan autoklaf (115 °C selama 3 menit)
Pengujian mikrobiologis (jumlah bakteri
Salmonella Typhimurium)
Direkontaminasi dengan Salmonella Typhimurium hingga populasi mencapai 105 cfu/ml susu kambing
Penentuan kemampuan reduksi populasi S. Typhimurum dengan metode kombinasi UV dan HPEF
Diberi perlakuan kombinasi UV dan HPEF sesuai dengan hasil
penelitian pendahuluan Gambar 5. Diagram Alir Penelitian
18 Rancangan dan Analisis Data
Rancangan
Rancangan percobaan yang digunakan pada penelitian ini adalah Rancangan Acak Lengkap (RAL) untuk data parametrik dan Kruskal Wallis untuk data nonparametrik. Taraf perlakuan pada penelitian pendahuluan terdiri atas empat taraf dosis UV yang berbeda, yaitu 0 kGy (kontrol), 2,25 kGy (1 reaktor), 4,50 kGy (2 reaktor), dan 6,75 kGy (3 reaktor). Taraf perlakuan pada penelitian utama terdiri atas empat taraf frekuensi, yaitu 0 (kontrol), 10, 15, dan 20 Hz. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak tiga kali.
Analisis Data
Analisis data diawali dengan pengujian asumsi. Apabila data memenuhi uji asumsi, maka dianalisis ragam dengan ANOVA. Apabila data tidak memenuhi uji asumsi, maka data ditransformasi terlebih dahulu dan apabila masih tidak memenuhi uji asumsi, maka dianalisis menggunakan uji Kruskal Wallis. Data yang diperoleh diuji pada selang kepercayaan 95% dengan perangkat lunak Statistix 8.0. Model matematik dari rancangan acak lengkap tersebut menurut Steel and Torrie (1995) adalah:
Yij = μ + Pi+ εij Keterangan:
Yij : peubah respon akibat pengaruh perlakuan dosis UV atau kombinasi dosis UV dan frekuensi HPEF
μ : rataan umum
Pi : pengaruh dosis UV atau kombinasi dosis UV dan frekuensi HPEF εij : galat percobaan
sedangkan model matematik dari uji Kruskal Wallis menurut Casella (2008) sebagai berikut:
Keterangan:
n1 : jumlah pengamatan dalam sampel ke-i n : ∑ni
