Volume 10, No. 1, Agustus 2017 |10
(
Calophyllum rigidum
Miq.)
Toxicity and in vitro antioxidant activity of ethanolic extracts of
bintangur (Calophyllum rigidum Miq.) leaf and stem bark
Eris Septiana
*, Partomuan Simanjuntak
**
Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI
*e-mail : septiana.eris@gmail.com
ABSTRACT
Antioxidant and toxicity assays still become interesting topic due to their capability to inhibit free radical without toxic effect for human. One of the plants that have antioxidant activity is from the genus Calophyllum or commonly known as bintangur trees. The aim of this study is to evaluate in vitro antioxidant activity and toxicity of leaf and stem bark ethanolic extracts of bintangur tree (Calophyllum rigidum). In vitro antioxidant activity assay was carried out by free radical scavenging DPPH method whereas brine shrimp lethality test was used to determine toxicity of the extracts. The results of this study showed that the ethanolic extracts of leaf and stem bark of bintangur has antioxidant activities with IC50 values at 33.92 and 7.50 mg/L respectively. The ethanolic extracts of leaf and stem bark of bintangur also has LC50 values at 627.97 and 1063.17 mg/L respectively. Therefore, ethanolic extract of stem bark has better antioxidant activity and lesser toxicity than ethanolic extract of leaf of bintangur based on in vitro assay.
Keywords : antioxidant, toxicity, DPPH, BSLT, Calophyllum rigidum
ABSTRAK
Uji antioksidasi sekaligus uji toksisitas masih merupakan tema yang menarik karena kemampuannya dalam meredam radikal bebas tanpa efek toksik bagi manusia. Salah satu tanaman yang memiliki aktivitas antioksidan ialah dari genus Calophyllum atau yang biasa disebut sebagai pohon bintangur. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan toksisitas secara in vitro dari ekstrak etanol daun dan kulit batang bintangur (Calophyllum rigidum). Pengujian aktivitas antioksidan in vitro dilakukan menggunakan metode peredaman radikal bebas DPPH. Sedangkan uji toksisitas ekstrak secara in vitro menggunakan metode uji kematian larva udang Artemia salina (BSLT). Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun dan kulit batang bintangur memiliki aktivitas antioksidan dengan nilai IC50
masing-masing sebesar 33,92 dan 7,50 mg/L. Uji toksisitas menunjukkan bahwa ekstrak daun dan kulit batang bintangur memiliki LC50 masing-masing sebesar 627,97 dan 1063,17 mg/L.
Oleh karena itu ekstrak etanol kulit batang bintangur Calophyllum rigidum mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih baik serta lebih tidak toksik dibandingkan ekstrak etanol daun berdasarkan pengujian secara in vitro.
In Vitro Toxicity and Antioxidant Activity of Ethanolic Extracts of Bintangur (Calophyllum rigidum Miq.) Leaf and Stem Bark
11 | Volume 10, No. 1, Agustus 2017 PENDAHULUAN
Antioksidan saat ini masih merupakan tema yang menarik karena kemampuannya dalam meredam radikal bebas dan menghambat peroksidasi lipid untuk melindungi tubuh manusia dari serangan beberapa penyakit akibat reaksi radikal. Radikal bebas memberikan dampak terhadap patogenesis dari beberapa penyakit pada manusia seperti arteriosklerosis, kanker, diabetes melitus, kerusakan hati, inflamasi, kerusakan jaringan kulit, jantung koroner dan arthritis (Moon, et al., 2006). Penggunaan antioksidan sintetis untuk mencegah kerusakan akibat radikal bebas telah dilaporkan menyebabkan timbulnya efek samping yang toksik sehingga perlu dilakukan pencarian sumber antioksidan baru dari alam (Radulovic et al., 2007). Salah satu bahan alam yang dilaporkan mempunyai aktivitas antioksidan ialah senyawa golongan polifenolik yang dapat ditemukan pada tanaman (Miller et al., 1995).
Salah satu tanaman yang memiliki aktivitas antioksidan ialah dari genus
Calophyllum atau yang biasa disebut sebagai pohon bintangur. Tanaman ini merupakan tanaman pohon yang sangat penting nilai manfaatnya berupa kayu berukuran besar (Taher et al., 2007). Penelitian tentang manfaat tanaman Calophyllum dari jenis selain C. rigidum sebagai antioksidan telah banyak dilakukan meliputi bagian kulit batang dan daun. Beberapa diantaranya ialah Calophyllum enervosum, C. hanya terfokus pada kandungan senyawa aktif suatu tanaman obat dalam mengobati suatu penyakit, akan tetapi juga harus
diketahui toksisitasnya terhadap manusia. Efek toksik dapat terjadi pada organ tubuh seperti hati dan ginjal. Tingkat toksisitas suatu bahan obat berhubungan dengan interaksi senyawa kimia toksik dengan sel hati dan ginjal yang berfungsi sebagai organ penyaring (Bello et al., 2016). Oleh karena itu, pengujian tentang toksisitas sebuah bahan obat sangat penting dilakukan guna perlindungan penggunanya.
Penggunaan bintangur (C. rigidum) sebagai obat tradisional telah dilakukan oleh beberapa masyarakat di Indonesia. seperti masyarakat di Kalimantan Barat yang memanfaatkan getahnya untuk mengobati koreng (Sangat, dkk. 2000).Akan tetapi belum ada penelitian tentang manfaat antioksidan dan toksisitas tanaman bintangur (C. rigidum). Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antioksidan dan toksisitas secara
in vitro dari ekstrak etanol daun dan kulit batang bintangur (C. rigidum).
METODE PENELITIAN
Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei sampai dengan Agustus 2017 di Laboratrorium Kimia Bahan Alam, Pusat Penelitian Bioteknologi LIPI, Cibinong, Jawa Barat. Sampel tanaman bintangur berupa bagian daun dan kulit batang (Gambar 1) diperoleh dari kecamatan Tebing, Kabupaten Karimun, Propinsi Kepulauan Riau. Simplisia tanaman bintangur berupa ranting dan daun terlebih dahulu dideterminasi di Herbarium Bogoriense, Pusat Penelitian Biologi, LIPI, Cibinong, Jawa Barat.
Volume 10, No. 1, Agustus 2017| 12 masing-masing bagian diuapkan dengan
rotary vacuum evaporator hingga
didapatkan ekstrak kental etanol daun dan kulit batang bintangur.
Gambar 1. Bagian daun (A) dan kulit batang (B) tanaman bintangur (Calophullum rigidum)
Uji Aktivitas Antioksidan. Uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan metode peredaman radikal bebas dengan menggunakan senyawa DPPH (Tiwari et al., 2006) dengan modifikasi pada panjang gelombang dari 515 nm mejadi 517 nm. Konsentrasi larutan uji untuk ekstrak etanol 96 % kulit batang bintangur sebesar 5, 10, 15, 20, dan 25 mg/L, sedangkan untuk ekstrak etanol 96 % daun bintangur sebesar 5, 10, 25, 50, dan 100 mg/L. Asam askorbat (vitamin C) (Merck) sebagai baku pembanding dengan konsentrasi sebesar 1, 3, 5, 7, dan 9 mg/L, serta larutan blanko (larutan DPPH (Sigma) 0,4 mM tanpa penambahan ekstrak uji). Seluruh sampel larutan uji, blanko dan asam askorbat (vitamin C) diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit. Seluruh pengujian dilakukan tiga kali pengulangan. Serapan seluruh sampel kemudian diukur pada panjang gelombang 517 nm. Aktivitas antioksidan didapatkan dengan
menggunakan persamaan (1) dan nilai IC50
yang merupakan bilangan yang menunjukkan konsentrasi sampel uji yang mampu menghambat proses oksidasi sebesar 50%. Nilai IC50 diperoleh dengan
cara dibuat kurva linear antara konsentrasi larutan uji (sumbu x) dan % aktivitas antioksidan (sumbu y) dan dihitung berdasarkan persamaan regresi y= ax + b, dengan nilai y=50.
% Penghambatan = (A–B)/ A x 100 % .… (1)
Keterangan: A = serapan DPPH 0,4 mM tanpa bahan uji
B = serapan DPPH 0,4 mM dengan bahan uji
Uji Toksisitas. Pengujian toksisitas in vitro
menggunakan larva udang Artemia salina
(Meyer et al., 1982). Air laut dimasukkan ke dalam bejana yang dibagi menjadi dua ruangan dengan sekat. Sejumlah 100 mg telur A. salina dimasukkan ke dalam salah satu ruang kemudian ditutup. Sisi ruang yang lain dibiarkan terbuka dengan diberi penerangan lampu selama 48 jam. Telur yang menetas dan berubah jadi larva digunakan dalam penelitian. Sebanyak masing-masing 40 mg ekstrak etanol daun dan kulit batang bintangur dilarutkan dalam 20 mL air laut sebagai larutan 2000 mg/L. Dipipet sebanyak 2 mL dari larutan 2000 mg/L kemudian ditambahkan air laut sampai 20 mL untuk mendapatkan larutan ekstrak 200 mg/L. Dipipet sebanyak 2 mL dari larutan 200 mg/L kemudian ditambahkan air laut sampai 20 mL untuk mendapatkan larutan ekstrak 20 mg/L. Dipipet sebanyak 5 mL masing-masing larutan ekstrak 2000, 200, dan 20 mg/L ke dalam wadah uji. Sebanyak total 30 ekor larva udang A. salina untuk masing-masing konsentrasi ekstrak dimasukkan ke dalam tiga wadah uji yang telah berisi larutan bahan uji kemudian ditambahkan air laut sampai 10 mL sehingga didapatkan
A
In Vitro Toxicity and Antioxidant Activity of Ethanolic Extracts of Bintangur (Calophyllum rigidum Miq.) Leaf and Stem Bark
13 | Volume 10, No. 1, Agustus 2017
konsentrasi akhir bahan uji sebesar 1000, 100, dan 10 mg/L. Kelompok kontrol berisi air laut dan larva udang tanpa penambahan bahan uji. Seluruh pengujian diinkubasi selama 24 jam pada suhu ruang. Setelah inkubasi, larva dihitung jumlah yang mati dan hidup dalam masing-masing pengujian. Nilai LC50 (kadar senyawa yang mampu
membunuh larva hingga 50%) dihitung menggunakan analisis probit.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Aktivitas Antioksidan
Determinasi simplisia menunjukkan bahwa simplisia yang digunakan adalah
Calophyllum rigidum (Miq.) dari suku Clusiaceae. Rendemen ekstrak etanol daun
C. rigidum sebesar 8,2% lebih tinggi dibandingkan dengan bagian kulit batang sebesar 7,6%. Hasil pengujian aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun dan kulit batang bintangur dapat dilihat pada Gambar 2 dan 3 serta Tabel 1.
Gambar 2. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol daun tanaman bintangur (Calophullum rigidum)
Ekstrak etanol kulit batang memiliki aktivitas yang lebih tinggi dengan ditunjukkan oleh nilai IC50 yang lebih rendah
dibanding dengan ekstrak etanol daun. Akan tetapi keduanya masih lebih rendah aktivitasnya dibandingkan dengan kontrol positif vitamin C. Kekuatan aktivitas antioksidan dapat dikelompokkan ke dalam kategori sangat aktif jika memiliki IC50<10
mg/L, aktif jika memiliki IC50<100 mg/L,
dan tidak aktif jika memiliki IC50>100 mg/L
(Minami, et al., 1994). Oleh karena itu ekstrak etanol kulit batang memiliki aktivitas antioksidan yang sangat aktif, sedangkan ekstrak etanol daun aktivitas antioksidannya aktif.
Gambar 3. Aktivitas antioksidan ekstrak etanol kulit batang tanaman bintangur (Calophullum
rigidum)
Penggunaan metode peredaman DPPH merupakan metode yang umum digunakan dalam penelitian uji antioksidan. Prinsip kerja metode ini ialah adanya interaksi antioksidan dengan DPPH yang menyebabkan senyawa DPPH yang berwarna ungu akan dirombak menjadi senyawa α, α-diphenyl-β- picrylhydrazyl
yang berwarna kuning (Fitriana, et al., 2016). Efek antioksidan dalam metode peredaman radikal bebas DPPH terjadi karena kemampuan suatu senyawa dalam mendonasikan hidrogen (Babu, et al., 2013).
Tabel 1. Aktivitas antioksidan bintangur
No. Sampel IC50±SD
Penelitian dengan menggunakan
Calophyllum rigidum baik di Indonesia
Volume 10, No. 1, Agustus 2017| 14 maupun di dunia belum banyak
dipublikasikan. Padahal keberadaan tanaman ini di tempat pengambilan sampel yaitu di daerah Kabupaten Karimun begitu banyak dan belum dimanfaatkan sebagai obat tradisional oleh masyarakat sekitar. Sampai saat ini hanya satu jurnal yang membahas tentang manfaat tanaman C. rigidum untuk kesehatan. Takahashi et al. (2004) melaporkan bahwa ekstrak metanol kulit batang C. kunstleri (sinonim dari C.
rigidum) asal Myanmar mempunyai
kemampuan dalam membunuh protozoa
Leishmania penyebab penyakit
Leishmaniasis.
Meskipun demikian, beberapa penelitian menggunakan tanaman genus
Calophyllum untuk antioksidan telah banyak dilakukan seperti C. canum dan C. lanigerum. Ekstrak etanol kulit batang C. canum dan C. lanigerum memiliki aktivitas antioksidan yang sangat aktif dengan nilai IC50
masing-masing sebesar 5,189 dan 3,02 mg/L (Lopa, 2013; Aritonang, 2013). Kedua jenis
Calophyllum tersebut memiliki aktivitas yang sedikit lebih kuat dibandingkan dengan Calophyllum rigidum dalam penelitian ini yaitu dengan nilai IC50 sebesar
7,50 mg/L.
Toksisitas Ekstrak
Hasil uji toksisitas menggunakan larva udang A. salina dapat dilihat pada Gambar 4 dan Tabel 2. Ekstrak etanol daun bintangur memiliki toksisitas yang lebih tinggi dibandingkan dengan ekstrak etanol kulit batang. Suatu ekstrak kasar dikatakan toksik jika memiliki LC50 < 1000 mg/L dan
tidak toksik jika memiliki nilai LC50 > 1000
mg/L (Meyer, et al., 1982).
Kandungan bahan toksik dalam suatu bahan obat sangat penting terutama menyangkut pada perlindungan kesehatan masyarakat. Pesatnya perkembangan tanaman obat mengharuskan telaah lebih lanjut tentang aspek toksisitas untuk memastikan keamanan dan efektivitas
bahan alam berkhasiat obat. Pengujian toksisitas suatu bahan obat dapat dilakukan secara in vitro menggunakan metode Brine Shrimp Toxicity Test (BSLT). Metode ini merupakan metode yang ekonomis, membutuhkan jumlah bahan uji yang sedikit, cepat, dan dapat digunakan untuk mendeteksi bahan toksik dari ekstrak tanaman (Gadir, 2012). Selain itu, metode BSLT memiliki korelasi positif dengan pengujian secara in vivo menggunakan hewan coba (Naidu et al., 2014).
Gambar 4. Toksisitas ekstrak etanol daun dan kulit batang tanaman bintangur (Calophullum rigidum) terhadap larva udang Artemia salina
Tabel 2. Toksisitas tanaman bintangur
No. Sampel LC50
Seperti halnya uji aktivitas antioksidan, uji toksisitas terhadap larva udang A. salina dari tanaman bintangur C. rigidum belum pernah dilakukan. Akan tetapi, penelitian tentang toksisitas terhadap larva udang telah dilakukan pada ekstrak dari jenis Calophyllum yang lain. Ekstrak etanol daun tanaman C. nagassarium memiliki nilai LC50 sebesar
19,06 mg/L terhadap larva A. salina (Putra, dkk., 2016). Nilai ini jauh dibawah nilai LC50
In Vitro Toxicity and Antioxidant Activity of Ethanolic Extracts of Bintangur (Calophyllum rigidum Miq.) Leaf and Stem Bark
15 | Volume 10, No. 1, Agustus 2017
rigidum pada penelitian ini yaitu masing-masing sebesar 627,97 dan 1063,17 mg/L. Hal ini menunjukkan bahwa ekstrak etanol daun dan kulit batang C. rigidum lebih tidak toksik dibandingkan dengan ekstrak etanol daun C. nagassarium.
KESIMPULAN
Ekstrak etanol kulit batang bintangur Calophyllum rigidum mempunyai aktivitas antioksidan yang lebih baik serta lebih tidak toksik dibandingkan ekstrak etanol daun berdasarkan pengujian secara
in vitro.
UCAPAN TERIMA KASIH
Penulis mengucapkan terima kasih kepada PKT Kebun Raya Bogor atas kegiatan Ekspedisi Kebun Raya Batam 2017.
DAFTAR PUSTAKA
Aritonang, RRY. 2013. Uji Aktivitas Antioksidan dan Identifikasi Golongan Senyawa Kimia Ekstrak Etanol dan Fraksi Teraktif Kulit Batang Bintangur Belulang Calophyllum lanigerum miq.
Skripsi. Universitas Indonesia: Depok.
Babu, D., Gurumurthy, P., Borra, SK., and Cherian, KM. 2013. Antioxidant and Free Radical Scavenging Activity of Triphala Determined by Using Different In Vitro Models. Journal of Medicinal Plants Research, 7(39): 2898-2905.
Bello I., Bakkouri AS., Tabana YM., Al-Hindi B., Al-Mansoub MA., Mahmud R., and Asmawi MZ. 2016. Acute and Sub-Acute Toxicity Evaluation of the Methanolic Extract of Alstonia scholaris Stem Bark.
Medical Sciences, 4(1): 4 doi:
10.3390/medsci4010004
Blanco-Ayala T., Lugo-Huitron R., Serrano-Lopez EM., Reyes-Chilpa R., Rangel-Serrano-Lopez E., Pineda B., Medina-Compos ON., Sanchez-Chapui L., Pinzon E., Cristina TS., Silva-Adaya D., Pedraza-Chaverri J., Rios C., Cruz VPD, and Torres-Ramos M. 2013. Antioxidant Properties of Xanthones from Calophyllum brasiliense: Prevention
of Oxidative Damage Induced by FeSO4. BMC Complementary & Alternative Medicine, 13:262 doi: 10.1186/1472-6882-13-262.
Dutta S, and Ray S. 2014. Evaluation of Antioxidant Potentials of Leaf Aqueous and Methanolic Extracts of Calophyllum inophyllum in Relation to Total Phenol and Flavonoid Contents. International Journal of Pharma and Bio Sciences, 5(3): 441-450.
Fitriana, WD., Ersam, T., Shimizu, K., and Fatmawati, S. 2016. Antioxidant Activity of Moringa oleifera Extracts. Indonesian Journal of Chemistry, 16(3): 297-301.
Gadir, SA. 2012. Assessment of Bioactivity of Some Sudanese Medicinal Plants Using Brine Shrimp (Artemia salina) Lethality Assay. Journal of Chemical and Pharmaceutical Research, 4(12): 5145-5148.
Katrin, Elya B., Mahamufrudho A., and Rissyelly. 2014. Radical Scavenging Activity of Extract, Fraction and Chemical Compound from Calophyllum sclerophyllum Vesq. Stembark by Using 1,1-Diphenyl-2-Pycril Hydrazil (DPPH).
International Journal of PharmTech Research, 6(1): 396-402.
Lopa, DS. 2013. Isolasi, Uji Aktivitas Antioksidan dan Karakterisasi Senyawa Aktif dari Kulit Batang Calophyllum canum Hook F. Skripsi. Universitas Indonesia: Depok.
Meyer BN., Ferrigni NR., Putnam JE., Jacobsen LB., Nichols DE., and McLaughlin JL. 1982. Brine Shrimp: a Convenient General Bioassay for Active Plant Constituents. Journal of Medicinal Plants Research, 45(5): 31-34.
Miller MJ., Diplock AT., and Rice-Evan CA. 1995. Evaluation of the Total Antioxidant Activity as a Marker of the Deterioration of Apple Juice on Storage. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 43(7): 1794-1801.
Volume 10, No. 1, Agustus 2017| 16 Antioxidant Produced by a Fungus
Mycelia sterilia F020054. Journal of Antibiotics. 59(11): 735-739.
Naidu, JR., Ismail, R., and Sasidharan, S. 2014. Acute Oral Toxicity and Brine Shrimp Lethality of Methanol Extract of
Mentha spicata L (Lamiaceae). Tropical Journal of Pharmaceutical Research,
13(1): 101-107.
Putra, IWPE., Santi, SR., dan Rustini, NL. 2016. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Sitotoksik Daun Nagasari (Calophyllum nagassarium Burm.f.) Terhadap Larva
Artemia salina Leach. Jurnal Kimia, 10(1): 96-102.
Radulovic, N., Stankov-Jovanovic, V., Stojanovic, G., Smelcerovic, A., Spiteller, M. and Asakawa, Y. 2007. Screening of In Vitro Antimicrobial and Antioxidant Activity of Nine Hypericum Species from the Balkans. Food Chemistry, 103(1): 15-21.
Sangat HM., Zuhud EAM., dan Damayanti EK. 2000. Kamus Penyakit dan Tumbuhan
Obat Indonesia (Etnofitomedika). Pustaka Populer Obor. Indonesia.
Taher M., Attoumani N., Susanti D., Ichwan SJA., and Ahmad F. 2010. Antioxidant Activity of Leaves of Calophyllum rubiginosum. American Journal of Applied Sciences, 7(10): 1305-1309.
Taher M., Idris MS., and Arbain D. 2007. Antimicrobial, Antioxidant and Cytotoxic Activities of Garcinia eugenifolia and
Calophyllum enervosum. Iranian Journal of Pharmacology & Therapeutics, 6(1): 93-98.
Takahashi, M., Fuchino, H., Satake, M., Agatsuma, Y., and Sekita, S. 2004. In Vitro Screening of Leishmanicidal Activity in Myanmar Timber Extracts. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 27(6): 921-925.
