1 OPTIMASI SUHU ANNEALING UNTUK AMPLIFIKASI GEN trnV-ndhC INTERGENIC SPACER PADA TUMBUHAN PANDAN (Benstonea sp.) ASAL
RIAU
Ciska Viviana Sianturi1, Dewi Indriyani Roslim2
1Mahasiswa Program Studi S1 Biologi
2Dosen Bidang Genetika Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam,Universitas Riau Kampus Bina Widya Pekanbaru. 28293, Indonesia.
ABSTRACT
Pandan (Benstonea sp.) from Riau is one of the plants that has an important role in the Kajuik Lake ecosystem located in Kampar River, Langgam, Pelalawan Regency, Riau Province. The PCR technique is the technique that used to amplify DNA in vitro in short time. The process of amplify DNA can occur by the primer.
The purpose in this study was to obtain the optimal annealing temperature for amplifying trnV-ndhC intergenic spacer on pandan from Riau. In this study, a primer pair used was trnV(UAC)x2-F dan ndhC-R. The result showed that annealing temperature for amplifying trnV-ndhC intergenic spacer region was 51,2ºC and 48,2ºC. The PCR product was about 1000 bp.
Key Words: Annealing temperature, Benstonea sp., DNA barcode, PCR, trnV-ndhC intergenic spacer.
ABSTRAK
Pandan (Benstonea sp.) asal Riau merupakan salah satu tumbuhan yang memiliki peranan penting dalam ekosistem Danau Kajuik yang berada di Sungai Kampar, Langgam, Kabupaten Pelalawan, Provinsi Riau. Teknik PCR merupakan teknik yang digunakan untuk mengamplifikasi DNA secara in vitro dalam waktu yang singkat. Proses amplifikasi DNA dapat terjadi dengan adanya bantuan dari primer. Tujuan dari penelitian ini ialah untuk memperoleh suhu annealing yang optimal dalam mengamplifikasi daerah trnV-ndhC intergenic spacer pada tumbuhan pandan asal Riau. Pada penelitian ini, sepasang primer yang digunakan ialah trnV(UAC)x2-F dan ndhC-R. Hasil optimasi suhu annealing yang sesuai pada daerah
2 trnV-ndhC intergenic spacer ialah 51,2ºC dan 48,2ºC. Produk PCR yang diperoleh berukuran sekitar 1000 pb.
Kata Kunci: Barkode DNA, Benstonea sp., PCR, suhu annealing, trnV-ndhC intergenic spacer.
PENDAHULUAN
Tumbuhan pandan (Benstonea sp.) termasuk ke dalam Famili Pandanaceae. Tumbuhan pandan asal Riau merupakan salah satu tumbuhan yang memiliki peranan penting dalam ekosistem di sekitarnya (Elvyra dan Yus 2010).
Salah satu langkah penting dalam identifikasi secara molekuler ialah Polymerase Chain Reaction (PCR).
Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik amplifikasi secara in vitro dengan bantuan enzim DNA polimerase. Teknik PCR dapat mengamplifikasi potongan DNA dalam waktu yang singkat dengan jumlah yang banyak. Menurut Nasir (2002), teknik PCR dapat dilakukan dengan adanya bantuan dari primer yang memungkinkan DNA cetakan (template) diperbanyak oleh DNA polimerase.
Ada beberapa tahapan pada PCR, yakni pra-denaturasi selama 2 menit pada suhu 95ºC, denaturasi selama 30 detik pada suhu 95ºC, annealing (penempelan primer) selama 30 detik pada suhu 50ºC, elongasi selama 50 detik pada suhu 72ºC dan polimerisasi DNA akhir selama 1 menit pada suhu 72ºC. Siklus tersebut dilakukan sebanyak 35 kali (Stoeckle et al. 2011).
Pemilihan suhu pada proses PCR sangat penting karena menjadi salah satu faktor yang menentukan keberhasilan PCR. Salah satunya ialah pemilihan suhu annealing yang optimal. Optimasi suhu annealing dapat dilakukan dengan menggunakan beberapa variasi suhu pada suhu annealing.
Daerah trnV-ndhC intergenic spacer merupakan suatu daerah non- koding pada DNA kloroplas tumbuhan yang terletak di antara gen trnV dan ndhC. Daerah trnV-ndhC intergenic spacer telah diteliti pada kelompok Angiospermae dengan panjang rata-rata yang diperoleh ialah 1146 pb (Shaw et al. 2007). Sedangkan pada tanaman Pyrus spinosa dan Pyrus pyrifolia diperoleh panjang rata-rata 760 pb, serta pada tanaman Olea europeana dan Olea woodiana diperoleh panjang rata-rata 1119 pb (Korotkova et al.
2014).
Penelitian ini bertujuan untuk memperoleh suhu annealing yang optimal dalam mengamplifikasi daerah daerah trnV-ndhC intergenic spacer pada tumbuhan pandan asal Riau.
METODE PENELITIAN
3 Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2019-Maret 2020 di Laboratorium Genetika, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau.
Pengambilan sampel dilakukan di Danau Kajuik, Sungai Kampar, Kecamatan Langgam, Kabupaten Pelalawan, Provinsi Riau.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan pada penelitian ini antara lain timbangan digital (Accuris Instruments), gunting, tabung 1,5 ml dan 0,2 ml (Axygen), stik mikro, pipet mikro (VWR) (10 μl, 200 μl dan 1000 μl), tip mikro (Axygen) (10 μl, 200 μl dan 1000 μl), vorteks (Maxi Mix II), waterbath (P. selecta), freezer/kulkas, mesin sentrifus (Benchmark), erlenmeyer, hot plate (Cimarec), cetakan gel (comb dan tray), perangkat elektroforesis (Mupid-exU), mesin PCR (Hercuvan), UV transilluminator (Vilber Lourmat), kamera (Olympus SP-500 UZ) dan parafilm.
Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah daun tumbuhan pandan (Benstonea sp.) asal Riau, nitrogen cair, Genomic DNA Mini Kit Plant (Geneaid), gel agarose (Thermo scientific), larutan 1X TBE (Tris; boric acid; EDTA) (Thermo scientific), etidium bromida, 6X loading dye, 1 kb DNA ladder (Thermo scientific), buffer PCR, dNTPS, akuabidestilata (ddH2O) (Aqua pro injection), Taq DNA
Polymerase (Thermo Scientific), larutan buffer TE pH 8.
Ekstraksi DNA Total
Ektraksi DNA total tumbuhan pandan (Benstonea sp.) asal Riau dilakukan dengan menggunakan Genomic DNA Mini Kit Plant (Geneaid). Ekstraksi DNA total dimigrasikan pada 1% gel agarosa yang telah diberi 0,3 μg/ml etidium bromida menggunakan larutan buffer 1x TBE (pH 8). Elektroforesis DNA total dilakukan pada tegangan listrik 50 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan menggunakan UV transilluminator dan kamera digital berfilter UV.
PCR (Polymerase Chain Reaction) Primer yang digunakan untuk amplifikasi trnV-ndhC intergenic spacer ialah trnV(UAC)x2 F : 5’-GTC TAC GGT TCG ART CCG TA-3’ dan ndhC R : 5’-TAT TAT TAG AAA TGY CCA RAA AAT ATC ATA TTC-3’ (Shaw et al. 2007). Komponen PCR dengan DreamTaq DNA Polymerase (Thermo Scientific) terdiri dari 5,0 µl (1X) buffer PCR, 5,0 µl (0,2 mM) dNTPs, 2,5 µl (0,5 µM) primer forward, 2,5 µl (0,5 µM) primer reverse, 0,4 µl (5 U/µl) Taq DNA polimerase, 0,6 µl DNA pandan asal Riau dan 34,0 µl ddH2O.
Program PCR yang digunakan terdiri dari tahapan pra-PCR dengan suhu 94°C selama 5 menit, denaturasi dengan suhu 94°C selama 45 detik,
4 penempelan primer (annealing)
dilakukan dengan beberapa suhu optimasi yakni Tm rata-rata (53,2ºC), Tm-5 (48,2ºC) dan Tm-2 (51,2ºC).
Tahapan elongasi dengan suhu 68°C selama 1 menit 30 detik. Dan terakhir ialah tahapan pasca-PCR dengan suhu 68°C selama 10 menit.
Elektroforesis
Produk PCR dimigrasikan pada 1% gel agarosa yang telah diberi 0,3 μg/ml etidium bromida menggunakan larutan buffer 1x TBE (pH 8).
Elektroforesis DNA hasil PCR dilakukan pada tegangan listrik 50 volt selama 45 menit. Hasil elektroforesis divisualisasikan menggunakan UV transilluminator dan kamera digital berfilter UV.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Tahapan ekstraksi DNA terdiri dari tiga proses utama, yakni lisis sel, purifikasi dan presipitasi. Lisis sel merupakan suatu proses dalam ekstraksi DNA dengan menghancurkan membran sel sehingga DNA dapat bercampur dengan makromolekul sel yang lain. Purifikasi merupakan proses pemurnian DNA dari makromolekul sel yang lain seperti protein, lipid dan karbohidrat. Proses presipitasi merupakan proses yang dilakukan untuk menarik air dari DNA dengan menggunakan alkohol (Kamaliah 2017).
Hasil elektroforesis DNA total tanaman pandan (Benstonea sp.) asal Riau terlihat utuh yang ditandai dengan pita yang tebal dan jelas, serta tidak adanya smear pada pita DNA. Selain itu, pita DNA berukuran lebih dari 10.000 pb. Pita DNA yang terlihat tebal dan bersih merupakan ciri-ciri dari pita DNA yang berkualitas baik. Hasil elektroforesis yang baik dapat digunakan untuk proses analisis yang selanjutnya.
Tahapan selanjutnya ialah Polymerase Chain Reaction (PCR).
Teknik PCR merupakan suatu teknik amplifikasi DNA secara in vitro dengan adanya bantuan dari enzim DNA polimerase. Teknik PCR dapat mengamplifikasi potongan DNA dalam jumlah jutaan kali dalam waktu yang singkat.
Amplifikasi produk PCR menghasilkan DNA berukuran sekitar 1000 pb (Gambar 1.). Hasil amplifikasi tersebut sesuai dengan penelitian Shaw et al. (2007), dimana rata-rata panjang sekuen DNA dari trnV-ndhC intergenic spacer ialah 1146 pb dan berkisar dari 318-1800 pb.
Pita DNA muncul pada suhu annealing Tm-2 (51,2ºC) dan Tm-5 (48,2ºC), dimana pita yang dihasilkan terlihat tebal, jelas dan juga tegas.
Sedangkan pada suhu annealing Tm rata-rata (53,2ºC), tidak terlihat adanya pita DNA (Gambar 1.). Hal ini dapat disebabkan karena suhu tersebut terlalu tinggi sehingga primer yang
5 digunakan tidak dapat menempel pada
DNA target.
Gambar 1. Profil pita DNA hasil optimasi suhu annealing PCR menggunakan primer trnV-ndhC pada tumbuhan pandan (Benstonea sp.) asal Riau. M = 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific), B2R = Tm rata-rata (53,2ºC), B2-2 = Tm-2 (51,2ºC) dan B2-5 = Tm-5 (48,2ºC).
Menurut Handoyo dan Rudiretna (2001), suhu annealing yang terlalu rendah dari suhu optimum dapat menyebabkan terjadinya false priming dan suhu annealing yang terlalu tinggi dari suhu optimum dapat menyebabkan primer tidak dapat menempel pada DNA target sehingga proses PCR tidak berhasil. Tebal atau tipisnya pita DNA akan berpengaruh terhadap proses pengurutan nukleotida (sekuensing) (Nugraha et al. 2014).
Konsentrasi DNA merupakan faktor penting dalam reaksi amplifikasi.
Konsentrasi DNA yang terlalu rendah dapat mengurangi peluang penempelan primer kepada DNA cetakan.
Konsentrasi DNA yang terlalu tinggi dapat meningkatkan kontaminan (polisakarida, senyawa fenolik atau
kontaminan lain) yang mengganggu reaksi amplifikasi (Uslan dan Pharmawati 2015).
KESIMPULAN
Suhu annealing yang optimal dalam mengamplifikasi daerah trnV- ndhC intergenic spacer ialah pada suhu 51,2ºC dan 48,2ºC. Produk PCR yang diperoleh berukuran sekuen DNA sekitar 1000 pb.
UCAPAN TERIMAKASIH
Penulis mengucapkan terimakasih kepada Kementerian Riset, Teknologi
dan Pendidikan Tinggi
(Kemenristekdikti) Republik Indonesia, Direktorat Jenderal Riset dan Pengabdian kepada Masyarakat (DRPM) yang telah memberikan dukungan dana melalui Hibah Penelitian Dasar Unggulan Perguruan Tinggi (PDUPT) tahun 2019 a.n Dr.Dewi Indriyani Roslim, M.Si.
DAFTAR PUSTAKA
Elvyra R, Yus Y. 2010. Ikan Lais dan Sungai Paparan Banjir di Provinsi Riau. Pekanbaru: UR Press.
Handoyo D, Rudiretna A. 2000. Prinsip Umum dan Pelaksanaan Polymerase Chain Reaction (PCR). Unitas. 9(1):17-29.
Kamaliah. 2017. Perbandingan Metode Ekstraksi DNA Phenol- Chloroform dan Kit Extraction
6 pada Sapi Aceh dan Sapi Madura.
Jurnal Biotik. 5(1):60-65.
Korotkova N, Nauheimer L, Ter- Voskanyan H, Allgaier M, Borsch T. 2014. Variability among the Most Rapidly Evolving Plastid Genomic Regions is Lineage-Specific:
Implications of Pairwise Genome Comparisons in Pyrus (Rosaceae) and Other Angiosperms for Marker Choice.
Nasir. 2002. Bioteknologi Molekuler, Teknik Rekayasa Genetik Tanaman. Bandung: PT Citra Aditya Bakti.
Nugraha F, Roslim DI, Ardilla YP, Herman. 2014. Analisis Sebagian Sekuen Gen Ferritin2 pada Padi (Oryza sativa L.) Indragiri Hilir, Riau.
Shaw J, Lickey EB, Schilling EE, Small RL. 2007. Comparison of
Whole Chloroplast Genome Sequences to Choose Noncoding Regions for Phylogenetic Studies in Angiosperms: The Tortoise and The Hare III. American
Journal of Botany.
94(3):275:288.
Stoeckle MY, Catherine CG, Rohan K, Grace Y, Selena A, Damon PL.
2011. Commercial Teas Highlight Plant DNA Barcode Identification Successes and Obstacles.
Scientific Reports. 1(42):1-7.
Uslan, Pharmawati M. 2015. Optimasi Konsentrasi DNA dan MgCl2
pada Reaksi Polymerase Chain Reaction-Random Amplified Polymorphic DNA untuk Analisis Keragaman Genetik Tanaman Faloak (Sterculia quadrifida R.Br). Jurnal Bioslogos. 5(1): 26- 34.
