1 OPTIMASI SUHU ANNEALING UNTUK AMPLIFIKASI
DAERAH trnQ-5’rps16 INTERGENIC SPACER PADA TUMBUHAN PANDAN (Benstonea sp.) ASAL RIAU
Siti Nurhayati1, Dewi Indriyani Roslim2
1Mahasiswa Program Studi S1 Biologi
2Dosen Bidang Genetika Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau Kampus Bina Widya Pekanbaru 28293, Indonesia.
ABSTRACT
Pandan (Benstonea sp.) is one of the most important plant in Kajuik Lake located in Langgam, Riau Province, Indonesia. Polymerase Chain Reaction (PCR) is a technique used to multiply or amplify DNA samples in vitro using a primer pair.
This study aims to optimize annealing temperature of trnQ-5’rps16 intergenic spacer primer. Stages of research are total DNA isolation using Genomic DNA Mini Kit Plant (Geneaid), PCR and electrophoresis. The result showed that the optimal annealing temperature for amplification of trnQ-5’rps16 intergenic spacer is 58°C. The PCR product on this annealing temperature is thick.
Key Words: Annealing temperature, Benstonea sp., PCR, Riau, trnQ-5’rps16 intergenic spacer
ABSTRAK
Pandan (Benstonea sp.) merupakan salah satu tanaman penting yang terdapat di Danau Kajuik yang terletak di Langgam, Provinsi Riau, Indonesia. Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik yang digunakan untuk memperbanyak atau mengamplifikasi DNA sampel secara in vitro menggunakan primer. Primer trnQ-5’rps16 intergenic spacer merupakan sepasang primer yang digunakan untuk mengamplifikasi daerah trnQ-5’rps16 intergenic spacer. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan suhu annealing yang optimal untuk mengamplifikasi daerah trnQ-5’rps16 intergenic spacer. Tahapan penelitian yaitu isolasi DNA total menggunakan Genomic DNA Mini Kit Plant (Geneaid), Polymerase Chain Reaction (PCR) dan elektroforesis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa suhu yang optimal untuk mengamplifikasi daerah trnQ-5’rps16 intergenic spacer adalah 58°C pada TmR (Tm rata-rata). Hasil amplifikasi didapatkan pita DNA yang tebal dengan ukuran sekitar 950 pb.
Kata Kunci: Benstonea sp., PCR, Riau, suhu annealing, trnQ-5’rps16 intergenic spacer
PENDAHULUAN
Pandan (Benstonea sp.) merupakan salah satu tanaman penting yang terdapat di Danau Kajuik yang terletak di Langgam, Provinsi Riau, Indonesia. Pandan (Benstonea sp.) tumbuh di sekitar danau yang memiliki kemampuan beradaptasi terhadap penggenangan air dalam waktu yang relatif lama.
Polymerase Chain Reaction (PCR) merupakan teknik yang digunakan untuk memperbanyak atau mengamplifikasi DNA sampel secara in vitro (Maftuchah et al. 2014).
Menurut Ardiana (2009), proses PCR dapat memperbanyak sekuen DNA target yang ada pada DNA sampel.
Tahap PCR meliputi pre-PCR selama 5 menit pada suhu 94°C sebanyak 1 siklus, denaturasi selama 45 detik pada suhu 94°C, annealing atau penempelan primer selama 45 detik pada suhu 55°C dan elongasi selama 1 menit pada suhu 72°C.
Tahap tersebut (denaturasi, annealing dan elongasi) dilakukan sebanyak 35 siklus dan proses PCR diakhiri dengan tahapan pasca-PCR selama 10 menit pada 72°C (Roslim et al. 2018).
Banyak faktor yang menyebabkan kegagalan dalam PCR, salah satunya adalah proses denaturasi yang tidak sempurna.
Suhu denaturasi yang biasa dipakai adalah 95°C selama 30 detik atau 97°C selama 15 detik. Molekul DNA yang memiliki kandungan G+C tinggi, suhu yang digunakan lebih tinggi dan waktu yang digunakan juga diperpanjang dari biasanya (Subandiyah 2006).
Keberhasilan PCR juga dipengaruhi oleh suhu annealing (Ta) yaitu suhu dimana DNA cetakan berikatan dengan primer secara stabil. Suhu annealing yang tepat akan membantu primer untuk menempel pada fragmen DNA target (Sasmito et al. 2014). Primer merupakan oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas beberapa nukleotida atau basa.
Primer trnQ-5’rps16 intergenic spacer merupakan sepasang primer
yang digunakan untuk
mengamplifikasi daerah trnQ- 5’rps16 intergenic spacer. Shaw et.al (2007) telah berhasil mengamplifikasi daerah trnQ- 5’rps16 intergenic spacer menggunakan sepasang primer
trnQ(UUG) dan rps16x1 pada Angiosperm. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan suhu annealing yang optimal untuk mengamplifikasi daerah trnQ-5’rps16 intergenic spacer pada tumbuhan pandan (Benstonea sp.) asal Riau.
METODE PENELITIAN
Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2019–Maret 2020 di Laboratorium Genetika, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau. Pengambilan sampel dilakukan di Danau Kajuik, Kecamatan Langgam, Kabupaten Pelalawan, Provinsi Riau.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan digital (Accuris instrument), mortar, pastel, mesin sentrifus, freezer, hot plate, pipet mikro (Socorex dan VWR) dengan ukuran 10 µl, 200 µl, 1000 µl, tabung ukuran 1,5 ml dan 0,2 ml (Axygen), tip mikro (Axygen) dengan ukuran 10 µl, 200 µl, 1000 µl, waterbath, alat elektroforesis (Mupid eXu), mesin PCR (Hercuvan), kamera digital (Olympus
SP-500 UZ) dan UV transluminator (Benchmark).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun segar Benstonea sp. yang diambil dari Danau Kajuik, Kecamatan Langgam, Kabupaten Pelalawan, Provinsi Riau.
Bahan-bahan lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah kit isolasi DNA (Genomic DNA Mini Kit Plant (Geneaid) yang berisi GPX1 buffer, GP2 buffer, GP3 buffer, W1 buffer, wash buffer, ellution buffer dan RNAse), nitrogen cair, etanol absolut, akuades, akuabidestilata (ddH2O), 10X TBE (Tris-boric acid-EDTA), buffer TE pH 8, 5 µg/ml editium bromida, bubuk agarosa, 1X loading dye, 1 kb DNA ladder (Thermo Scientific), 2 mM dNTPs, 10 µM primer forward, 10 µM primer reverse, dan DNA Benstonea sp.
Isolasi DNA Total
DNA total tumbuhan pandan diekstraksi menggunakan Genomic DNA mini kit Plant (Geneaid).
Tahapan proses isolasi mengikuti prosedur yang telah ditetapkan berdasarkan instruksi pabrik.
Polymerase Chain Reaction (PCR) Molekul DNA total diamplifikasi dengan primer trnQ- 5’rps16 intergenic spacer menggunakan dream Taq DNA polymerase (Thermo Scientific).
Primer yang digunakan untuk proses amplifikasi trnQ-5’rps16 intergenic spacer adalah trnQ(UUG): 5’- GCG TGG CCA AGY GGT AAG GC- 3’
dan rps16x1: 5’- GTT GCT TTY TAC CAC ATC GTT T- 3’ (Shaw et al. 2007). Produk PCR diperkirakan berukuran 1000 pb. Optimasi suhu annealing untuk mengamplifikasi daerah trnQ-5’rps16 intergenic spacer dilakukan pada suhu: Tm (Temperature Melting) rata-rata (58,0°C) , Tm-5 (53,1°C) dan Tm-2 (56,3°C). Amplifikasi dilakukan dalam 50 µl reaksi PCR menggunakan Dream Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific).
Komponennya terdiri dari 5 µl (1X) buffer PCR, 5 µl (0,2 mM) dNTPs, 2 µl (0,4 µM) primer forward, 2 µl (0,4 µM) primer reverse, 0,4 µl (2 Unit) Taq DNA polimerase, 1 µl DNA Benstonea sp. dan 14,6 µl ddH2O.
Proses PCR meliputi pra-PCR pada suhu 95°C selama 5 menit
sebanyak 1 siklus, denaturasi pada suhu 95°C selama 45 detik, annealing (penempelan primer) pada suhu setelah dilakukan optimasi selama 45 detik dan elongasi (pemanjangan primer) pada suhu 72°C selama 1 menit 30 detik. Ketiga tahap tersebut diulang sebanyak 35 siklus. Proses terakhir PCR adalah pasca-PCR pada suhu 72°C selama 10 menit (Roslim et al. 2018).
Setelah diamplifikasi produk PCR dielektroforesis.
Elektroforesis
DNA total dimigrasikan di bawah pengaruh medan listrik untuk melihat kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh dengan menggunakan mesin elektroforesis. Elektroforesis DNA total dilakukan menggunakan 1% gel agarosa dalam 1X buffer TBE (Tris-Borid Acid-EDTA) pada pH 8.0 dan editium bromida sebanyak 0,3 µg/ml sebagai pewarna pita DNA.
Dimasukkan ke dalam masing- masing sumur dengan komposisi 2 µl loading dye + 2 µl DNA sampel.
Loading dye dimasukkan sebanyak 2 µl + 2 µl 1 kb DNA ladder. Setelah itu dilakukan proses elektroforesis dengan tegangan 50 volt selama 45 menit menggunakan mesin
elektroforesis. Kemudian hasil elektroforesis divisualisasi dengan UV transiluminator kemudian difoto menggunakan kamera.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini telah diperoleh DNA total dan telah digunakan untuk keperluan optimasi suhu annealing primer trnQ-5’rps16 intergenic spacer. Hasil amplifikasi diperiksa dengan elektroforesis.
Hasil elektroforesis dapat dilihat pada Gambar 1.
1000
M Tm R Tm -2 Tm -5
Gambar 1. Profil pita DNA hasil optimasi suhu annealing primer trnQ- 5’rps16 intergenic spacer pada tumbuhan pandan (Benstonea sp.) Keterangan: TmR=
Temperature Melting rata-rata (58,0°C), Tm- 5 = 53,1°C. Tm-2 = 56,3°C dan M = 1 kb DNA ladder (Thermo Scientific)
Hasil PCR daerah trnQ- 5’rps16 intergenic spacer memiliki ukuran sekitar 950 pb (Gambar 1).
Fragmen trnQ-5’rps16 intergenic spacer yang diperoleh pada
penelitian ini telah sesuai dengan ukuran fragmen yang diperoleh oleh Shaw et al. (2007) dengan kisaran ukuran 1000 pb. Menurut Settanni et al. (2006), keberhasilan amplifikasi DNA dapat dilihat dari hasil elektroforesis yang menunjukkan ukuran pita sesuai dengan ukuran yang diinginkan. Daerah trnQ- 5’rps16 intergenic spacer merupakan daerah yang memiliki variasi tinggi, hal ini dapat dibuktikan dengan hasil penelitian Buerki et al. (2016), yaitu bahwa trnQ-5’rps16 intergenic spacer memiliki sekuen terpanjang yaitu 1385pb.
Keberhasilan PCR
dipengaruhi oleh suhu annealing (Ta) yaitu suhu dimana DNA cetakan berikatan dengan primer secara stabil. Ketika berikatan secara stabil maka akan membantu primer untuk menempel pada fragmen DNA target (Sasmito et al. 2014). Suhu annealing dihitung berdasarkan nilai rata-rata Tm primer forward dan reverse. Setelah dilakukan penelitian, suhu annealing yang cocok untuk daerah trnQ-5’rps16 intergenic spacer adalah suhu 58°C pada TmR.
Untuk hasil PCR yang digunakan untuk tahap sekuensing adalah TmR.
Menurut Sunandar dan Imron (2010), keberhasilan amplifikasi dalam reaksi PCR ditentukan oleh primer oligonukleotida yang menempel dan menyatu dengan fragmen DNA cetakan. Primer akan menempel pada DNA genom yang memiliki susunan nukleotida yang komplemen. Keberhasilan ampifikasi juga dipengaruhi oleh volume dan konsentrasi komponen dalam reaksi PCR (Sambrook dan Russell 2001).
Amplifikasi PCR dalam penelitian ini berhasil dilakukan karena menggunakan primer dan suhu annealing yang sesuai dengan DNA cetakan, sehingga produk hasil PCR dapat dilanjutkan ke tahap sekuensing.
KESIMPULAN
Suhu annealing yang optimal untuk mengamplifikasi daerah trnQ- 5’rps16 intergenic spacer adalah suhu 58°C pada TmR (Tm rata-rata).
Hasil amplifikasi didapatkan daerah trnQ-5’rps16 intergenic spacer berukuran sekitar 950 pb.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terima kasih penulis sampaikan kepada Direktorat Jenderal Riset dan Pengabdian kepada Masyarakat (DRPM) yang telah memberikan dukungan dana melalui Hibah Penelitian Dasar Unggulan Perguruan Tinggi (PDUPT) tahun 2019 a.n Dr. Dewi Indriyani Roslim, M.Si.
DAFTAR PUSTAKA
Ardiana DW. 2009. Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya
dan Jeruk dengan
Menggunakan Modifikasi Buffer CTAB. Buletin Teknik Pertanian 14 (1): 12-16.
Buerki S, Gallaher T, Booth T, Brewer G, Forest F, Pereira JT, Callmander MW 2016.
Biogeography and evolution of the screw- pine genus Benstonea Callm. & Buerki (Pandanaceae). Candollea 71(2): 217-229.
Maftuchah, Winaya A, Zainuddin A.
2014. Teknik Dasar Analisis
Biologi Molekuler.
Yogyakarta: Penerbit Deepublish.
Roslim DI, Nuryani N, Herman.
2018. Sekuen Penyandi 18S Ribosomal RNA dan Ubiquitin pada Pandanus sp Asal Riau.
Jurnal Bioslogos 8 (1): 1- 8.
Sambrook J, Russell DW. 2001.
Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd ed.
New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sasmito DEK, Kurniawan R, Muhimmah I. 2014.
Karakteristik Primer Pada Polymerase Chain Reaction (PCR) Untuk Sekuensing DNA: mini review. Di dalam:
Seminar Nasional Informtika
Medis (SNIMed) V.
Yogyakarta: Magister Teknik Informatika, Fakultas Teknologi Industri, Universitas Islam Indonesia. Hlm. 93 – 102.
Settani L, Valmorri S, Sinderen D, Suzzi G, Paparella A, Corsetti A. 2006. Combination of Multiplex PCR and PCR- denaturing Gradient Gel Electrophoresis For Monitoring
Common Sourdough-
associated lactobacillus Species. Aplication Environ Microbiology 72(5): 3793- 3796.
Shaw J, Lickey EB, Schilling EE, Small RL. 2007. Comparison of Whole Chloroplast Genome Sequence to Choose Noncoding Regions for Phylogenetic Studies in Angiosperms: the Tortoise and the Hare III. American Journal of Botany 94 (3): 275-288.
Subandiyah S. 2006. Polymerase Chain Reaction untuk Deteksi atau Identifikasi Patogen Tumbuhan. Beberapa Metode Ekstraksi DNA. Malang:
Pelatihan dan Workshop Identifikasi DNA dengan Aplikasi PCR (43-50).
Sunandar D, Imron.
2010.Optimalisasi Template DNA GenomUdang Galah, Macrobrachium rosenbergii dalam proses PCR-RAPD.
Loka Riset dan Teknologi Budidaya Perikanan Air Tawar.
