1 OPTIMASI SUHU ANNEALING UNTUK AMPLIFIKASI
DAERAH trnQ-5’ rps16 INTERGENIC SPACER PADA TUMBUHAN PANDAN (Benstonea sp.) ASAL RIAU
Siti Nurhayati1, Dewi Indriyani Roslim2 1
Mahasiswa Program Studi S1 Biologi 2
Dosen Bidang Genetika Jurusan Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau Kampus Bina Widya Pekanbaru 28293, Indonesia.
siti.nurhayati0967@student.unri.ac.id
ABSTRACT
Pandan (Benstonea sp.) is one of the most important plant in Kajuik Lake located in Langgam, Riau Province, Indonesia. Polymerase Chain Reaction (PCR) is a technique used to multiply or amplify DNA samples in vitro using a primer pair.
5’ rps16 intergenic spacer is a pair of primers used to amplify the trnQ-5’ rps16 intergenic spacer region. This study aimed to optimize annealing
temperature of trnQ-5’ rps16 intergenic spacer primer. This research invloved total DNA isolation using Genomic DNA Mini Kit Plant (Geneaid), PCR, and electrophoresis. The result showed that the optimal annealing temperature for amplification of trnQ-5’ rps16 intergenic spacer was 58°C. The PCR product on this annealing temperature was thick DNA with a size of about 950 bp .
Key Words: Annealing, Benstonea sp., PCR, Riau, trnQ-5’ rps16 intergenic
spacer
ABSTRAK
Pandan (Benstonea sp.) merupakan salah satu tanaman penting yang terdapat di Danau Kajuik yang terletak di Langgam, Provinsi Riau, Indonesia. Polymerase
Chain Reaction (PCR) merupakan teknik yang digunakan untuk memperbanyak
atau mengamplifikasi DNA sampel secara in vitro menggunakan primer. Primer
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer merupakan sepasang primer yang digunakan
untuk mengamplifikasi daerah trnQ-5’ rps16 intergenic spacer. Penelitian ini bertujuan untuk menentukan suhu annealing yang optimal untuk mengamplifikasi daerah trnQ-5’ rps16 intergenic spacer. Tahapan penelitian yaitu isolasi DNA total menggunakan Genomic DNA Mini Kit Plant (Geneaid), Polymerase Chain
Reaction (PCR) dan elektroforesis. Hasil penelitian menunjukkan bahwa suhu
yang optimal untuk mengamplifikasi daerah trnQ-5’ rps16 intergenic spacer adalah 58°C pada TmR (Tm rata-rata). Hasil amplifikasi didapatkan pita DNA yang tebal dengan ukuran sekitar 950 pb.
Kata Kunci: Annealing, Benstonea sp., PCR, Riau, trnQ-5’ rps16 intergenic
PENDAHULUAN
Pandan (Benstonea sp.)
merupakan salah satu tanaman penting yang terdapat di Danau Kajuik yang terletak di Langgam, Provinsi Riau, Indonesia. Pandan (Benstonea sp.) tumbuh di sekitar danau yang memiliki kemampuan beradaptasi terhadap penggenangan air dalam waktu yang relatif lama (Roslim 2017).
Polymerase Chain Reaction
(PCR) merupakan teknik yang
digunakan untuk memperbanyak atau mengamplifikasi DNA sampel secara
in vitro (Maftuchah et al. 2014).
Menurut Ardiana (2009), proses PCR dapat memperbanyak sekuen DNA target yang ada pada DNA sampel.
Tahap PCR meliputi pre-PCR selama 5 menit pada suhu 94°C sebanyak 1 siklus, denaturasi selama 45 detik pada suhu 94°C, annealing atau penempelan primer selama 45 detik pada suhu 55°C dan elongasi selama 1 menit pada suhu 72°C.
Tahap tersebut (denaturasi,
annealing dan elongasi) dilakukan
sebanyak 35 siklus dan proses PCR diakhiri dengan tahapan pasca-PCR selama 10 menit pada 72°C (Roslim
et al. 2018).
Banyak faktor yang
menyebabkan kegagalan dalam PCR,
salah satunya adalah proses
denaturasi yang tidak sempurna. Suhu denaturasi yang biasa dipakai adalah 95°C selama 30 detik atau 97°C selama 15 detik. Molekul DNA yang memiliki kandungan G+C tinggi, suhu yang digunakan lebih tinggi dan waktu yang digunakan juga diperpanjang dari biasanya (Subandiyah 2006).
Keberhasilan PCR juga
dipengaruhi oleh suhu annealing (Ta) yaitu suhu dimana DNA cetakan berikatan dengan primer secara stabil. Suhu annealing yang tepat
akan membantu primer untuk
menempel pada fragmen DNA target (Sasmito et al. 2014). Primer merupakan oligonukleotida untai tunggal yang terdiri atas beberapa nukleotida atau basa.
Primer trnQ-5’ rps16 intergenic
spacer merupakan sepasang primer
yang digunakan untuk
mengamplifikasi daerah
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer. Shaw et
al. (2007) telah berhasil
mengamplifikasi daerah
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer
trnQ(UUG) dan rps16x1 pada Angiosperm. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan suhu annealing yang optimal untuk mengamplifikasi daerah trnQ-5’ rps16 intergenic
spacer pada tumbuhan pandan
(Benstonea sp.) asal Riau. METODE PENELITIAN
Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2019– Maret 2020 di Laboratorium Genetika, Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau. Pengambilan sampel dilakukan
di Danau Kajuik, Kecamatan
Langgam, Kabupaten Pelalawan, Provinsi Riau.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah timbangan digital (Accuris instrument), mortar, pastel, mesin sentrifus, freezer, hot
plate, pipet mikro (Socorex dan
VWR) dengan ukuran 10 µl, 200 µl, 1000 µl, tabung ukuran 1,5 ml dan 0,2 ml (Axygen), tip mikro (Axygen) dengan ukuran 10 µl, 200 µl, 1000 µl, waterbath, alat elektroforesis
(Mupid eXu), mesin PCR
(Hercuvan), kamera digital (Olympus
SP-500 UZ) dan UV transluminator (Benchmark).
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun segar
Benstonea sp. yang diambil dari
Danau Kajuik, Kecamatan Langgam, Kabupaten Pelalawan, Provinsi Riau. Bahan-bahan lain yang digunakan dalam penelitian ini adalah kit isolasi DNA (Genomic DNA Mini Kit Plant (Geneaid) yang berisi GPX1 buffer, GP2 buffer, GP3 buffer, W1 buffer,
wash buffer, ellution buffer dan RNAse), nitrogen cair, etanol absolut,
akuades, akuabidestilata (ddH2O),
10X TBE (Tris-boric acid-EDTA),
buffer TE pH 8, 0,3 µg/ml editium
bromida, bubuk agarosa, 1X loading
dye, 1 kb DNA ladder (Thermo Scientific), 2 mM dNTPs, 10 µM
primer forward, 10 µM primer
reverse, dan DNA Benstonea sp.
Isolasi DNA Total
DNA total tumbuhan pandan diekstraksi menggunakan Genomic
DNA mini kit Plant (Geneaid).
Tahapan proses isolasi mengikuti prosedur yang telah ditetapkan berdasarkan instruksi pabrik.
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Molekul DNA total
diamplifikasi dengan primer
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer
menggunakan dream Taq DNA
polymerase (Thermo Scientific).
Primer yang digunakan untuk proses amplifikasi trnQ-5’ rps16 intergenic
spacer adalah trnQ(UUG): 5’ - GCG
TGG CCA AGY GGT AAG GC- 3’ dan rps16x1: 5’ - GTT GCT TTY TAC CAC ATC GTT T- 3’ (Shaw
et al. 2007). Produk PCR
diperkirakan berukuran 1000 pb. Optimasi suhu annealing untuk
mengamplifikasi daerah
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer dilakukan
pada suhu: Tm (Temperature
Melting) rata-rata (58,0°C) , Tm-5
(53,1°C) dan Tm-2 (56,3°C).
Amplifikasi dilakukan dalam 50 µl reaksi PCR menggunakan Dream
Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific). Komponennya terdiri dari
5 µl (1X) buffer PCR, 5 µl (0,2 mM) dNTPs, 2 µl (0,4 µM) primer
forward, 2 µl (0,4 µM) primer reverse, 0,4 µl (2 Unit) Taq DNA polimerase, 1 µl DNA Benstonea sp.
dan 14,6 µl ddH2O.
Proses PCR meliputi pra-PCR pada suhu 95°C selama 5 menit
sebanyak 1 siklus, denaturasi pada
suhu 95°C selama 45 detik,
annealing (penempelan primer) pada
suhu setelah dilakukan optimasi selama 45 detik dan elongasi (pemanjangan primer) pada suhu 72°C selama 1 menit 30 detik. Ketiga tahap tersebut diulang sebanyak 35 siklus. Proses terakhir PCR adalah pasca-PCR pada suhu 72°C selama 10 menit (Roslim et al. 2018). Setelah diamplifikasi produk PCR dielektroforesis.
Elektroforesis
DNA total dimigrasikan di bawah pengaruh medan listrik untuk melihat kualitas dan kuantitas DNA yang diperoleh dengan menggunakan mesin elektroforesis. Elektroforesis DNA total dilakukan menggunakan 1% gel agarosa dalam 1X buffer TBE (Tris-Borid Acid-EDTA) pada pH 8.0 dan editium bromida sebanyak 0,3 µg/ml sebagai pewarna pita DNA. Dimasukkan ke dalam masing-masing sumur dengan komposisi 2 µl
loading dye + 2 µl DNA sampel. Loading dye dimasukkan sebanyak 2
µl + 2 µl 1 kb DNA ladder. Setelah itu dilakukan proses elektroforesis dengan tegangan 50 volt selama 45
elektroforesis. Kemudian hasil elektroforesis divisualisasi dengan UV transiluminator kemudian difoto menggunakan kamera.
HASIL DAN PEMBAHASAN Pada penelitian ini telah diperoleh DNA total dan telah digunakan untuk keperluan optimasi
suhu annealing primer
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer. Hasil
amplifikasi diperiksa dengan
elektroforesis. Hasil elektroforesis dapat dilihat pada Gambar 1.
1000
M Tm R Tm -2 Tm -5
Gambar 1. Profil pita DNA hasil
optimasi suhu
annealing primer
trnQ-5’ rps16 intergenic
spacer pada tumbuhan
pandan (Benstonea sp.) Keterangan: TmR= Temperature Melting rata-rata (58,0°C), Tm-5 = Tm-53,1°C. Tm-2 = 56,3°C dan M = 1 kb DNA ladder (Thermo
Scientific)
Hasil PCR daerah
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer memiliki
ukuran sekitar 950 pb (Gambar 1). Fragmen trnQ-5’ rps16 intergenic
spacer yang diperoleh pada
penelitian ini telah sesuai dengan ukuran fragmen yang diperoleh oleh Shaw et al. (2007) dengan kisaran ukuran 1000 pb. Daerah
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer
merupakan daerah yang memiliki variasi tinggi, hal ini dapat dibuktikan dengan hasil penelitian Buerki et al. (2016), yaitu bahwa
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer
memiliki sekuen terpanjang yaitu 1385pb.
Keberhasilan PCR
dipengaruhi oleh suhu annealing (Ta) yaitu suhu dimana DNA cetakan berikatan dengan primer secara stabil. Ketika berikatan secara stabil maka akan membantu primer untuk menempel pada fragmen DNA target (Sasmito et al. 2014). Suhu
annealing dihitung berdasarkan nilai
rata-rata Tm primer forward dan
reverse. Setelah dilakukan penelitian,
suhu annealing yang cocok untuk daerah trnQ-5’ rps16 intergenic spacer adalah suhu 58°C pada TmR.
Untuk hasil PCR yang digunakan untuk tahap sekuensing adalah TmR.
Menurut Sunandar dan Imron (2010), keberhasilan amplifikasi dalam reaksi PCR ditentukan oleh
menempel dan menyatu dengan fragmen DNA cetakan. Primer akan menempel pada DNA genom yang memiliki susunan nukleotida yang komplemen. Keberhasilan ampifikasi juga dipengaruhi oleh volume dan konsentrasi komponen dalam reaksi PCR (Sambrook dan Russell 2001). Amplifikasi PCR dalam penelitian ini berhasil dilakukan karena menggunakan primer dan suhu
annealing yang sesuai dengan DNA
cetakan, sehingga produk hasil PCR
dapat dilanjutkan ke tahap
sekuensing.
KESIMPULAN
Suhu annealing yang optimal untuk mengamplifikasi daerah
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer adalah
suhu 58°C pada TmR (Tm rata-rata). Hasil amplifikasi didapatkan daerah
trnQ-5’ rps16 intergenic spacer
berukuran sekitar 950 pb.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terima kasih penulis
sampaikan kepada Direktorat
Jenderal Riset dan Pengabdian kepada Masyarakat (DRPM) yang telah memberikan dukungan dana
melalui Hibah Penelitian Dasar
Unggulan Perguruan Tinggi
(PDUPT) tahun 2019 a.n Dr. Dewi Indriyani Roslim, M.Si.
DAFTAR PUSTAKA
Ardiana DW. 2009. Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya
dan Jeruk dengan
Menggunakan Modifikasi
Buffer CTAB. Buletin Teknik
Pertanian 14 (1): 12-16.
Buerki S, Gallaher T, Booth T, Brewer G, Forest F, Pereira JT,
Callmander MW 2016.
Biogeography and evolution of
the screw- pine genus
Benstonea Callm. & Buerki
(Pandanaceae). Candollea
71(2): 217-229.
Maftuchah, Winaya A, Zainuddin A. 2014. Teknik Dasar Analisis
Biologi Molekuler.
Yogyakarta: Penerbit
Deepublish.
Roslim DI. 2017. Identification of Pandan Plant (Benstonea sp) From Riau, Indonesia Using
Three DNA Barcodes.
SABRAO Journal of Breeding
and Genetics 49 (4): 346-360.
Roslim DI, Nuryani N, Herman. 2018. Sekuen Penyandi 18S Ribosomal RNA dan Ubiquitin pada Pandanus sp Asal Riau.
Jurnal Bioslogos 8 (1): 1- 8.
Sambrook J, Russell DW. 2001.
Molecular Cloning: A
Laboratory Manual 3rd ed.
New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
Sasmito DEK, Kurniawan R,
Muhimmah I. 2014.
Karakteristik Primer Pada
Polymerase Chain Reaction
(PCR) Untuk Sekuensing
DNA: mini review. Di dalam:
Seminar Nasional Informtika
Medis (SNIMed) V.
Yogyakarta: Magister Teknik
Informatika, Fakultas
Teknologi Industri, Universitas Islam Indonesia. Hlm. 93 – 102.
Shaw J, Lickey EB, Schilling EE, Small RL. 2007. Comparison of Whole Chloroplast Genome
Sequence to Choose
Noncoding Regions for
Phylogenetic Studies in
Angiosperms: the Tortoise and the Hare III. American Journal
of Botany 94 (3): 275-288.
Subandiyah S. 2006. Polymerase
Chain Reaction untuk Deteksi
atau Identifikasi Patogen
Tumbuhan. Beberapa Metode
Ekstraksi DNA. Malang:
Pelatihan dan Workshop
Identifikasi DNA dengan
Aplikasi PCR (43-50).
Sunandar D, Imron.
2010.Optimalisasi Template
DNA GenomUdang Galah,
Macrobrachium rosenbergii
dalam proses PCR-RAPD.
Loka Riset dan Teknologi
Budidaya Perikanan Air
