ISOLASI DNA DAN AMPLIFIKASI GEN COX3 PADA IKAN SELAIS KAPOREH (Ompok eugeneiatus Vaillant 1893) DARI SUNGAI KAMPAR, PROVINSI RIAU

ISOLASI DNA DAN AMPLIFIKASI GEN COX3 PADA IKAN SELAIS KAPOREH (Ompok eugeneiatus Vaillant 1893) DARI

SUNGAI KAMPAR, PROVINSI RIAU

Tiurma Rosinta Siagian

¹

, Roza Elvyra

²

, Dewi Indriyani Roslim

³

1

Mahasiswa Program S1 Biologi

2

Dosen Bidang Zoologi Jurusan Biologi

3

Dosen Bidang Genetika Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Kampus BinaWidya Pekanbaru, 28293, Indonesia tiurmarosinta@gmail.com

ABSTRACT

Selais Kaporeh (Ompok eugeneiatus) is an endemic fish in floodplain river. The genetic information of Ompok eugeneiatus is still limited. This research aims to isolate and amplify Cytochrome c Oxydase sub unit 3 (COX3) gene from Ompok eugeneiatus originated from Kampar River. This study was conducted from November 2014 to April 2015. Cytochrome c Oxydase sub unit 3 gene was amplified using COX3-F1 and COX3-R1 primers which were design from COX3 gene of Ictalurus punctatus (GenBank 2004). PCR condition based on Elvyra and Duryadi (2007) with modification. The result indicated that COX3-F1 and COX3-R1 primers can be used to amplify COX3 gene of Ompok eugeneiatus with size of 642 bp.

Keywords : Amplify, gen COX3, isolate, Ompok eugeneiatus

ABSTRAK

Ikan selais kaporeh (Ompok eugeneiatus) merupakan ikan endemik di sungai paparan banjir. Informasi genetik pada Ompok eugeneiatus masih terbatas. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengamplifikasi gen Cytochrome c Oxydase sub unit 3 (COX3) dari Ompok eugeneiatus yang berasal dari Sungai Kampar. Penelitian dilakukan pada November 2014 sampai April 2015. Gen Cytochrome c Oxydase sub unit 3 diamplifikasi menggunakan primer COX3-F1 dan COX3-R1 yang didisain dari gen COX3 pada Ictalurus punctatus (GenBank 2004). Kondisi PCR berdasar pada Elvyra and Duryadi (2007) dengan modifikasi. Hasil menunjukkan bahwa primer COX3-F1 dan COX3-R1 dapat digunakan untuk mengamplifikasi gen COX3 pada Ompok eugeneiatus dengan ukuran 642 pb.

Kata kunci : Amplifikasi, gen COX3, isolasi, Ompok eugeneiatus

PENDAHULUAN

Provinsi Riau memiliki empat sungai besar, salah satunya Sungai Kampar.

Sungai di Riau memiliki ekosistem rawa banjiran yang dikenal juga dengan istilah sungai paparan banjir atau floodplain river (Elvyra 2009). Sungai paparan banjir atau rawa banjiran di Riau memiliki karakteristik yang sangat unik dan khas. Karakteristik sungai paparan banjir yang unik dan khas ini menyebabkan ditemukannya beberapa jenis ikan yang hidup secara endemik di sungai paparan banjir saja. Salah satu jenis ikan pada sungai paparan banjir yang dikenal oleh masyarakat Riau adalah ikan selais kaporeh (Ompok eugeneiatus).

Ikan selais kaporeh sangat digemari oleh masyarakat dan bernilai ekonomis yang tinggi (Elvyra & Yus 2012).

Karena bernilai ekonomi tinggi, eksploitasi terhadap ikan ini sering terjadi. Eksploitasi ikan selais kaporeh akan mengakibatkan populasi ikan ini semakinmenurun dan terancam keberadaannya. Berdasarkan kondisi tersebut perlu dilakukan upaya konservasi ikan selais kaporeh (O.

eugeneiatus). Dalam upaya konservasi, identifikasi terhadap selais kaporeh berdasarkan pada karakter morfologi dan molekuler sangat diperlukan. Namun saat ini, identifikasi yang dilakukan masih terbatas pada morfologi saja.

Usaha tersebut akan lebih terarah dan berhasil, apabila informasi kajian molekuler pada O. eugeneiatus digali lebih dalam dan rinci.

Penelitian secara molekuler yang telah dilakukan pada ikan selais hanya menggunakan gen Cytb DNA mitokondria (Elvyra & Duryadi 2007;

Yus & Elvyra 2007; Elvyra 2009), gen COX1 (Elvyra & Duryadi 2013), dan D- Loop mtDNA (Tasiah 2014). Data dari hasil penelitian tersebut memberikan peluang untuk melanjutkan penelitian,

yaitu isolasi dan mengamplifikasi gen

COX3 pada ikan selais kaporeh (Ompok eugeneiatus).

METODE PENELITIAN

Penelitian dilakukan dari bulan November 2014 sampai April 2015 dengan lokasi pengambilan sampel di Sungai Kampar.

a. Alat dan Bahan Penelitian

Alat yang digunakan pada penelitian ini adalah gunting, pinset, pestel kaca, alumunium foil, tabung mikro ukuran 0,2 ml dan 1,5 ml, rak tabung mikro, pipet mikro, tip pipet ukuran 20 µl, 200 µl dan 1000 µl, mesin sentrifus, vorteks, inkubator,mesin elektroforesis horizontal (Fison Mode FEC 360 Large horizontal Gel System), sisir dan cetakan agarose, parafilm, gelas ukur, timbangan analitik, hot plate, UV transluminator, kamera, mesin PCR, dan mesin perunutan DNA.

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan selais kaporeh (Ompok eugeneiatus), Kit isolasi dan PCR (Qiagen Dneasy Blood & Tissue), primer COX3-F1 (5’- CCA CCA AGC ACA TGC ATA C -3’) dan primer COX3-R1 (5’- CGA ATC CAA AGT GGT GTT CT -3’), buffer TE dan TBE, bubuk agarose, etidium bromida, loading dye, dan DNA ladder.

b. Isolasi DNA Total

Isolasi DNA merupakan suatu proses

memisahkan DNA dari bahan penyusun

karbohidrat dengan tujuan untuk mendapatkan DNA murni.Proses isolasi DNA menggunakan Kit isolasi merk Qiagen Dneasy Blood & Tissue dengan rangkaian proses sesuai petunjuk pabrik.

Sampel otot ikan selais kaporeh yang sudah dicuci dengan 1X TE, ditambahkan dengan 180 µl buffer ATL, 20 µl proteinase K, dan etanol absolut untuk melisiskan sel. Sampel otot ikan selais kaporeh yang telah lisis secara sempurna, ditambahkan 200 µl buffer AL, 500 µl buffer AW1, dan 500 µl buffer AW2. Selanjutnya ditambahkan buffer AE untuk mengelusi DNA.

Molekul DNA yang diperoleh disimpan dalam freezer dan siap digunakan sebagai DNA cetakan dalam proses amplifikasi gen COX3.

c. Amplifikasi Gen COX3 dengan PCR

Amplifikasi gen COX3

menggunakan teknik PCR. Proses PCR menggunakan sepasang primer, yaitu COX3-F1 dan COX3-R1. Primer didisain dengan program Primer3 Output menggunakan referensi sekuen utuh gen COX3 Ictalurus punctatus (GenBank 2004), dengan kondisi PCR menurut Elvyra dan Duryadi (2007) dengan sedikit modifikasi.

HASIL DAN PEMBAHASAN a. Isolasi DNA Total

Sepuluh sampel ikan selais (Ompok eugeneiatus) dari Sungai Kampar diisolasi dan menghasilkan pita DNA yang berbeda-beda. DNA total hasil isolasi disajikan pada Gambar 1.

Gambar 1 Profil DNA total Ompok eugeneiatus dari Sungai Kampar

Penggunaan Kit isolasi dalam ekstraksi DNA menjadikan proses isolasi cukup mudah, cepat, sederhana. Namun penggunaan Kit dalam proses isolasi DNA tidak menjamin akan diperoleh DNA total dengan kualitas yang baik.

Dari 10 DNA total, hanya ada 7 DNA dengan kualitas yang baik, yaitu OE 1, OE2, OE3, OE4, OE5, OE8, dan OE9.

Molekul DNA total dikatakan baik, apabila DNA tersebut menunjukkan pita tebal, tegas, dan tidak terdapat smear (DNA terfragmentasi atau tidak utuh).

Pita DNA yang tebal menunjukkan konsentrasi DNA total yang diperoleh cukup tinggi.

b. Amplifikasi Gen COX3 dengan PCR

DNA total yang diperoleh dari

proses isolasi digunakan sebagai cetakan

untuk amplifikasi DNA daerah penyandi

gen Cytochrome c Oxydase sub unit 3

dari O. eugeneiatus. Proses amplifikasi

berhasil mendapatkan daerah gen COX3

sepanjang 675 pb. Profil daerah gen

COX3 pada ikan selais kaporeh (Ompok

eugeneiatus) hasil amplifikasi disajikan

pada Gambar 2.

Gambar 2 Profil DNA O. eugeneiatus dari S. Kamparhasil amplifikasi menggunakan pasangan primer COX3-F1 dan COX3-R1.

Proses amplifikasi 13 sampel DNA total O. eugeneiatus menghasilkan satu fragmen, hal ini menunjukkan proses amplifikasi berjalan dengan baik meskipun pita yang dihasilkan memiliki ketebalan yang berbeda. Ilustrasi hasil amplifikasi yaitu letak penempelan pasangan primer COX3-F1 dan COX3- R1 pada daerah gen COX3 dari ikan selais kaporeh (Ompok eugeneiatus) disajikan pada Gambar 3.

Produk PCR hasil amplifikasi pasangan primer COX3-F1 menempel pada posisi ke 58 sampai dengan 76 dan primer COX3-R1 menempel pada posisi basa ke 680 sampai dengan 699

Ictalurus punctatus yang memiliki panjang 786 nukleotida (GenBank 2004).

Bagian runutan fragmen yang tidak terbaca yaitu 57 nukleotida dari ujung 3’

primer COX-F1 dan 86 nukleotida dari ujung 5’ primer COX3-R1 (Gambar 3).

Panjang daerah gen COX3 setelah dilakukan pensejajaran dengan data pembanding (I. punctatus) adalah 642 pb.

Keberhasilan proses amplifikasi dipengaruhi oleh beberapa faktor, seperti konsentrasi DNA, panjang primer, komposisi basa primer, dan temperature hibridisasi primer (kondisi PCR), agar pita-pita yang diperoleh utuh dan baik (Wilhelm et al. 2003)

KESIMPULAN

Isolasi DNA total Ompok eugeneiatus menghasilkan pita dengan kualitas dan kuantitas yang berbeda- beda. Primer COX3-F1 dan COX3-R1 dapat digunakan untuk mengamplifikasi gen COX3 pada Ompok eugeneiatus dengan ukuran 642 pb.

UCAPAN TERIMAKASIH

Penulis mengucapkan terima kasih kepada DIKTI atas pendanaan penelitian melalui Hibah Kompetensi tahun Gambar 3. Skema posisi penempelan primer COX3-F1 dan COX3-R1 pada gen

COX3 O. eugeneiatus yang teramplifikasi, dengan acuan gen COX3

utuh I. punctatus data GenBank (786 pb)

anggaran 2015 a/n Dr. Roza Elvyra, M.Si.

DAFTAR PUSTAKA

Elvyra R, Duryadi D. 2007. Kajian penanda genetik gen sitokrom b DNA mitokondria ikan lais dari Sungai Kampar Riau. J Natur Ind 10:6 – 12.

Elvyra R, Duryadi D. 2013. The characteristic mitochondrial cytochrome c oksidase sub unit 1 gene of Kryptopterus apogon (Bleeker 1851). International Seminar of Fisheries and Marine 2:124-127.

Elvyra R, Yus Y. 2012. Ikan Lais dan Sungai Paparan Banjir di Provinsi Riau. Pekanbaru:

Universitas Riau press.

Elvyra R. 2009. Kajian keanekaragaman genetik dan biologi reproduksi ikan lais di Sungai Kampar Riau [Disertasi]. Bogor. Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

GenBank. 2004. Ictalurus punctatus mitochondrion, complete genome.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuc core/NC_00389. [21 September 2014].

Tasiah. 2014. Analisis penanda genetik spesifik berbasis daerah D-Loop pada ikan selais Ompok eugeneiatus (Vaillant 1893) dari Sungai Kampar Kiri dan Indragiri

Hulu, Provinsi Riau [skripsi].

Pekanbaru: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Riau.

Yus Y, Elvyra R. 2007.

Keanekaragaman genetika ikan lais Kryptopterus spp. dari provinsi Riau berdasarkan sitokrom b DNA mitokondria.

Laporan Penelitian Fundamental.

Universitas Riau.

Wilhelm J, Pingoud A, Hahn M. 2003.

Real-time PCR-based method for

the estimation of genome sizes. J

Nucleic Acids. 31:319-327.