II. METODE PENELITIAN
A. Materi dan Deskripsi Lokasi 1. Bahan
Bahan yang diperlukan dalam penelitian ini adalah daun 10 kultivar kacang tanah (kultivar Bima, Hypoma1, Hypoma2, Kancil, Kelinci, Talam, Tuban, Domba, Jerapah, dan Bison). Kemikalia yang diperlukan xylol, alkohol 96%, ethanol, asam asetat glasial, parafin, formalin, gliserin, albumin, safranin 1% dalam alkohol 70%, akuades, entellan, dan kutek bening (Lampiran 1).
2. Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah mikroskop binokuler, kamera digital, gelas ukur, gelas Beaker, gelas Erlenmeyer, oven, pipet, pinset, silet, botol vial, rotary microtom, penggaris, holder, baki, mikrometer obyektif, mikrometer okuler, kertas karton, square micrometer, gelas benda, gelas penutup, hot plate dan kertas label (Lampiran 1).
3. Deskripsi Lokasi
Daun kacang tanah diambil di persawahan Sumampir, Kecamatan Purwokerto Utara, Kabupaten Banyumas. Pengamatan dilakukan di Laboratorium Struktur dan Perkembangan Tumbuhan Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman. Penelitian ini dilaksanakan selama 4 bulan, dimulai pada bulan November 2013-Februari 2014.
B. Bagan Alir Penelitian
Pemeliharaan tanaman kacang tanah
Pengambilan sampel daun kacang tanah umur 2 bulan
Pembuatan preparat segar daun Pembuatan preparat awetan daun
Menghitung jumlah stomata dan trikomata serta ukuran stomata (panjang dan lebar)
Mengukur tebal daun dan tebal mesofil
Penanaman bibit kacang tanah
Fiksasi Dehidrasi Dealkoholisasi Infiltrasi
Penyelubungan Pengirisan Perekatan Pewarnaan
Penutupan
Sampel daun kacang tanah dipotong 1x1 cm
Larutan Fiksatif FAA dalam alkohol 70% @ 24 jam
Alkohol bertingkat 70%, 80%, 96% dan ethanol @ 30 menit
Alkohol/xylol 3:1, 1:1, 1:3 @ 30 menit
Xylol/paraffin 1:9 @ 24 jam, paraffin murni @ 2 jam suhu 57oC
Dicetak dalam kotak dari kertas karton
Ditempel pada holder, diiris menggunakan rotary microtom dengan tebal irisan 10 µm
Pita paraffin diletakkan diatas gelas benda yang telah diolesi gliserin/albumin 1:1 dan diolesi air
Gelas benda berisi potongan organ dimasukkan ke:
Xylol 2, xylol 1 @ 3 menit
Alkohol/xylol 1:3, 1:1, 3:1 @ 3 menit
Ethanol, alkohol 96%, 80%, 70% @ 3 menit
Safranin 1% dalam alkohol 70% @ 2 jam
Alkohol 70%, 80%, 90%, ethanol @ 3 menit
Alkohol/xylol 3:1, 1:1, 1:3 @ 3 menit
Xylol 1, xylol 2 @ 3 menit
Ditetesi entellan dan ditutup gelas penutup, dikeringkan diatas hot plate
Pemberian nama dengan kertas label
Hasil berupa data karakter anatomi tebal daun dan tebal mesofil
2. Langkah Pembuatan Preparat Segar Daun
C. Metode Penelitian 1. Metode penelitian
Metode yang digunakan adalah metode survei dengan teknik pengambilan sampel terpilih (purposive sampling).
2. Variabel Penelitian
Variabel yang digunakan penelitian ini ada 2 macam yaitu variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas adalah kultivar kacang tanah yang digunakan sedangkan variabel tegantung adalah karakter anatomi daun kacang tanah yang diamati.
3. Parameter Penelitian
Parameter yang diamati meliputi tebal daun, tebal mesofil daun, jumlah stomata dan trikomata per mm2, serta ukuran stomata (panjang dan lebar).
4. Cara Kerja Penelitian 4.1. Prosedur Umum
Bibit tanaman kacang tanah dipilih kemudian ditanam di lahan persawahan. Pemeliharaan tanaman dilakukan sesuai prosedur standar Dinas
Sampel daun kacang tanah
Diolesi kutek bening hingga kering
Lapisan kutek dilepas kemudian diletakkan di atas gelas benda dan ditutup dengan gelas penutup
Dihitung jumlah stomata per mm2dan ukuran stomata (panjang dan lebar)
Dihitung jumlah trikomata per mm2
Hasil berupa data karakter anatomi yang diamati
4.2. Pembuatan Preparat Anatomi Daun
Pembuatan preparat awetan daun dengan metode parafin adalah sebagai berikut:
a. Daun dipotong ± 1 cm menggunakan pisau silet yang tajam.
b. Potongan daun tersebut difiksasi menggunakan larutan fiksatif FAA selama 24 jam. Larutan FAA terdiri dari :
Alkohol ... 90 ml Asam asetat glasial... 5 ml Formalin ... 5 ml c. Dehidrasi : Fiksatif diganti berturut – turut dengan :
Alkohol 70% ... 30 menit Alkohol 80% ... 30 menit Alkohol 96% ... 30 menit Alkohol 100% ... 30 menit d. Dealkoholisasi : Alkohol diganti berturut – turut dengan :
Campuran alkohol/xylol 3 : 1 ... 30 menit Campuran alkohol/xylol 1 : 1 ... 30 menit Campuran alkohol/xylol 1 : 3 ... 30 menit Xylol I ... 30 menit Xylol II ... 30 menit
e. Infiltrasi : potongan daun dimasukkan ke dalam campuran xylol/parafin 1 : 9 dengan temperatur 57o C selama ± 24 jam. Campuran xylol/parafin diganti dengan parafin murni pada temperatur 57oC selama 2 jam.
f. Penyelubungan : dibuat kotak – kotak kecil dari kertas karton kemudian parafin cair dituang ke dalam kotak – kotak yang telah diolesi dengan gliserin. Potongan daun dimasukkan ke dalam kotak sehingga tepat di tengah selubung parafin dan dibiarkan membeku.
g. Pengirisan : blok berisi jaringan dipotong sedemikian rupa, ditempel pada holder mikrotom. Pemotongan jaringan menggunakan mikrotom dengan tebal 10 µm.
h. Perekatan : irisan dilekatkan pada gelas benda dengan campuran gliserin/albumin 1:1 yang telah dibubuhi air. Kemudian gelas benda diletakkan di atas pemanas (hot plate).
Xylol I ... 3 menit Campuran alkohol/xylol 1 : 3 ... 3 menit Campuran alkohol/xylol 1 : 1 ... 3 menit Campuran alkohol/xylol 3 : 1 ... 3 menit Alkohol 100% ... 3 menit Alkohol 96% ... 3 menit Alkohol 80% ... 3 menit Alkohol 70% ... 3 menit Safranin ... 2 jam Alkohol 70% ... 3 menit Alkohol 80% ... 3 menit Alkohol 96% ... 3 menit Alkohol 100% ... 3 menit Campuran alkohol/xylol 3 : 1 ... 3 menit Campuran alkohol/xylol 1 : 1 ... 3 menit Campuran alkohol/xylol 1 : 3 ... 3 menit Xylol I ... 3 menit Xylol II ... 3 menit
j. Penutupan : irisan diberi entellan dan ditutup dengan gelas penutup.
Kemudian dikeringkan di atas pemanas (hot plate) hingga entellan cukup kering.
k. Pemberian nama : di sebelah kiri gelas penutup dilekatkan label/etiket dengan diberi keterangan nama, spesies, organ, dan arah irisan.
4.3. Menghitung Jumlah Stomata dan Trikomata per mm2
Penghitungan jumlah stomata dan trikomata sebagai berikut:
a. Permukaan daun bagian bawah (abaksial) diberi kutek bening dan didiamkan hingga kutek mengering. Kutek kemudian diangkat secara hati - hati agar stomata menempel pada lapisan kutek tersebut. Permukaan daun yang terdapat stomata diletakkan di atas gelas benda, ditetesi air kemudian ditutup gelas penutup.
b. Stomata dan trikomata diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran
d. Diameter bidang pdanang pada perbesaran 400X diukur menggunakan mikrometer untuk menghitung luas bidang pandang tersebut.
e. Luas bidang pandang dihitung dengan rumus :
A = π r2 (2-1)
Keterangan :
A = Luas bidang pandang π = tetapan (3.14)
r = diameter bidang pandang : 2
f. Kerapatan stomata dan trikomata = jumlah stomata dan trikomata per luas bidang pandang.
4.4. Mencari Nilai Skala Mikrometer Okuler Mencari nilai skala okuler yaitu:
a. Mikrometer okuler diletakkan pada lensa okuler mikroskop, dilihat hingga bayangan skala mikrometer okuler jelas.
b. Mikrometer objektif diletakkan di atas meja objek, dicari bayangan yang jelas dari skala mikrometer objektif tersebut bersama – sama dengan bayangan skala mikrometer okuler.
c. Kedua bayangan skala tersebut dibuat sejajar dengan memutar tabung okuler. Titik 0 dari kedua skala tersebut diletakkan sama tinggi dengan menggunakan mikrometer objektif.
d. Bayangan garis skala kedua mikrometer dicari yang berhimpit. Jumlah bagian skala pada masing – masing mikrometer dihitung dari titik 0 sampai garis skala yang berhimpit tadi.
e. Jarak sesungguhnya antara kedua garis skala mikrometer objektif diketahui sehingga nilai skala mikrometer okuler dapat dihitung dengan rumus : X Sob
= Y Sok
Sob = Y
Sok X
Sok = × Sob (2-2)
Keterangan :
4.5. Mengukur Tebal Daun, Mesofil Daun, dan Ukuran (Panjang dan Lebar) Stomata
Mengukur tebal daun, mesofil daun, dan ukuran stomata dilakukan dengan tahapan berikut:
a. Mikrometer objektif diambil, diganti dengan preparat.
b. Bayangan preparat dicari. Kombinasi objektif, okuler serta panjang tubus sama dengan waktu mencari nilai skala okuler.
c. Bayangan skala mikrometer okuler ditempatkan pada bayangan preparat sedemikian rupa hingga arah bayangan skala itu sesuai dengan arah panjang atau lebar sel. Nilai panjang dan lebar stomata jumlah bagian skala dikalikan dengan nilai skala mikrometer okuler.
D. Metode Analisis
Data yang diperoleh dianalisis secara deskriptif untuk mengetahui perbedaan karakter anatomi daun dari 10 kultivar kacang tanah yang diamati.
