BAB 4
METODE PENELITIAN 4.1 Jenis Penelitian
Penelitian ini menggunakan rancangan penelitian True experimental (eksperimental murni) dengan metode Post test only group design. Metode yang digunakan adalah Tube dilution test dan Dilution agar test untuk mengetahui pengaruh cuka apel (Apple Cider Vinegar) terhadap pertumbuhan jamur M. globosa secara in vitro.
4.2 Tempat dan Waktu Penelitian
Penelitian akan dilaksanakan di Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang selama tanggal 16 Juni 2021 sampai tanggak 25 bulan Juni 2021.
4.3 Populasi dan Sampel 4.3.1 Populasi
Populasi pada penelitian ini adalah biakan murni M. globosa yang diperoleh dari Laboratorium Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang.
4.3.2 Sampel
Sampel pada penelitian ini adalah jamur M. globosa yang diambil dengan metode Simple random sampling. Metode ini digunakan dikarenakan tiap unit pada populasi bersifat homogen, dan bertujuan agar setiap unit populasi mendapat kesempatan yang sama untuk dijadikan sebagai sampel.
4.3.3 Besar sampel
Pada penelitian ini terdapat 10 kelompok, yang dimana terdiri dari 8 kelompok perlakuan cuka apel dan 2 kelompok control. Penentuan jumlah pengulangan menggunakan rumus Federer, yaitu :
(k-1) (r-1) ≥ 15 (10-1) (r-1) ≥ 15
9r-9 ≥ 15
9r ≥ 24
r ≥ 2,66 à 3 (dibulatkan) keterangan:
k : Jumlah perlakuan
r : Jumlah pengulangan yang dilakukan
Berdasarkan hasil perhitungan diatas diperoleh r ≥ 3, sehingga diperlukan 3 kali pengulangan untuk setiap kelompok perlakuan. Sehingga pada penelitian ini membutuhkan 30 kelompok perlakuan.
4.4 Variabel Penelitian 4.4.1 Variabel bebas
Cuka apel (Apple Cider Vinegar) dalam konsentrasi 100% (kontrol positif), 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, 3,125%, 1,56%, 0,78%, 0,39%, dan 0%
(kontrol negatif). Penetapan konsentrasi pada penelitian ini berdasarkan penelitian terdahulu yang dilakukan oleh Ardiani mahasiswi Fakultas Kedokteran Universitas Muhammadiyah Malang pada tahun 2020.
4.4.2 Variabel kontrol
Medium biakan dengan suhu inkubasi 37ºC dan waktu inkubasi 18- 24 jam.
4.4.3 Variabel terikat
Kadar hambat minimum (KHM) dan Kadar bunuh minimum (KBM) jamur M. globosa.
4.5 Definisi Operasional
No. Variabel Definisi Cara
Pengukuran
Indikator Penilaian
Skala 1. Cuka apel
(Apple Cider Vinegar)
Cuka apel
merupakan olahan fermentasi yang berasal dari buah apel
Penghitungan dengan mikro pipet
Konsentrasi : 1. 100%
(kontrol positif) 2. 50%
3. 25%
4. 12,5%
5. 6,25%
6. 3,125%
7. 1,56%
8. 0,78%
9. 0,39%
10. 0%
(kontrol negatif)
Kategorik, ordinal
2. Pertumbuhan M. globosa
Pertumbuhan jamur di amati dengan
menghitung koloni dari M.
globosa
Penghitungan menggunakan Colony Counter
Jumlah koloni
jamur M.
globosa pada setiap agar plate
Numerik, ratio
KHM (Kadar Hambat Minimal)
Konsentrasi minimal cuka apel (Apple Cider Vinegar) yang dapat
menghambat pertumbuhan jamur M. globosa dengan melihat tingkat kejernihan pada tabung
Penilaian secara visual, dinilai oleh minimal 3 orang
1. Jernih (+):
apabila garis hitam pada kertas di belakang tabung terlihat jelas, atau warna tabung sama dengan warna pada tabung kontrol positif 2. Agak keruh (++) : apabila
Kategorik, ordinal
4.5 Alat dan Bahan Penelitian
4.6.1 Alat-alat yang digunakan:
a. Tabung reaksi steril b. Ose lengkung c. Neraca
d. Mikropipet 1ml e. Inkubator f. Vortex
g. Colony Counter
garis hitam pada kertas di belakang tabung masih terlihat, tetapi samar- samar
3. Sangat keruh (+++): apabila garis hitam pada kertas di belakang tabung tidak terlihat, atau warna tabung sama dengan warna tabung kontrol negatif
KHM dinilai dengan
perubahan indikator dari
“Agak keruh”
menjadi “Jernih”
KBM (Kadar Bunuh
Minimal)
Konsentrasi minimal cuka apel (Apple Cider Vinegar) yang dapat membunuh jamur M. globosa hingga 99,9% dari inoculum asal pada Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
Penghitungan dengan Colony Counter
KBM dinilai dengan tidak adanya
pertumbuhan
jamur M.
globosa atau maksimal 0,1%
dari kontrol bahan yang dihitung dengan Colony Counter
Numerik, ratio
h. Lampu spirtus i. Label
j. Spektrofotometer
4.6.2 Bahan-bahan yang digunakan:
a. Cuka apel b. Aquadest c. Alkohol 70%
d. NaCl fisiologis
e. Biakan jamur Malassezia globosa f. Sebouraud Dextrose Agar (SDA) g. Sebouraud Dextrose Broth (SDB)
4.7 Prosedur Penelitian 4.7.1 Sterilisasi alat
a. Semua alat dicuci dengan sabun lalu dibilas dengan air bersih, dan biarkan hingga mongering.
b. Alat berbahan dasar gelas disterilkan dengan cara dimasukkan kedalam oven selama 2 jam pada suhu 180ºC, ose lengkung disterilkan dengan dipijarkan pada api spiritus. Alat-alat yang bisa di sterilisasi dengan autoklaf dibungkus dengan kertas lalu
dimasukkan kedalam autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit (Bahar & Yusmaini, 2018).
4.7.2 Pembuatan medium Sabouraud Dextrose Agar (SDA)
a. Timbang Sabouraud Dextrose Agar Base sebanyak 40gr, dan tambahkan aquadest sebanyak 600ml.
b. Sabouraud Dextrose Agar Base yang sudah ditambahkan dengan aquadest lalu direbus hingga tercampur rata, selanjutnya SDA
dilakukan sterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit.
c. SDA yang sudah steril dituangkan ke dalam cawan petri masing – masing sebanyak 20ml (Bahar & Yusmaini, 2018).
4.7.3 Pembuatan medium Sabouraud Dextrose Broth (SDB)
a. Timbang bahan Sabouraud Dextrose Broth (SDB) sebanyak 2gr, lalu tambahkan aquadest sebanyak 30ml dan diaduk hingga merata.
b. Rebus Sabouraud Dextrose Broth (SDB) hingga tercampur rata c. Sabouraud Dextrose Broth (SDB) yang sudah direbus disterilisasi
dengan autoklaf pada suhu 121ºC selama 15 menit.
d. Sabouraud Dextrose Broth (SDB) yang sudah steril dituangkan ke dalam tabung reaksi (Bahar & Yusmaini, 2018).
4.7.4 Peremajaan jamur
Jamur M. globosa dilakukan peremajaan dengan cara mengambil satu ujung ose steril dari biakan jamur M. globosa, selanjutnya diinokulasikan atau digoreskan pada medium SDA lalu diinkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37º C (Litaay et al., 2017).
4.7.5 Pembuatan perbenihan cair jamur
Pembuatan perbenihan cair dilakukan dengan mengambil satu ujung ose steril dari hasil peremajaan jamur M. globosa, selanjutnya dicampurkan dengan cairan NaCl fisiologis pada tabung reaksi lalu divortex hingga konsentrasi sesuai dengan standart McFarland I yaitu 108 CFU/ml.
4.7.6 Uji kepekaan cuka apel terhadap M. globosa
Metode yang digunakan untuk uji ini adalah metode dilusi tabung.
Pada penelitian ini digunakan 10 macam kadar cuka apel dengan 2 kelompok kontrol, pada tabung kontrol positif konsentrasinya adalah 100% dan pada tabung kontrol negatif adalah 0%. Kemudian diinokulasi atau dicampurkan dengan perbenihan cair jamur M. globosa. Proses selanjutnya adalah inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37ºC dengan cara sebagai berikut :
Hari ke – 1 :
a. Menyediakan 10 tabung reaksi steril dan diberi label tabung 1 (kontrol positif cuka apel), tabung 2, tabung 3, tabung 4, tabung 5, tabung 6, tabung 7, tabung 8, tabung 9, tabung 10 (kontrol negatif jamur M. globosa).
b. Masukan 1 ml Sabouraud Dextrose Broth (SDB) ke dalam tabung3,4,5,6,7,8,9, dan 10.
c. Masukan 2ml cuka apel ke dalam tabung 1 dan 2.
d. Masukan 1ml cuka apel dari tabung 2 ke dalam tabung 3.
e. Campurkan cuka apel dan Sabouraud Dextrose Broth (SDB) pada tabung
3 hingga merata, selanjutnya masukan 1ml dari tabung 3 ke dalam tabung 4.
f. Lakukan hal yang sama pada tabung 4,5,6,7,8, dan 9.
g. Tabung 9 diaduk hingga tercampur rata, lalu dibuang sebanyak 1ml.
h. Dari pengenceran diatas maka didapatkan konsentrasi awal cuka apel masing-masing tabung adalah.
i. Masukkan 1 ml perbenihan cair jamur M. globosa ke dalam tabung 2 sampai 10.
j. Dengan demikian volume masing-masing tabung menjadi 2 ml sehingga konsentrasi akhir berubah menjadi seperti berikut.
Konsentrasi cuka apel : Tabung 2 à 1 ml (100%) Tabung 3 à 2 ml (50%)
Konsentrasi cuka apel : Tabung 3 à 1 ml (50%) Tabung 4 à 2 ml (25%)
k. Inkubasikan semua tabung ke dalam incubator dengan suhu 37ºC selama 18-24 jam.
Hari ke – 2 :
Pada hari ke – 2 semua tabung dikeluarkan dari inkubator, lalu amati kejernihan tabung secara visual dengan peniliaian minimal oleh 3 orang dan akan didapatkan nilai KHM (Kadar Hambat Minimal). Kemudian masing – masing tabung diambil dengan ose steril sebanyak 1 kali dan dilakukan streaking pada media SDA, selanjutnya diinkubasikan kembali selama 18-24
jam pada suhu 37ºC.
Hari ke – 3 :
Semua media SDA dikeluarkan dari incubator dan dilakukan pengamatan kuantitatif pada masing – masing konsentrasi dengan menggunakan colony counter. Colony counter berfungsi untuk menghitung jumlah koloni jamur M. globosa pada media SDA sehingga didapatkan nilai KBM (Kadar Bunuh Minimum). Penelitian ini dilakukan oleh peneliti dan dikonfirmasi oleh analis laboratorium.
4.8 Alur Penelitian
Persiapan alat dan bahan
Pembuatan medium SDA dan SDB
Inokulasi M. globosa pada medium SDA
Inkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37ºC
Pembuatan perbenihan cair jamur dengan cairan NaCl fisiologis
Uji kepekaan cuka apel dengan tube dilution
Pengenceran larutan cuka apel dengan 8 konsentrasi dan 2 tabung sebagai kontrol
Penambahan 1 ml jamur pada tabung 2-10
Inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37ºC
Pengamatan KHM
Streaking dari masing-masing tabung ke medium SDA
Inkubasi selama 18-24 jam dengan suhu 37ºC
Pengamatan KBM
Analisis data
Konsentrasi akhir larutan pada tabung Konsentrasi awal larutan pada tabung
4.9 Analisis Data
Data yang akan diolah pada penelitian ini merupakan data skala kategorik dan numerik. Maka analisis data yang digunakan untuk menentukan Kadar Bunuh Minimum (KBM) cuka apel (Apple Cider Vinegar) terhadap M.
globosa adalah sebagai berikut :
a. Analisis data yang digunakan adalah komparatif numerik tidak berpasangan
>2 kelompok yaitu uji One Way ANOVA. Sebelum dilakukan uji One Way ANOVA data diawali dengan uji normalitas dan uji homogenitas terlebih dahulu, jika data normal dan homogen maka dilanjutkan uji One Way ANOVA.
b. Besar sampel data yang digunakan ≤ 50 sehingga uji normalitas
menggunakan uji Saphiro-Wilk. Data dianggap normal jika nilai p > 0,05, jika nilai p < 0,05 maka data harus dilakukan transformasi terlebih dahulu.
Apabila setelah ditransformasikan data tetap tidak normal maka dilakukan uji komparatif menggunakan uji Kruskal-Wallis dan Post Hoc Mann Whitney.
c. Selanjutnya dilakukan uji homogenitas menggunakan uji Levene. Data dianggap normal bila nilai p > 0.05.
d. Bila pada uji normalitas dan uji homogenitas didapatkan data normal dan homogen, maka dilanjutkan uji One Way ANOVA dan uji post hoc Bonferroni. Namun jika didapatkan data normal dan tidak homogen, maka digunakan uji One Way ANOVA dengan post hoc Games-Howell.
e. Selanjutnya dilakukan uji Independent Sample T Test untuk mengetahui perbedaan antara 2 kelompok perlakuan.
