TESIS PENGARUH MINYAK KELAPA MURNI DAN HASIL HIDROLISISNYA TERHADAP PARAMETER LUKA PADA SEL NIH 3T3 SECARA IN VITRO

(1)

TESIS

PENGARUH MINYAK KELAPA MURNI DAN HASIL HIDROLISISNYA TERHADAP PARAMETER

LUKA PADA SEL NIH 3T3 SECARA IN VITRO

OLEH:

DIAN IKA PERBINA BR. MELIALA NIM 167014025

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

2019

Universitas Sumatera Utara

(2)

PENGARUH MINYAK KELAPA MURNI DAN HASIL HIDROLISISNYA TERHADAP PARAMETER

LUKA PADA SEL NIH 3T3 SECARA IN VITRO

TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh Gelar Magister dalam Ilmu Farmasi pada Fakultas Farmasi

Universitas Sumatera Utara

OLEH:

DIAN IKA PERBINA BR. MELIALA NIM 167014025

PROGRAM STUDI MAGISTER ILMU FARMASI FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

2019

(3)

(4)

PERSETUJUAN TESIS

Nama Mahasiswa : Dian Ika Perbina br. Meliala Nomor Induk Mahasiswa : 167014025

Program Studi : Magister Farmasi

Judul Tesis : Pengaruh Minyak Kelapa Murni dan Hasil Hidrolisisnya Terhadap Parameter Luka pada Sel NIH 3T3 secara In Vitro

Telah diuji dan dinyatakan LULUS di depan Komisi Penguji Tesis pada hari Kamis tanggal tiga puluh satu bulan Januari tahun dua ribu Sembilan belas.

Mengesahkan:

Komis Penguji Tesis

Ketua Komisi Penguji : Prof. Dr. Jansen Silalahi, M.App.Sc., Apt.

Sekretaris Komisi Penguji : Yuandani, M.Si., Ph.D., Apt.

Anggota Komisi Penguji : Prof.Dr.Siti Morin Sinaga, M.Sc., Apt Prof. Dr. Urip Harahap., Apt.

(5)

v Universitas Sumatera Utara

(6)

vi

KATA PENGANTAR

Puji dan syukur kepada Tuhan yang telah melimpahkan anugerah dan karuniaNya sehingga penulis dapat menyelesaikan tesis yang berjudul “Pengaruh Minyak Kelapa Murni dan Hasil Hidrolisisnya terhadap Parameter Luka pada Sel NIH 3T3 secara In Vitro”.

Minyak kelapa murni dan hasil hidrolisisnya mempunyai efek sebagai penyembuhan luka. Sediaan farmasi yang digunakan sebagai penyembuhan luka yang mengandung antibiotik, tidak ampuh lagi akibat resistensi bakteri terhadap antibiotik. Banyak masyarakat yang mengubah pola pengobatan back to nature.

Hal ini menjadi dasar peneliti, pentingnya melakukan penelitian ini, karena di Indonesia belum pernah dilakukan penelitian mengenai VCO dan HVCO untuk menguji efek penyembuhan luka secara in vitro.

Pada kesempatan ini penulis menyampaikan terima kasih yang sebesar- besarnya kepada Prof. Dr. Jansen Silalahi, M. App. Sc., Apt. dan Yuandani, S.Farm., M.Si., Ph.D., Apt. atas waktu, arahan, dan bimbingan yang diberikan selama penyelesaian tesis ini. Pada kesempatan ini juga peneliti menyampaikan terima kasih kepada Prof. Dr. Masfria, M.S., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Sumatera Utara yang telah memberikan bantuan dan fasilitas selama menjalani pendidikan di Program Magister Ilmu Farmasi. Kepada kedua orang tua, almarhum Ayahanda Edison Meliala dan Ibunda Dra.Sabar Menanti tercinta, penulis menyampaikan terima kasih dan penghargaan yang setinggi-tingginya atas semua pengorbanan, doa, dan dorongannya sehingga tesis ini dapat diselesaikan.

Medan, 31 Januari 2019 Penulis,

Dian Ika Perbina br. Meliala

(7)

vii

PENGARUH MINYAK KELAPA MURNI DAN HASIL HIDROLISISNYATERHADAP PARAMETER

LUKA PADA SEL NIH 3T3 SECARA IN VITRO

ABSTRAK

Penyembuhan luka adalah suatu proses yang kompleks dengan melibatkan banyak sel, sitokin, growth factor, dan extracellular matrix (ECM). Minyak kelapa murni (Virgin Coconut Oil =VCO) dan hasil hidrolisisnya (Hydrolized Virgin Coconut Oil=HVCO) sudah diuji secara in vivo sebagai penyembuh luka.

Penelitian ini bertujuan untuk mengevaluasi pengaruh VCO dan HVCO terhadap parameter penyembuhan luka secara invitro pada sel NIH 3T3.

VCO dihidrolisis parsial menggunakan lipase dari Rhizomucor miehei (aktif pada posisi sn-1,3) untuk menghasilkan VCO terhidrolisis (HVCO) dan diukur bilangan asamnya. Sel NIH 3T3 ditanam di plate, kemudian setelah 24 jam diberi bahan uji dengan berbagai seri konsentrasi dimulai konsentrasi paling rendah 15,625 µg/mL hingga konsentrasi paling tinggi 1000 µg/mL lalu diinkubasi 24 jam dan diukur absorbansi menggunakan metode MTT [3-(4,5- dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] serta dihitung viabilitas sel.

Konsentrasi dengan viabilitas sel paling tinggi digunakan untuk mengukur parameter penyembuhan luka yaitu aktivitas proliferasi sel, persen penutupan luka, ekspresi protein MMP-9, PDGF-BB, TGF-β1 dan ekspresi gen COX-2.

Pengujian parameter penyembuhan luka dimulai dari sel NIH 3T3 ditanam di plate, kemudian setelah 24 jam diberi bahan uji lalu diinkubasi 24 jam serta dilanjutkan sesuai metode dalam parameter penyembuhan luka. Aktivitas proliferasi sel diukur dengan menghitung viabilitas sel yang diinkubasi 24 jam, 48 jam dan 72 jam. Persen penutupan luka diuji dengan metode scratch wound healing, ekspresi protein MMP-9, PDGF-BB, TGF-β1 diukur dengan metode imunositokimia dan ekspresi gen COX-2 ditentukan menggunakan RT-PCR.

Sel yang diberi VCO dan HVCO, viabilitas nya meningkat pada konsenterasi 1000µg/mL sampai konsentrasi 62,5 µg/mL dan menurun dibawah konsentrasi 62,5 µg/mL. Proliferasi sel setelah inkubasi 24, 48, 72 jam dari kontrol sel, VCO, HVCO meningkat pada jam ke 48 tetapi menurun pada jam ke 72. Aktivitas proliferasi sel dari kelompok HVCO lebih besar daripada VCO dan kontrol sel. Persentase penutupan luka setelah inkubasi 24 dan 48 jam adalah kelompok kontrol sel dan VCO belum ada model luka yang tertutup sampai pada jam ke 48, tetapi kelompok HVCO model luka sudah menutup 100%. Hasil ekspresi protein MMP-9 meningkat dari 2,89% (kontrol sel) menjadi 28,16%

(VCO), dan 55,40% (HVCO), persentase ekspresi protein PDGF-BB meningkat dari 28.11% (kontrol sel) menjadi 48,53% (VCO) dan 61,65% (HVCO), dan persentase ekspresi protein TGF-β1 meningkat dari 4,19% (kontrol sel) menjadi 18,41% (VCO) dan 36,35% (HVCO). Hasil ekspresi gen COX-2 dari kontrol sel, VCO 62,5 µg/mL dan HVCO 62,5 µg/mL berturut-turut adalah 1,00; 1,43; dan 1,93. Berdasarkan hasil pengujian invitro terhadap parameter penyembuhan luka maka dapat disimpulkan bahwa VCO dan HVCO meningkatkan proses penyembuhan luka.

Kata kunci: VCO, viabilitas sel, sel NIH 3T3, proliferasi sel, persentase penutupan luka, ekspresi protein, COX-2.

(8)

viii

THE EFFECT OF VIRGIN COCONUT OIL AND ITS HYDROLYSIS RESULTS TOWARD WOUND HEALING PARAMETERS IN 3T3 CELLS WITH IN VITRO METHOD

ABSTRACT

Wound healing is a complex process involving many cells, cytokines, growth factors, proteases, and extracellular matrix (ECM). Minyak kelapa murni (Virgin Coconut Oil = VCO) and the results of its hydrolysis (Hydrolized Virgin Coconut Oil = HVCO) had been tested in vivo as wound healers. This study aimed to evaluate the effect of VCO and HVCO on invitro wound healing parameters in NIH 3T3 cells.

VCO was partially hydrolyzed using lipase from Rhizomucor miehei (active at sn-1,3 position) to produce hydrolyzed VCO (HVCO) and its acid number was measured. NIH 3T3 cells were planted in a plate, then after 24 hours the test material was given with various concentrations with the lowest concentration of 15,625 µg/mL the highest concentration of 1000 µg / mL then incubated 24 hours and measured absorbance using the MTT method [3- (4, 5- dimethylthiazol-2-il) -2.5-diphenyl tetrazolium bromide] and cell viability calculated. The highest of cell viability was used to measure wound healing parameters, namely cell proliferation activity, percent wound closure, MMP-9 protein expression, PDGF-BB, TGF-β1 and COX-2 gene expression. Testing the wound healing parameters starting from NIH 3T3 cells was planted in a plate, then after 24 hours the test material was given and then incubated 24 hours and continued according to the method in the wound healing parameters. Cell proliferation activity was measured by calculating cell viability incubated 24 hours, 48 hours and 72 hours. The wound closure percentage was tested by the scratch wound healing method, the expression of MMP-9 protein, PDGF-BB, TGF-β1 was measured by the immunocytochemical method and COX-2 gene expression was determined using RT-PCR.

Cells given VCO and HVCO, their viability increased at concentrations of 1000 µg / mL to concentrations of 62.5 µg / mL and decreased below the concentration of 62.5 µg / mL. Cell proliferation after incubation 24, 48, 72 hours from cell control, VCO, HVCO increased at 48 hours but decreased at 72 hours.

Cell proliferation activity of the HVCO group was greater than VCO and cell control. The percentage of wound closure after 24 and 48 hours incubation was the cell control group and VCO had no closed wound model until the 48th hour, but the HVCO group wound model had closed 100%. The results of MMP-9 protein expression increased from 2.89% (cell control) to 28.16% (VCO), and 55.40% (HVCO), the percentage of PDGF-BB protein expression increased from 28.11% (cell control) to 48 , 53% (VCO) and 61.65% (HVCO), and the percentage of TGF-β1 protein expression increased from 4.19% (cell control) to 18.41% (VCO) and 36.35% (HVCO). The results of COX-2 gene expression from cell control, VCO 62.5 µg / mL and HVCO 62.5 µg / mL were 1.00; 1.43; and 1.93. Based on the results of invitro testing on wound healing parameters, it can be concluded that VCO and HVCO improve the wound healing process.

Keywords: VCO, cell viability, NIH 3T3 cells, cell proliferation, percentage of wound closure, COX-2.

(9)

ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ... i

HALAMAN PENGESAHAN TESIS ... iii

HALAMAN PERSETUJUAN TESIS ... iv

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ... v

KATA PENGANTAR ... vi

ABSTRAK ... ... vii

ABSTRACT ... viii

DAFTAR ISI ... ix

DAFTAR TABEL ... ... xii

DAFTAR GAMBAR ... xiii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiv

DAFTAR SINGKATAN ... xv

BAB I PENDAHULUAN ... 1

1.1 Latar Belakang ... 1

1.2 Perumusan Masalah... 6

1.3 Hipotesis Penelitian ... 7

1.4 Tujuan Penelitian... 7

1.5 Manfaat Penelitian... 7

1.6 Kerangka Pikir Penelitian... 8

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ... 9

2.1 Kulit ... 9

2.2 Sel Fibroblas ... 11

2.3 Luka ... 12

2.4 Proses Penyembuhan Luka... 14

2.5 Uji Efek Penyembuhan Luka ... 20

2.5.1 Metode Uji Efek Penyembuhan Luka ... 20

2.5.2 Uji Efek Penyembuhan Luka dari Bahan Alam ... 23

2.6 Minyak dan Lemak ... 29

2.6.1 Sifat Fisikokimia ... 29

2.6.2 Minyak Kelapa Murni ... 30

2.6.3 Efek terhadap Penyembuhan Luka sebagai Antibakteri ... 31

2.7 Hidrolisis Trigliserida ... 32

2.8 Kerangka Teori Penelitian... 35

BAB III METODE PENELITIAN ... 37

3.1 Desain Penelitian ... 37

3.2 Tempat dan Waktu Penelitian ... 37

3.3 Alat ... 37

3.4 Bahan ... 38

3.5 Hidrolisis Enzimatis VCO ... 38

3.6 Penentuan Bilangan Asam ... 39

3.7 Sterlisasi Alat dan Bahan ... 40

3.8 Pembuatan Media ... 40

3.8.1 Pembuatan Media DMEM ... 40

3.9 Penumbuhan Sel ... 41

(10)

x

3.9.1 Penumbuhan Sel ... 41

3.9.2 Subkultur Sel ... 42

3.9.3 Panen Sel ... 42

3.6.4 Perhitungan Sel ... 42

3.10 Pembuatan Larutan Uji ... 44

3.11 Optimasi Viabilitas Sel NIH 3T3 dengan Bahan uji ... 44

3.12 Prosedur Pengujian Parameter Penyembuhan Luka secara In Vitro ... 45

3.12.1 Aktivitas Kinetika Proliferasi ... 45

3.12.2 Pengujian Migrasi Sel ... 45

3.12.3 Analisa Ekspresi Protein MMP-9 dengan Metode Imunositokimia ... 46

3.12.4 Pemeriksaan Ekspresi COX-2 ... 47

3.12.4.1 Ekstraksi RNA ... 47

3.12.4.1.1 Panen Sel ... 47

3.12.4.2 Pembuatan cDNA... 50

3.12.4.3 Analisis Ekspresi COX-2 dan β-aktin ... 50

3.12.4.4 Elektroforesis ... 51

3.13 Analisis Data ... 51

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 52

4.1 Hidrolisis Virgin Coconut Oil ... 52

4.2 Optimasi Viabilitas Sel NIH 3T3 dengan Bahan uji ... 54

4.3 Efek VCO dan HVCO terhadap Parameter Penyembuhan Luka secara In Vitro ... 56

4.3.1 Aktivitas Proliferasi Sel ... 56

4.3.2 Scratch Wound Healing ... 58

4.3.3 Ekspresi Protein MMP-9, PDGF-BB, dan TGF-β1 ... 60

4.3.4 Ekspresi COX-2 ... 63

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 66

5.1 Kesimpulan ... 66

5.2 Saran ... 66

DAFTAR PUSTAKA ... 67

LAMPIRAN ... ... 75

(11)

xi

DAFTAR TABEL

2.1 Uji Efek Penyembuhan Luka dari Berbagai Bahan Alam ... 27

2.2 Klasifikasi Enzim Lipase Berdasarkan Spesifikasinya ... 34

3.1 Bahan-Bahan untuk Larutan DNase... 49

3.2 Primer Sequences β-Aktin dan COX-2 ... 50

4.1 Bilangan Asam ... 52

4.2 Optimasi Viabilitas Sel NIH 3T3 dengan Bahan Uji ... 54

4.3 Efek bahan uji dan waktu inkubasi terhadap proliferasi sel ... 56

4.4 Efek bahan uji terhadap penutupan model luka ... 59

4.5 Efek bahan uji terhadap ekspresi protein MMP-9, PDGF-BB, dan TGF- β1 ... 61

(12)

xii

DAFTAR GAMBAR

2.1 Struktur Lapisan Kulit ... 9

2.2 Peran Fibroblas dalam Membentuk dan Meletakkan Serat-Serat dalam Matriks, Terutama Serat Kolagen ... 11

2.3 Kultur NIH 3T3 Salah Satu Contoh Cell Line Fibroblas dari Embrio Mencit... 12

2.4 Proses Penyembuhan Luka ... 15

2.5 Faktor Pertumbuhan dalam Penyembuhan Luka ... 16

2.6 Reduksi MTT menjadi Formazan ... 21

2.7 Kerangka Teori Penelitian... 36

3.1 Hemositometer (Kamar Hitung) ... 43

4.1 Efek bahan uji terhadap persentase viabilitas sel pada berbagai konsentrasi ... 55

4.2 Efek bahan uji terhadap aktivitas proliferasi sel NIH 3T3 yang diinkubasi selama 24; 48 dan 72 jam ... .. 57

4.3 Aktivitas penutupan model luka NIH3T3 diberi VCO dan HVCO untuk 0; 24 dan 48 jam dan mengukur area penutupan. (a) 0 jam; (b) 24 jam; (c)48 jam... ... 58

4.4 Pengaruh VCO dan HVCO pada sel NIH 3T3. Sel diamati dengan mikroskop (pembesaran 40x)... 60

4.5 Efek bahan uji terhadap ekspresi protein MMP-9, PDGF-BB, dan TGF-β1... 62

4.6 Efek bahan uji terhadap ekspresi COX-2 pada sel NIH 3T3 ... 63

(13)

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

1. Bagan Alur Penelitian... 75

2. Alat dan Bahan yang Digunakan... 78

3. Sel di dalam hemositometer dan sel NIH 3T3 di bawah mikroskop... 80

4. Kristal formazan dan sel NIH 3T3 setelah diberi perlakuan di bawah Mikroskop ... 81

5. Ethical Clearance... 82

6. Prosedur Pembuatan Media Kultur ... 83

7. Pembuatan Media Kultur Lengkap ... .. 84

8. Prosedur Penumbuhan Sel NIH 3T3... 85

9. Prosedur Subkultur Sel... 86

10. Prosedur Panen Sel... 87

11. Prosedur Perhitungan Sel... 88

12. Prosedur Pembuatan Larutan Uji... 89

13. Prosedur Uji Viabilitas Sel sebagai Orientasi Konsentrasi... 90

14. Prosedur Uji Proliferasi Sel... 91

15. Prosedur Scratch Wound Healing... 92

16. Analisa Ekspresi Protein MMP-9, PDGF-BB, dan TGF-β1 dengan Metode Imunositokimia... 93

17. Prosedur Analisa Ekspresi COX-2 dengan RT-PCR... 94

18. Data Bilangan Asam VCO dan HVCO ... 101

19. Data hasil viabilitas sel dari kontrol sel, VCO, dan HVCO... . 103

20. Data persen viabilitas sel dalam uji proliferasi sel dari kontrol sel, VCO,dan HVCO... 105

21. Data persen penutupan luka dari kontrol sel, VCO, dan HVCO... 107

22. Ekspresi protein MMP-9, PDGF-BB, dan TGF-β1 dari kontrol sel, VCO, dan HVCO... 108

23. Data ekspresi gen COX-2 dari kontrol sel, VCO, dan HVCO... 109

24. Analisis statistik persen viabilitas sel dari kontrol sel, VCO, dan HVCO... 110

25. Analisis statistik persen viabilitas sel dalam uji proliferasi sel dari kontrol sel, VCO, dan HVCO... 111

26. Analisis statistik scratch wound healing dari kontrol sel, VCO, dan HVCO... 112

27. Analisis statistik persen ekspresi protein MMP-9, PDGF-BB, dan TGF-β1 dari kontrol sel, VCO, dan HVCO... 113

28. Analisis statistik persen ekspresi gen COX-2 dari kontrol sel, VCO, dan HVCO... 115

(14)

xiv

DAFTAR SINGKATAN COX-2 : Cyclooxygenase-2

ECM : Extracellular matrix EGF : Epidermal Growth Factor FGF : Fibroblast Growth Factor FGF : Fibroblast growth factor GF : Growth factor

HVCO : Hydrolized Virgin Coconut Oil IGF : Insulinlike Growth Factor LDL : Low-density lipoprotein MCFA : Medium Chain Fatty Acid MMP-9 : Matrix metalloproteinase-9 MMPs : Metalloproteinases

PDGF : Platelet-Derived Growth Factor PDGF-BB : Platelet-derived growth factor BB TGF : Transforming Growth Factor

TGF-β1 : Transforming growth factor beta satu VCO : Virgin Coconut Oil

VEGF : Vascular endothelial growth factor

(15)

1 BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Kulit manusia adalah organ terbesar di tubuh yang menutupi lapisan luar, dan terbagi menjadi tiga lapisan utama yaitu epidermis, dermis, dan subkutan.

Kulit sebagai penjaga organ dalam, pemberi perlindungan dari mikroba, pengatur suhu tubuh, dan sebagai tempat reseptor sentuhan, panas, dan dingin. Kulit yang sehat dapat melindungi tubuh dari faktor lingkungan, termasuk faktor fisik seperti trauma mekanis, cedera termal, dan radiasi, faktor kimia seperti alergen, faktor biologi seperti bakteri, virus, dan lainnya (Ariffin and Hasham, 2016).

Luka adalah hilang atau rusaknya sebagian jaringan tubuh. Luka dapat disebabkan oleh trauma benda tajam dan tumpul, perubahan suhu, zat kimia, ledakan, sengatan listrik, atau gigitan hewan. Beberapa jenis luka yaitu luka venous, arterial, tekan, diabetes, bakar, operasi, dehisiensi, eviserasi, fistula, dan kompleks (Sjamsuhidajat dan Jong, 2003; Suriadi, 2015).

Penyembuhan luka adalah suatu proses yang kompleks dengan melibatkan banyak sel, sitokin, growth factor, protease, dan extracellular matrix (ECM) yang saling bekerja sama untuk mengembalikan integritas jaringan yang luka. Proses penyembuhan luka terdiri dari empat fase yaitu fase hemostasis, inflamasi, proliferasi, dan remodeling. Pada fase hemostasis merupakan awal proses penyembuhan luka dengan melibatkan platelet. Cedera pada kulit merangsang platelet intravaskular menjadi kolagen subendotelial, yang membentuk trombin.

Selama fase inflamasi, fibroblas berfungsi sebagai sekresi sitokin, dan faktor

(16)

2

pertumbuhan untuk mengaktifkan sistem pertahanan tubuh. Selama fase proliferasi dan remodeling, fibroblas penting untuk menggranulasi dan mereorganisasi jaringan dari matriks ektraseluler. Setelah terjadi pembekuan darah, sel-sel inflamasi dengan cepat ditarik ke dalam luka, diikuti dengan migrasi fibroblas dan sel epitel yang membelah dan mengisi daerah luka. Sel endotel vaskular membentuk kapiler baru di daerah luka, serta suplai darah baru.

Fibroblas mensintesis matriks ekstraselular untuk mengganti jaringan yang rusak.

Sehingga selularitas luka berkurang dan matriks ekstraselularnya diperbaiki (Bennett, et al., 1993; Mast and Schultz, 1996; Sjamsuhidajat, dan Jong, 2003;

Suriadi, 2004; Arndt, et al., 2013; Suriadi, 2015).

Degradasi matriks ekstra sel atau proteolisis merupakan proses penting dalam pembentukan neovaskularisasi pada saat terjadi kerusakan pertahanan anatomi pembuluh darah. Pada tahap ini dibutuhkan peranan matrix metalloproteinases (MMPs). Matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) adalah anggota MMPs kelompok gelatinase yang memiliki keistimewaan yaitu dapat memecah kolagen tipe IV. MMP-9 dihasilkan oleh makrofag. Kolagen tipe IV sendiri harus dipecah untuk memfasilitasi migrasi sel endotel pembuluh darah.

Ekspresi MMP-9 mempengaruhi proses angiogenesis (Wulandari, et al., 2006;

Zhang, et al., 2012).

Penyembuhan luka berhubungan dengan kontaminasi bakteri di daerah luka. Tujuan utama dari penyembuhan luka untuk mengembalikan sifat fungsional kulit dan mencegah terjadinya infeksi. Beberapa faktor pertumbuhan yang dilepaskan pada daerah luka yang berperan dalam penyembuhan luka yaitu faktor pertumbuhan epidermal (EGF= Epidermal Growth Factor), faktor pertumbuhan

(17)

3

fibroblas (FGF= Fibroblast Growth Factor), faktor pertumbuhan seperti insulin (IGF= Insulinlike Growth Factor), faktor pertumbuhan keratinosit (KGF=

Keratinocyte Growth Factor), faktor pertumbuhan trombosit (PDGF= Platelet- Derived Growth Factor), faktor pertumbuhan transforming (TGF= Transforming Growth Factor ), dan faktor pertumbuhan endotel vaskular (VEGF= vascular endothelial growth factor). Transforming growth factor beta satu (TGF-β1), platelet-derived growth factor BB (PDGF-BB), dan fibroblast growth factor (FGF) adalah contoh growth factor (GF) yang terlibat dalam proliferasi dan migrasi sel . Siklooksigenase merupakan enzim yang mengkatalisis pembentukan prostaglandin, suatu mediator inflamasi dan produk metabolisme asam arakidonat (Bliska, et al., 2003; Balzer, et al., 2015; Rossi,et al., 2016).

Enzim COX terdiri dari 2 isoenzim yaitu COX-1, COX-2 dan COX-3 (varian COX-1). COX-2 yang berperan dalam proses angiogenesis. Ekspresi MMP-9, TGF-β1, PDGF-BB , dan COX-2 mempengaruhi proses angiogenesis, migrasi, dan proliferasi fibroblas. Proses angiogenesis, migrasi, dan proliferasi fibroblas sangat penting dalam penyembuhan luka. Ekspresi MMP-9, TGF-β1, PDGF-BB dan COX-2 mempengaruhi proses angiogenesis, migrasi, dan proliferasi fibroblas (Chandrasekharan, et al., 2002; Chen, 2017; Muñoza, et al., 2017; Bruce, 1996).

Penyembuhan luka dapat dibantu dengan sediaan farmasi dan bahan alternatif alam untuk mempercepat proses penyembuhan. Beberapa faktor yang berperan dalam mempercepat penyembuhan, yaitu faktor internal (dari dalam tubuh) dan faktor eksternal (dari luar tubuh). Faktor eksternal yang dapat mempercepat penyembuhan luka yaitu dengan cara irigasi luka menggunakan

(18)

4

larutan fisiologis (NaCl 0,9%) serta penggunaan obat-obatan sintetik (Bioplacenton^®, Bepanthen^®, dan Certricillin^®), dan bahan alternatif alam.

Bioplacenton^®mempunyai aksi stimulasi pada proses metabolik di dalam sel yang memegang peranan penting dalam mempercepat regenerasi sel dan penyembuhan luka (ISFI, 2017; Adam and Alexander, 2008).

Banyak tantangan dalam hal perawatan luka yaitu resistensi terhadap antibiotik dan penurunan penemuan antibiotik baru. Efek samping penggunaan obat sintetik yang dapat menyebabkan iritasi. Banyak ahli yang sudah melakukan penelitian terhadap bahan alam sebagai penyembuhan luka. Persepsi masyarakat terhadap pengobatan tradisional sudah terjadi perubahan. Banyak masyarakat menggunakan bahan alternatif dari alam sebagai pengganti. Bahan alternatif dari alam yang biasa digunakan untuk penyembuhan luka ialah madu. Madu memiliki sifat sebagai antiinflamasi, antibakteri, dan anti fungi. Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan secara in vivo, madu dapat mengobati luka dengan cara meningkatkan kontraksi luka dan epitelisasi luka. Minyak kelapa murni (Virgin Coconut Oil = VCO) juga digunakan sebagai alternatif penyembuhan luka (ISFI, 2017; Adam and Alexander, 2008; Dorai, 2012; Badan Standardisasi Nasional, 2008).

Minyak kelapa murni merupakan salah satu hasil olahan dari buah kelapa (Cocos nucifera). Minyak kelapa murni diproduksi dari santan kelapa dengan cara mekanis atau alami, dengan atau tanpa pemanasan, tanpa penyulingan kimia, pemutihan, dan pewarnaan. Minyak kelapa murni mengandung senyawa aktif seperti antioksidan, asam amino, asam lemak esensial, dan senyawa fenol. Minyak kelapa murni berperan dalam menurunkan kolesterol, dan trigliserida darah,

(19)

5

sebagai faktor pembekuan darah, mencegah oksidasi low-density lipoprotein (LDL), merangsang insulin, dan pembakaran nutrisi makanan menjadi energi (Sutarmi, Rozaline, dan Hartin, 2005).

Virgin Coconut Oil adalah minyak yang jenuh dengan asam lemak rantai sedang (MCFA= Medium Chain Fatty Acid) seperti asam kaprat (7%), asam laurat (49%), asam miristat (18%), asam palmitat (9%), asam stearat (2%), dan minyak tidak jenuh dalam jumlah kecil seperti asam oleat (6%), dan asam linoleat (2%).

Asam laurat memiliki aktivitas antibakteri dan antiinflamasi. Asam laurat melawan Propionibacterium acnes merupakan bakteri penyebab jerawat serta melawan bakteri penyebab inflamasi (Hayatullina, et al., 2012; Ariffin and Hasham, 2016).

Hidrolisis minyak kelapa secara enzimatis dengan menggunakan enzim lipase yang spesifik terhadap posisi sn-1 dan sn-3 pada molekul lemak akan menghasilakan dua asam lemak bebas dan 2-monogliserida terutama 2- monolaurin yang mempunyai sifat antibakteri (Loung, Silalahi, and Suryanto., 2014; Silalahi and Surbakti., 2015; Petschow, et al., 1996).

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, VCO memiliki khasiat penyembuhan luka. Penelitian dilakukan secara in vivo terhadap kelinci dan tikus.

Pengobatan luka dengan minyak kelapa murni dapat mempercepat penyembuhan, seperti yang ditunjukan oleh penurunan waktu yang diperlukan untuk epitelisasi lengkap, dan tingkat lebih tinggi dari berbagai komponen kulit. Luka yang diberi VCO mengalami peningkatan kolagen, proliferasi fibroblas, dan neovaskularisasi.

Dengan demikian, VCO telah terbukti mendukung penyembuhan luka pada kulit manusia (Nevin, and Rajamohan, 2010; Santiago, et al., 2014).

(20)

6

Metode penelitian untuk uji efek penyembuhan luka bisa dilakukan dengan in vitro maupun in vivo. Uji efek penyembuhan luka dari VCO secara in vivo sudah dilakukan, sedangkan secara in vitro belum pernah dilakukan. Tujuan dari penelitian ini untuk melihat efek penyembuhan luka dari VCO dan hasil hidrolisis VCO pada kultur sel NIH3T3 secara in vitro. Analisis viabilitas sel dan aktivitas proliferasi dilakukan dengan metode MTT. Persen penutupan luka dengan metode scratch wound healing. Analisis ekspresi protein MMP-9, TGF-β1, dan PDGF-BB dengan metode imunositokimia. Analisis ekspresi gen yang mengatur proses angiogenesis (COX-2) dengan menggunakan reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR).

1.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan uraian latar belakang penelitian di atas, maka rumusan masalah penelitian adalah sebagai berikut:

a. Apakah VCO dan HVCO dapat meningkatkan aktivitas proliferasi sel NIH 3T3, ekspresi protein MMP-9, TGF-β1, PDGF-BB, dan ekspresi gen COX-2?

b. Apakah VCO dan HVCO mempunyai aktivitas penyembuhan luka secara in vitro?

1.3 Hipotesis Penelitian

Berdasarkan perumusan masalah di atas, maka hipotesis penelitian adalah sebagai berikut:

a. VCO dan HVCO dapat meningkatkan aktivitas proliferasi sel NIH 3T3,

(21)

7

ekspresi protein MMP-9, TGF-β1, PDGF-BB, dan ekspresi gen COX-2.

b. VCO dan HVCO mempunyai aktivitas penyembuhan luka secara in vitro.

1.4 Tujuan Penelitian

Berdasarkan hipotesis di atas, maka tujuan penelitian ini adalah:

a. Untuk mengetahui VCO dan HVCO dapat meningkatkan aktivitas proliferasi sel NIH 3T3, ekspresi protein MMP-9, TGF-β1, PDGF-BB, dan ekspresi gen COX-2.

b. Untuk mengetahui VCO dan HVCO mempunyai aktivitas penyembuhan luka secara in vitro.

1.5 Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah untuk memperoleh informasi tentang pengaruh VCO dan HVCO terhadap aktivitas penyembuhan luka dengan meningkatkan aktivitas proliferasi, ekspresi gen dan protein sehingga dapat digunakan sebagai sediaan topikal untuk meningkatkan penyembuhan luka.

(22)

8 1.6 Kerangka Pikir Penelitian

Uji pendahuluan dilakukan uji viabilitas, mengunakan VCO dan HVCO (variabel bebas) sebagai bahan uji dengan konsenterasi terendah 15,625 µg/mL hingga konsentrasi tertinggi 1000 µg/mL. Viabilitas sel NIH 3T3 tertinggi terdapat pada VCO dan HVCO dengan konsenterasi 62,5 µg/mL (variabel bebas).

Konsentrasi dengan viabilitas sel paling tinggi digunakan untuk mengukur parameter penyembuhan luka yaitu aktivitas proliferasi sel, persen penutupan luka, ekspresi protein MMP-9, PDGF-BB, TGF-β1 dan ekspresi gen COX-2 (variabel terikat) (Gambar 1.1).

Variabel bebas

Variabel terikat Parameter

VCO dan HVCO

Aktivitas proliferasi sel

NIH 3T3

Scratch wound healing

Ekspresi MMP-9

Ekspresi PDGF- BB

Ekspresi TGF-β1

Persentase penutupan luka

(0,24,48 jam) Persentase sel

hidup (24, 48, 72 jam)

Jumlah ekspresi MMP-9 Jumlah ekspresi

PDGF-BB

Jumlah ekspresi TGF- β1 Sel

NIH 3T3

Ekspresi COX-2 Jumlah ekspresi COX-2

Gambar 1.1 Kerangka Pikir Penelitian

(23)

9 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Kulit

Kulit adalah salah satu dari sistem integumen yang berfungsi untuk melindungi, mendukung jaringan dibawahnya, menahan tekanan namun mengakomodasi untuk pertumbuhan organisme. Tiap lapisan terdiri dari jaringan dengan fungsi yang berbeda. Struktur lapisan kulit dapat dilihat pada Gambar 2.1.

Gambar 2.1 Struktur Lapisan Kulit (Borena et al., 2015).

Kulit tidak hanya melindungi tubuh dari zat yang berbahaya, tetapi juga mencegah hilangnya cairan, dan lain sebagainya. Ketebalan kulit sekitar 2-3 mm.

Fungsi utama jaringan subkutan adalah menghubungkan kulit yang mendasari jaringan, seperti otot. Kulit memiliki dua lapisan utama yang terbuat dari jaringan yang berbeda dan memliki fungsi yang berbeda pula (Suriadi, 2004; Wang et al., 2013). Kulit terdiri dari epidermis, dermis, dan subkutan:

(24)

10 a. Epidermis

Epidermis adalah lapisan terluar kulit yang melindungi tubuh dari bahaya lingkungan luar. Ketebalan epidermis bervariasi di berbagai permukaan tubuh, mulai dari yang paling tipis dengan ketebalan ±0,05 mm pada kelopak mata hingga yang paling tebal 1,5 mm pada telapak tangan, dan telapak kaki. Stratum germinativum adalah lapisan basal epidermis. Bagian atas lapisan basal adalah stratum spinosum, stratum granulosum, stratum lucidum, dan stratum korneum.

Epidermis mengandung melanosit (sel-sel yang memproduksi melanin, pigmen kecoklatan pada kulit), sel-sel langerhans (terlibat dalam sistem kekebalan di kulit), sel-sel merkel, dan saraf sensorik (Suriadi, 2004; Lingamaneni, 2001).

b. Dermis

Dermis adalah lapisan kulit yang terletak diantara epidermis (dengan membentuk kutis) dan jaringan subkutan, yang terdiri dari jaringan ikat dan bantalan tubuh dari stress dan tegangan. Komponen struktural dari dari dermis adalah kolagen, serat elastis, dan matriks extrafibrillar. Hal ini juga berisi mechanoreceptors yang memberikan rasa sentuhan, dan panas, folikel rambut, kelenjar keringat, kelenjar sebaseus, kelenjar apokrin, pembuluh limfatik, dan pembuluh darah. Kolagen adalah protein khusus dihasilkan oleh fibroblas.

Fibroblas adalah sel kulit yang memberikan kekuatan dan ketahanan pada kulit.

Kolagen merupakan protein yang bersifat kuat, dan tidak larut (Suriadi, 2015;

Lingamaneni, 2001).

c. Lapisan subkutan

Jaringan subkutan adalah merupakan lapisan lemak dan jaringan ikat yang banyak terdapat pembuluh darah dan saraf. Lapisan ini penting untuk pengaturan

(25)

11

temperatur pada kulit. Lapisan ini dibuat dari kelompok jaringan adiposa (sel lemak) yang dipisahkan oleh fibrous septa. Sebagai bantalan jaringan yang lebih dalam pada lapisan ini berfungsi sebagai pelindung tubuh terhadap dingin, serta tempat penyimpanan bahan bakar (Suriadi, 2004; Lingamaneni, 2001).

2.2. Sel Fibroblas

Sel fibroblas (L. fibra, serat: Yunani. blatos, benih: Latin) merupakan sel yang paling umum ditemui pada jaringan ikat, dan mensintesis beberapa komponen matriks ekstraseluler (kolagen, elastin, retikuler), beberapa makromolekul anionik (glikosaminoglikans, proteoglikans) serta glikoprotein multiadhesiv, laminin, dan fibronektin yang dapat mendorong perlekatan sel pada substrat. Di samping itu, sel fibroblas mensekresikan sitokin dan beberapa faktor pertumbuhan (growth factors) diantaranya dapat menstimulasi proliferasi sel dan menghambat proses diferensiasi (Djuwita and Ekayanti., 2016). Peran fibroblas dalam membentuk dan meletakan serat-serat dalam matriks, terutama serat kolagen dapat dilihat pada Gambar 2.2.

Gambar 2.2 Peran Fibroblas dalam Membentuk dan Meletakkan Serat-serat dalam Matriks, Terutama Serat Kolagen (Djuwita dan Ekayanti.,

2016).

(26)

12

Kultur sel fibroblas terutama cell line fibroblas banyak digunakan dalam pengembangan teknik kultur sel. Sel fibroblas embrio mencit (NIH 3T3) merupakan salah satu contohnya. Fibroblas Baby Hamster Kidney (BHK-21) banyak digunakan dalam produksi vaksin, L yaitu cell line fibroblas dari tumor jaringan ikat mencit banyak digunakan dalam pengembangan teknik kultur sel selama tahun 1950-an, MRC-5 dan WI-38 yaitu sel fibroblas dari paru-paru embrio manusia banyak dimanfaatkan dalam produksi vaksin untuk manusia, dan Vero yang berasal dari ginjal Kera Hijau Afrika (African green monkey), juga digunakan dalam produksi vaksin untuk manusia. Selain itu, Mouse embryonic fibroblast (MEFs) sering digunakan sebagai feeder cells pada penelitian stem sel embrionik manusia (Harlystiarini, 2010). Kultur NIH 3T3 salah satu contoh cell line fibroblas dari embrio mencit dapat dilihat pada Gambar 2.3.

Gambar 2.3 Kultur NIH 3T3 salah satu contoh Cell Line Fibroblas dari Embrio Mencit (Harlystiarini, 2010).

2.3 Luka

Luka adalah hilangnya atau rusaknya sebagian jaringan tubuh. Keadaan ini dapat disebabkan oleh trauma benda tajam atau tumpul, perubahan suhu,zat kimia, ledakan, sengatan listrik, atau gigitan hewan (Murtutik dan Marjiyanto, 2013).

(27)

13

Luka dibagi 2 jenis, yaitu luka tertutup dan luka terbuka:

a. Luka tertutup

Luka tertutup merupakan luka dimana kulit korban tetap utuh dan tidak ada kontak antara jaringan yang ada di bawah dengan dunia luar, kerusakannya diakibatkan oleh trauma benda tumpul. Luka tertutup umumnya dikenal sebagai luka memar yang dapat digolongkan menjadi 2 jenis yaitu kontusio dan hematoma:

i. Kontusio, kerusakan jaringan di bawah kulit yang mana dari luar hanya tampak sebagai benjolan.

ii. Hematoma, kerusakan jaringan di bawah kulit disertai pendarahan sehingga dari luar tampak kebiruan (Dorland, 2006).

b. Luka terbuka

Luka terbuka adalah luka dimana kulit atau jaringan di bawahnya mengalami kerusakan. Penyebab luka ini adalah benda tajam, tembakan, benturan benda keras dan lain-lain. Macam-macam luka terbuka antara lain yaitu luka lecet (ekskoriasi), luka gigitan (vulnus marsum), luka iris/sayat (vulnus scisum), luka bacok (vulnus caesum), luka robek (vulnus traumaticum), luka tembak (vulnus sclopetinum), luka hancur (vulnus lacerum) dan luka bakar. Luka iris/sayat (vulnus scisum) biasanya ditimbulkan oleh irisan benda yang bertepi tajam seperti pisau, silet, parang dan sejenisnya. Luka yang timbul biasanya berbentuk memanjang, tepi luka berbentuk lurus, tetapi jaringan kulit di sekitar luka tidak mengalami kerusakan. Luka terbuka menimbulkan jaringan parut, setelah luka sembuh (Dorland, 2006).

(28)

14 2.4 Proses Penyembuhan Luka

Penyembuhan luka (wound healing) adalah suatu proses yang kompleks dengan melibatkan mediator larut, sel darah, matriks ekstraselular, dan sel-sel parenkim. Penyembuhan luka kulit tanpa pertolongan dari luar, berjalan secara alami. Luka akan terisi jaringan granulasi dan kemudian ditutup jaringan epitel.

Penyembuhan ini disebut penyembuhan sekunder. Cara ini membutuhkan waktu yang lama dan menimbulkan jaringan parut. Jenis penyembuhan luka yang lain yaitu penyembuhan primer, yang terjadi bila luka segera diusahakan bertaut, biasanya dengan bantuan jahitan (Suriadi, 2004; Sjamsuhidajat dan Jong, 2003).

Peran fibroblas sangat besar pada proses perbaikan, yaitu bertanggung jawab pada persiapan menghasilkan produk struktur protein yang akan digunakan selama proses rekonstruksi jaringan. Pada keadaan normal, aktivitas pembelahan fibroblas sangat jarang terlihat, namun ketika terjadi perlukaan sel ini terlihat lebih aktif dalam memproduksi matriks ekstraseluler. Proliferasi fibroblas dalam proses penyembuhan luka secara alami distimulasi oleh interleukin-Ib (IL-Ib), platelet derived growth factor (PDGF), dan fibroblas growth factor (FGF). Selain itu, Kanzaki, et al (1998) mengungkapkan bahwa migrasi fibroblas pada area perlukaan distimulasi oleh transforming growth factor (TGF), yaitu faktor pertumbuhan yang dihasilkan oleh jaringan granulasi yang terbentuk selama proses inflamasi. Proses penyembuhan luka sangat dipengaruhi oleh peranan migrasi dan proliferasi fibroblas pada area perlukaan (Kanzaki et al., 1998).

Proses penyembuhan luka dapat dilihat pada Gambar 2.4, dan terbagi dalam beberapa fase yaitu fase koagulasi/hemeostasis, fase inflamasi, fase proliferasi, dan fase remodeling.

(29)

15

Gambar 2.4 Proses Penyembuhan Luka (Borena et al., 2015).

a. Fase koagulasi/hemostasis

Cedera pada kulit merangsang platelet intravaskular menjadi kolagen subendotelial, yang membentuk trombin. Platelet diaktifkan oleh trombin melepaskan beberapa faktor pertumbuhan, akhirnya membentuk bercak hemostatik. Pada fase koagulasi merupakan awal proses penyembuhan luka dengan melibatkan platelet. Fase pertama penyembuhan luka dimulai dengan penyempitan otonom pembuluh darah sebagai respon terhadap cedera, spasme ini kemudian diikuti oleh relaksasi otot pembuluh darah dan pelepasan platelet atau trombosit (Suriadi, 2004).

Koagulasi darah memperkuat sumbat trombosit dan mengubah darah di sekitar tempat cedera menjadi suatu gel yang tidak mengalir. Sebagian besar faktor yang diperlukan untuk pembekuan darah selalu terdapat di dalam plasma dalam bentuk prekursor inaktif. Saat pembuluh mengalami cedera, kolagen yang terpapar kemudian mengalami reaksi bertahap yang melibatkan suksesif faktor- faktor pembekuan tersebut, yang akhirnya mengubah fibrinogen menjadi fibrin.

Fibrin, suatu molekul berbentuk benang yang tidak larut, ditebarkan membentuk

(30)

16

jaringan bekuan; jaring ini kemudian menangkap sel-sel darah dan menyempurnakan pembentukan bekuan. Peradangan dan angiogenesis melibatkan molekul lain seperti MMP-9, cyclooxygenase-2 (COX-2), hypoxia-inducible factor (HIF), dan prostaglandin bersama dengan VEGF yang berhubungan dengan proses penyembuhan luka. Luka merupakan keadaaan hipoksia yang dapat menginduksi ekspresi COX-2 yang mengatur HIF melalui peningkatan pembentukan prostaglandin (Sjamsuhidayat dan Jong, 2003; Guyton dan Hall, 1997; Zhou et al., 2015).

b. Fase inflamasi

Inflamasi adalah suatu respon protektif yang ditujukan untuk menghilangkan penyebab awal cedera sel serta membuang sel dan jaringan nekrotik yang diakibatkan oleh kerusakan awal. Fase inflamasi mulainya beberapa menit setelah luka. Faktor pertumbuhan dalam penyembuhan luka pada fase inflamasi dapat dilihat pada Gambar 2.5.

Gambar 2.5 Faktor Pertumbuhan dalam penyembuhan luka (Park et al., 2017) Selama fase ini, sel-sel inflammatory terikat dalam luka. Tahap kedua penyembuhan luka muncul dengan tanda eritema, pembengkakan, dan panas, sering dikaitkan dengan nyeri, tanda klasik seperti warna kemerahan karena

(31)

17

kapiler melebar (rubor), suhu hangat (kalor), rasa nyeri (dolor) dan pembengkakan (tumor) (Sjamsuhidajat dan Jong, 2003; Wild et al., 2015).

Tugas rekonstruksi merupakan proses yang kompleks dan membutuhkan sel-sel tertentu untuk mengarahkan proses ini. Pertama kali muncul dalam luka adalah neutrofil. Kemudian neutrofil akan memfagosit bakteri dan masuk ke matriks fibrin dalam persiapan untuk jaringan baru. Kemudian dalam waktu yang singkat mensekresi mediator vasodilatasi, dan sitokin yang mengaktifkan fibroblas dan keratinosit lalu mengikat makrofag ke dalam luka. Kemudian makrofag memfagosit patogen, dan sekresi sitokin dan faktor pertumbuhan seperti fibroblast growth factors (FGF), epidermal growth factors (EGF), dan VEGF, kimia ini juga akan merangsang infiltrasi, proliferasi, dan migrasi fibroblas dan sel endotel (Suriadi, 2004; Luscinskas et al., 1992).

Faktor pertumbuhan dilepaskan dari platelet yang teraktivasi termasuk faktor pertumbuhan epidermal (EGF= Epidermal Growth Factor), faktor pertumbuhan seperti EGF yang mengikat heparin, faktor pertumbuhan seperti insulin 1 (IGF-1= Insulin-like Growth Factor-1), faktor pertumbuhan sel endotele platelet, EGF yang berasal dari platelet, faktor pertumbuhan yang berasal dari trombosit (PDGF= Platelet Derived Growth Factor), faktor pertumbuhan transforming (TGF-α= Transforming Growth Factor- Alpha) dan TGF-β (TGF-β= Transforming Growth Factor- Beta). Faktor-faktor pertumbuhan ini berdifusi ke jaringan sekitarnya dan secara kemotaktis menarik neutrofil dan monosit ke dalam luka. Monosit berdiferensiasi menjadi makrofag, yang memediasi serangkaian proses vital untuk penyembuhan luka normal. Proses ini menuju proses penyembuhan luka(Park et al., 2017; Bruce et al., 1996).

(32)

18

Proses inflamasi akut ini berlangsung 1-2 hari tanpa komplikasi luka Angiogenesis adalah suatu proses dimana pembuluh-pembuluh kapiler darah yang baru mulai tumbuh dalam luka setelah luka dan perannya dalam fase proliferasi (Suriadi, 2004; Luscinskas et al., 1996).

c. Fase Proliferasi

Pada fase ini terjadi proses granulasi dan inisiasi angiogenesis. Fase ini ditandai dengan pembentukan jaringan granulasi dalam luka. Sejumlah sel-sel inflamasi berkurang selama fase ini, PDGF dan TGF-β dilepaskan dari sel-sel inflamasi secara kemotaksis menarik fibroblas ke daerah luka. Makrofag menghasilkan sumber faktor pertumbuhan, termasuk FGF (Fibroblast Growth Factor), yang menginduksi aktivasi dan proliferasi fibroblas lalu menghasilkan ECM (Extracellular Matrix). Migrasi dan proliferasi fibroblas terjadi selama 2-3 hari setelah luka. Fibroblas menghasilkan kolagen dan glikosaminoglikan, seperti kondroitin-4-sulfat, dermatan sulfat, heparin sulfat, dan asam hialuronat, yang membentuk gel amorf dimana serabut kolagen disimpan, dan agregat. Kolagen dan fibronektin dari ECM, penting untuk membentuk jaringan granulasi. MMP-9 (Metalloproteinase-9) akan membuang jaringan yang tidak digunakan untuk meningkatkan integritas struktur luka. MMP-9 dan inhibitornya (TIMP = Tissue Inhibitors of Matrix Metalloproteinases) berasal dari fibroblas, dan aktivitas mereka berlawanan. Proliferasi fibroblas terjadi bersamaan dengan angiogenesis, yang memungkinkan nutrisi dan faktor penyembuhan luka masuk ke daerah luka.

Faktor pertumbuhan bertanggung jawab terhadap regulasi angiogenesis termasuk VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor) yang dilepaskan dari makrofag atau keratinosit dan bFGF (basic Fibroblast Growth Factor) dilepaskan dari makrofag

(33)

19

atau sel endotelial yang rusak. Faktor pertumbuhan sangat berperan dalam proses penyembuhan luka (Park et al., 2017; Bruce et al., 1996).

Fibroblas menghasilkan kolagen yang banyak dan akan tampak disekeliling luka. Pada fase ini terjadi angiogenesis dengan tampak kemerahan pada luka. Proses angiogenesis difasilitasi oleh VEGFR-2. VEGFR-2 juga faktor kunci dan memfasilitasi neovaskularisasi atau angiogenesis. Jumlah VEGFR-2 yang menurun maka penyembuhan luka juga akan lama (Suriadi, 2004;

Zhou et al., 2015).

d. Fase remodeling

Fase remodeling adalah fase terakhir dari penyembuhan luka berlangsung selama 3 minggu sampai 2 tahun setelah luka. Fibroblas mulai menurun ketika kolagen disimpan. Berbeda dengan kulit normal didominasi kolagen tipe I dan III, jaringan granulasi memiliki kolagen tipe III yang lebih tinggi, dan serat kolagen yang baru terbentuk pada daerah luka tidak teratur dan diatur secara acak. Ketika penyembuhan luka berlanjut, kolagen tipe III diganti dengan kolagen tipe I dan serat kolagen diatur kembali menjadi struktur yang lebih teratur, meningkatkan kekuatan mekanik jaringan, meskipun jaringan parut yang terbentuk 70-80% dari kekuatan regangan kulit normal (Park et al., 2017; Bruce et al., 1996).

Pada fase ini serabut-serabut kolagen meningkat secara bertahap dan berrtambah tebal kemudian disokong oleh proteinase untuk perbaikan sepanjang garis luka. Serabut kolagen menyebar dengan saling terikat dan menyatu dan berangsur-angsur menyokong pemulihan jaringan. Remodeling kolagen lama pembentukan akan tergantung pada sintesis dan metabolisme kolagen secara terus-menerus. (Suriadi, 2004).

(34)

20 2.5 Uji Efek Penyembuhan Luka

2.5.1 Metode Uji Efek Penyembuhan Luka

Uji efek penyembuhan luka dapat dilakukan secara metode in vivo dan in vitro. Metode in vivo, menggunakan tikus atau kelinci. Hewan tersebut dilukai, kemudian diobati, serta diukur penyembuhan luka dalam kurun waktu tertentu Metode in vitro digunakan untuk mengukur migrasi sel yang dapat dipengaruhi oleh ekspresi gen, dan matriks ekstraseluler. Kemampuan sel tertentu untuk bermigrasi sangat penting dalam banyak proses fisiologis, seperti perbaikan jaringan dan regenerasi, serta respon sistem kekebalan tubuh. Uji aktivitas proliferasi sel, scratch wound healing, ekspresi MMP-9, PDGF-BB, TGF-β1 dan ekspresi COX-2 akan meningkat dengan adanya VCO sebagai sampel. MMP-9, PDGF-BB, TGF-β1 dan COX-2, mempengaruhi neovaskularisasi dan perkembangan fibroblas (Pusnik, et al., 2016; Bao, et al., 2009; Armstrong and Jude, 2002; Zhou, et al., 2015). Pengujian aktivitas proliferasi sel, persen penutupan luka, ekspresi MMP-9, PDGF-BB, TGF-β1 dan ekspresi COX-2 dengan metode MTT assay, scratch wound healing, ICC dan RT-PCR.

a. MTT assay

Metode MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida]

adalah uji sitotoksisitas yang bersifat kuantitatif. Uji sitotoksisitas dengan metode MTT didasarkan pada aktivitas enzim yang dapat diukur secara kolorimetri.

Metode ini cepat, sensitif, akurat dan sejumlah besar sampel dapat diuji secara otomatis menggunakan spektrofotometer. Metode ini mengukur sel yang hidup (membelah ataupun tidak membelah). Sistem pengujian menghasilkan kurva dosis-respon yang reprodusibel dengan variabilitas yang rendah (CCRC, 2013).

(35)

21

Uji ini berdasarkan pengukuran intensitas warna (kolorimetri) yang terjadi sebagai hasil metabolisme suatu substrat oleh sel hidup menjadi produk berwarna.

Intensitas warna dengan Elisa Reader, hasil pengukuran berupa absorbansi. Pada uji ini digunakan garam MTT. Garam ini akan terlibat pada kerja enzim dehidrogenase. MTT akan direduksi menjadi formazan oleh sistem reduktase suksinat tetrazolium (Gambar 2.6), yang termasuk dalam mitokondria dari sel hidup.

Gambar 2.6 Reduksi MTT menjadi Formazan (Kupcsik and Martin, 2011)

b.

Imunositokimia

Imunositokimia (ICC) merupakan suatu metode yang digunakan untuk mendeteksi adanya ekspresi suatu protein spesifik atau antigen dalam sel dengan menggunakan antibodi spesifik yang akan berikatan dengan protein atau antigen.

Ada dua jenis metode imunositokimia, yaitu metode langsung dan metode tidak langsung. Pada metode langsung, antibodi yang mengikat fluoresen atau zat warna langsung berikatan dengan antigen pada sel. Sedangkan pada metode tidak langsung, antigen diikatkan pada antibodi primer secara langsung, kemudian ditambahkan antibodi sekunder yang mengikat enzim seperti peroksidase, alkali fosfatase, atau glukosa oksidase. Antibodi sekunder akan berikatan dengan antibodi primer. Selanjutnya ditambahkan substrat kromogen yang akan diubah oleh enzim sehingga terjadi pembentukan warna (pigmen) yang akan mewarnai

MTT (Kuning) Formazan (Ungu)

(36)

22

sel. Sel harus difiksasi dengan ditempelkan pada bahan pendukung padat untuk menjamin antibodi agar dapat mengikat antigen, sehingga antigen akan immobile.

Hal ini dapat dilakukan dengan cara menumbuhkan sel pada slide mikroskop, coverslip, atau bahan pendukung plastik yang sesuai. Ada dua macam metode fiksasi, yaitu pelarut organik dan reagen cross-linking. Pelarut organik seperti alkohol dan aseton akan memindahkan lipid, mendehidrasi sel, dan mengendapkan protein. Reagen cross-linking seperti paraformaldehid membentuk jembatan intermolekuler melalui gugus amino bebas. Imunositokimia melibatkan inkubasi sel dengan antibodi. Antibodi akan berikatan dengan antigen atau protein spesifik di dalam sel. Antibodi yang tidak berikatan dipisahkan dengan pencucian, sedangkan antibodi yang berikatan dideteksi secara langsung dengan anti dengan antibodi sekuder berlabel enzim atau fluoresen. Ekspresi protein yang secara visual menunjukan bahwa sitoplasma sel perlakuan uji memberikan warna cokelat/gelap berarti positif sedangkan ekspresi protein negatif akan memberikan warna biru/ungu (Stites et al., 1997; Abbas and Lichtman, 2003; Oostra, 1996).

c. Reverse Transcriptase PCR

Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) adalah pengembangan teknologi PCR utama yang memungkinkan deteksi dan pengukuran yang reliabel terhadap produk yang dihasilkan selama setiap siklus proses PCR. Teknik ini menjadi mungkin setelah pengenalan probe oligonukleotida yang dirancang untuk menghibridisasi dalam urutan target. Pembelahan probe selama PCR karena aktivitas nukleat taq polimerase 5' dapat digunakan untuk mendeteksi amplifikasi produk target spesifik. Reverse Transcriptase PCR digunakan untuk melihat band dari DNA(Siebert, 2016).

(37)

23

2.5.2 Uji Efek Penyembuhan Luka dari Bahan Alam

Berdasarkan penelitian Freiesleben et al., (2017), metode in vitro dalam uji efek penyembuhan luka dari bahan alam dengan menggunakan sel NIH 3T3 dari fibroblas. Sebuah sel monolayer tumbuh dalam medium dilengkapi dengan serum dan lapisan sel digores dengan pipet tip untuk meniru luka. Ekstrak tumbuhan kemudian diuji dalam pengujian untuk melihat apakah bahan tersebut meningkatkan proliferasi dan / atau migrasi sel. Migrasi NIH 3T3 menjadi parameter dalam uji efek penyembuhan luka.

Sel ditanam dalam microplate 24 sumuran selama 24 jam pada suhu 37°C, dengan konsentrasi 7,6 × 10⁴ sel/mL, dan dikultur dalam medium 1 mL yang mengandung serum janin bovine 10% apabila sel monolayer telah dalam kondisi 80% konfluen. Sebuah goresan linier dibuat pada monolayer dengan pipet tip steril (Fastrak, 1250 μL Tip Makro, FR1250, Alpha Laboratories Ltd.), dan mediumnya diganti dengan 500 μL media baru (kelompok kontrol), 20 ng / mL PDGF (kontrol positif), dan ekstrak kasar (10 μg / mL). Percobaan dilakukan dirangkap tiga. Sel-sel diinkubasi pada suhu 37° C selama 21 jam. Tiga gambar difoto dari masing-masing sumuran dibawah mikroskop Leica DMLS pada perbesaran 4x/0,10 sebelum, dan sesudah inkubasi untuk mengukur proliferasi dan/atau migrasi sel. Data dianalisis dengan menggunakan aplikasi Leica.

Nilai proliferasi/migrasi sel dihitung sebagai persen penutupan luka dalam waktu 21 jam. Hasil yang diperoleh ada lima dari tujuh belas tumbuhan yang persen penutupan lukanya lebih dari 120% yaitu ekstrak panas dan dingin dari herba Allophylus spicatus; ekstrak panas daun dan buah Philenoptera cyanescens;ekstrak panas herba Melanthera scandens; ekstrak dingin herba

(38)

24

Ocimum gratissimum; ekstrak panas daun Jasminum dichotomum. Hasil dari penelitian ini hanya lima yang mampu meningkatkan proliferasi dan migrasi fibroblas.

Topman et al., (2012) juga menggunakan metode in vitro dalam uji efek penyembuhan luka dari bahan alam dengan menggunakan sel NIH 3T3 dari fibroblas. Sebuah sel monolayer tumbuh dalam medium dilengkapi dengan serum, dan lapisan sel dirusak dengan mikro indentor logam untuk meniru luka. Medium segera diganti untuk membersihkan dari serpihan. Mikrograf luka (perbesaran 2560x1920; 3 pixels/ µm) akan direkam secara otomatis setiap 2 jam selama 14 jam menggunakan kamera digital (DS-Fi1, Nikon) yang dihubungkan ke mikroskop fase kontras. Ada 5 pengukuran yang dilakukan yaitu tingkat migrasi maksimum (Maximum Migration Rate=MMR), waktu untuk migrasi (Time for Onset of Mass Cell Migration=TOMCM) ketika penutupan luka sekitar 10%, waktu akhir migrasi (Time for End of Mass Cell Migration=TEMCM) ketika penutupan luka sudah 95 %, rata-rata migrasi (Average Migration Rate=AMR) slope antara TOMCM dengan TEMCM, dan integral daerah kurva.

Pengukuran TOMCM satu-satunya cara melihat perbedaan signifikan antara curcumin dan ginger tetapi secara statistik tidak menunjukan perbedaan dengan kontrol. Semua kelompok bahan alam tidak ada perbedaan dengan data kontrol. Oleh karena itu dapat disimpulkan bahwa bahan alam tersebut tidak mempengaruhi kinematik migrasi fibroblas. Uji penyembuhan luka juga dilakukan secara in vivo.

Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, madu juga dapat menyembuhkan luka. Madu memiliki kemampuan untuk meningkatkan

(39)

25

pembentukan granulasi jaringan, merangsang pertumbuhan jaringan, mengurangi edema, peradangan, dan meningkatkan sintesis kolagen (Dorai, 2012).

Berdasarkan penelitian Sukur, et al., (2011), menggunakan metode in vivo percobaan dibagi ke dalam tiga kelompok tikus. Kelompok A diinokulasi dengan Pseudomonas aeruginosa, kelompok B diinokulasi dengan Klebsiella pneumoniae, dan kelompok C diinokulasi dengan Acinetobacter baumannii.

Setiap luka diberi madu tualang, gel kitosan, dan hydrofibre silver. Pada hari ke- 21, luka yang diobati madu tualang lebih kecil dibanding dengan gel kitosan dan hydrofibre silver. Pemberian topikal madu tualang pada luka bakar yang terkontaminasi dengan P. Aeruginosa dan A. Baumannii menunjukan tingkat penyembuhan luka tercepat dibandingkan dengan obat lain.

Yang et al., (2017) melakukan uji efek penyembuhan luka dari ekstrak Angelica dahurica (Dahurian) and Rheum officinale (Kalembak). Penelitian dilakukan terhadap lima kelompok tikus. Kelompok A diberi normal salin (NS), kelompok B diberi ekstrak Angelica dahurica (AE), kelompok C diberi ekstrak Rheum officinale (RE), kelompok D diberi Ekstrak Angelica dahurica and Rheum officinale (ARE), dan kelompok E diberi Biomisin (BM).

Hasil menunjukan kontraksi luka pada kelompok ARE secara signifikan lebih tinggi daripada kelompok NS dan BM (P<0,05). Analisis histologis menunjukan infiltrasi sel inflamasi lebih banyak, serat kolagen, dan miofibroblas pada kelompok ARE daripada kelompok NS pada hari ke 3-5. Pada kelompok ARE, kadar plasma IL-6 meningkat selama hari ke 3-5. Kesimpulan dari penelitian ini, ARE mempercepat penyembuhan luka selama fase inflamasi dan proliferasi.

(40)

26

Nevin and Rajamohan (2010) melakukan uji efek penyembuhan luka dari VCO. Penelitian dilakukan terhadap tiga kelompok tikus. Kelompok kontrol, kelompok yang diberi 0,5 ml VCO, dan kelompok ketiga yang diberi 1 ml VCO.

Hasil yang diperoleh, VCO mengobati luka sembuh jauh lebih cepat, seperti yang ditunjukkan oleh penurunan waktu epitelisasi lengkap dan tingkat yang lebih tinggi dari berbagai komponen kulit. Pepsin-larut kolagen menunjukan peningakatan yang signifikan pada luka yang diberi VCO. Aktivitas glikohidrolase juga meningkat karena kadar kolagen meningkat. Aktivitas enzim antioksidan, dan mengurangi glutation, dan malondialdehid ditemukan meningkat pada hari ke-10 setelah melukai tikus, dan kembali normal pada hari ke-14 pada luka yang diobati. Lipid peroksida lebih rendah pada luka yang diobati. Penelitian ini menunjukan adanya peningkatan proliferasi fibroblas dan neovaskularisasi pada luka yang diberi VCO dibandingkan kontrol.

Silalahi and Surbakti (2015) melakukan metode in vivo dengan menggunakan kelinci. Penelitian terbagi dalam 5 kelompok. Kelompok A ialah kelompok kontrol, kelompok B ialah menggunakan bioplacenton® (kontrol positif), kelompok C ialah menggunakan VCO 0% ( tidak terhidrolisis), kelompok D ialah menggunakan VCO terhidrolisis 35%, dan kelompok E ialah menggunakan VCO terhidrolisis 70%. Luka bakar dibuat dengan menempatkan pelat logam panas berdiameter 2 cm. Bahan dioleskan secara topikal ke luka setiap hari sebanyak 0,1 ml. Diameter lesi diukur setiap hari, dan waktu dicatat sampai diameter luka sembuh adalah nol. Hasil penelitian menunjukan proses penyembuhan paling cepat bila diobati dengan VCO terhidrolisis 70% (12 hari), diikuti dengan VCO terhidrolisis 35% (15,5 hari),

(41)

27

VCO tidak terhidrolisis (17,3 hari), Bioplacenton® (18,1 hari), dan waktu penyembuhan terpanjang yang tidak diobati/kontrol negatif (23,5 hari). Ada perbedaan yang signifikan tingkat penyembuhan luka bakar di antara masing- masing perlakuan. Namun tidak terdapat perbedaan yang signifikan antara kelompok kontrol positif (Bioplacenton®) dan VCO 0% (tanpa hidrolisis).

Kemampuan VCO untuk menyembuhkan luka bakar dipercepat dengan meningkatkan derajat hidrolisis parsial VCO menjadi 12 hingga 15 hari.

Hasil penelitian uji efek penyembuhan luka dari berbagai bahan alam dapat dilihat pada Tabel 2.1.

Tabel 2.1 Efek penyembuhan luka dari berbagai bahan alam

NO Sampel Metode Hasil Referensi

1 a. Aframomum melegueta b. Allophylus spicatus c. Annona senegalensis d. Cissus quadrangularis e. Gymnanthemum

coloratum

f. Indigofera pulchra g. Jasminum dichotomum h. Leonotis nepetifolia i. Melanthera scandens j. Millettia thonningii k. Ocimum gratissimum l. Philenoptera cyanescens m. Rourea coccinea n. Thonningia sanguinea o. Trichilia monadelpha p. Triumfetta rhomboidea q. Uvaria ovate

a Dari 17 tumbuhan, proliferasi dan migrasi fibroblas kelompok ekstrak panas daun dan buah Philenoptera cyanescens (130%) paling tinggi yang dibandingkan dengan kontrol (120%)

Freiesleben et al., (2017)

2 a. Curcumin b. Aloe vera

c. Zingiber officinale

a MMR, AMR, TOMCM,

TEMCM berturut-turut:

Kontrol: 0,07;0,035;3,5;30 Curcumin: 0,06;0,03;3;35 Aloe vera:0,09;0.04;4;25 Zingiber

officinale:0,08;0,035;4,5;25 Kelompok perlakuan tidak signifikan mempengaruhi migrasi fibroblas

Topman et al., (2013)

(42)

28 Tabel 2.1 (Sambungan)

3 Madu Tualang b Ukuran luka pada kelompok

luka yang terkontaminasi P.Aeruginosa , K.

pneumonia, A. Baumannii berturut-turut yang diberi madu tualang (9;29,5;16) lebih kecil daripada Chitosan gel (26;20;24), Hydrofibre silver (11;27;28) Pemberian topikal madu tualang pada luka bakar yang terkontaminasi dengan P.Aeruginosa dan A.

Baumannii menunjukan tingkat penyembuhan luka tercepat dibandingkan dengan obat lain pada hari ke 21.

Sukur et al., (2011)

4 a. Angelica dahurica (Dahurian)

b. Rheum officinale (Kalembak)

b Kadar IL-6 dan TGF-β1 (pg/mL) hari ke-3,4,5 pada kelompok kontrol

(10,25,10;80,45,40) dan ARE (19,26,25;40,38,42) ARE mempercepat penyembuhan luka selama fase inflamasi dan proliferasi karena meningkatkan IL-6 dan TGF-β1.

Yang et al., (2017)

5 Minyak Kelapa Murni (Virgin Coconut Oil=VCO)

b Kadar kolagen (mg hidroksiprolin/mg jaringan) dan aktivitas glikohidrolase kontrol (800;0,6) dan VCO (1200;1,4) Peningkatan kadar kolagen dan aktivitas glikohidrolase

mempengaruhi peningkatan proliferasi fibroblas dan neovaskularisasi pada luka lebih besar yang diberi VCO dibandingkan kontrol.

Nevin and Rajamohan (2010)

6 Minyak Kelapa Murni (Virgin Coconut Oil=VCO)

b VCO (15 hari) yang tidak dihidrolisis sama waktu sembuh dengan

Bioplacenton® (17 hari), seadangkan VCO

terhidrolisis (12 hari) waktu sembuh jauh lebih singkat daripada Bioplacenton®

Silalahi and Surbakti (2015)

Keterangan: a=in vitro, b=in vivo