51
Lampiran 1. Alur Kerja Isolasi Bakteri Asam Laktat (Bucio et al. 2006)
Bagian usus ikan mas (C. carpio)
dicuci dan dibersihan dengan akuades steril
dikerik dinding mukosa usus dengan spatula steril
dilakukan pengenceran hingga 10-8 secara berseri
dari setiap pengenceran 10-4 hingga 10-8 diambil 0,1 ml dan disebarkan pada medium MRS agar
diinkubasi pada suhu 28 0C selama 24-48 jam
Hasil
diambil cairan mukosa usus sebanyak 1 mL
dihomogenkan di dalam 9 mL larutan PBS (phosphat buffer saline)
menit
Koloni BAL
Lampiran 2. Alur Kerja Karakterisasi BAL
Isolat murni BAL
Pewarnaan Gram Uji Biokimia
dikarakterisasi berdasarkan struktur dan warna koloni
diamati dengan
mikroskop Uji sitrat
Uji gelatin
Uji motilitas
Uji katalase
Uji TSIA Hasil
Lampiran 3. Alur Kerja Seleksi BAL Potensial dalam Menghambat Pertumbuhan A. salmonicida
diinokulasikan mikroba patogen dengan metode usap menggunakan cotton bud dengan absorbansi 0,5 standar Mc-Farland 108 CFU/ml
diletakkan cakram kertas yang telah ditetesi dengan suspensi BAL pada jarak yang telah ditentukan
diletakkan cakram pembanding yaitu khloramphenikol
diinkubasi pada suhu 28-30 oC selama 3 hari
diamati dan diukur zona hambat yang terbentuk
Media MHA
Lampiran 4. Alur kerja Kurva Pertumbuhan BAL
dimasukkan kedalam 30 mL media cair MRSB
diinkubasi pada 28 0C
dihitung nilai kerapatan optik atau optical density (DO)
isolat terpilih BAL dengan menggunakan
spektrofotometer pada panjang gelombang 600 nm,
pada rentang waktu 3 jam selama 24 jam
Kultur BAL
terpilih
Lampiran 5. Alur Kerja Produksi Senyawa Antimikroba BAL
diinokulasikan sebanyak 10 mL kedalam 400 media NB
diinkubasi pada suhu 28 0C selam 15 jam
disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 0C selama 15 menit sebanyak 100 mL kultur
disaringan senyawa antimikroba dengan kertas saring 0,22 µm (MS®Syringe filter)
Kultur cair BAL berumur 21 jam
Lampiran 6. Uji Aktivitas Ekstrak Kasar Senyawa Antimikroba BAL dalam menghambat pertumbuhan bakteri A. salmonicda
dituang ke dalam cawan petri
dibiarkan memadat
diinokulasi bakteri patogen Aeromonas salmonicida diletakkan cakram yang telah ditetesi dengan senyawa antimikroba ekstrak kasar BAL pada jarak yang telah ditentukan
diletakkan cakram pembanding Khlorampenikol
diinkubasi pada suhu 28-30 oC selama 3 hari
diamati dan diukur zona hambat yang terbentuk Media
MHA
Hasil
Lampiran 7. Alur Kerja Pembentukan Biofilm Aeromonas salmonicida
Dipotong seluas 1cm2 dan dicuci pada bak sonikator selama 15 menit
di autoklaf kedua lempeng selama 15 menit, tekanan 1 atm pada suhu 121 0C.
ditumbuhkan A. salmonicida pada media NB sebanyak 50 ml dengan konsentrasi sel 108 CFU/ml dalam labu erlenmeyer.
diangkat dari kultur, masing-masing dibilas sebanyak 3 kali dengan 10 ml akuades steril
dimasukkan ke 9 ml larutan garam fisiologis NaCl 0,85 % yang ditambah dengan 0,5 g manik-manik kaca mikro (glass bead),
dihomogenkan untuk melepas sel biofilm selama 2 menit.
dilakukan pengenceran berseri.
disebar 0,1 ml kultur pada media PCA, diinkubasi pada suhu 28 0C selama 24 jam.
dilakukan perhitungan jumlah sel dengan metode TPC
Jumlah Sel Biofilm Biofilm terbentuk
1,3, dan 5 hari Lempeng PVC dan
Lampiran 8. Bagan Alir Pengendalian Sel Biofilm oleh biomassa sel BAL
dipreparasi berdasarkan perlakuan sebelumnya
dibilas 3x dengan akuades steril untuk melepas sel plantonik
dimasukkan dalam masing-masing tabung steril,
ditambahkan 9 mL kultur BAL dengan kepadatan 108 CFU/mL yang berasal dari kurva pertumbuhan
dibilas 3x dengan akuades steril untuk melepas sel plantonik
dimasukkan ke dalam 9 ml NaCl 0,9% dan 0,5 g serbuk kaca (glass bead)
dilakukan pengenceran berseri
disebar 0,1 ml dari tiap pengenceran pada media PCA
diinkubasi pada suhu 28oC selama 24 jam.
dihitung jumlah koloni yang tumbuh Jumlah sel
biofilm Lempeng Biofilm
