1. Abbas K A, Lichtmant A H. Basic Immunology Fourth Edition.
Philadelphia: Elsevier; 2012. h.15-20.
2. Kresno S B. Imunologi Diagnosis dan Prosedur Laboratorium. Jakarta:
Badan Penerbit Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2010.
3. Baratawidjaya K G. Imunologi Dasar Edisi ke-10. Jakarta: Badan Penerbit
Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia; 2012.
4. Rich Robert. Clinical Immunology Fourth Edition. USA: Elsevier; 2013.
h.114-18.
5. Dharmana Edi, Neni Susilaningsih, Noor Wijayahadi. Pengaruh
Pemberian Tolak Angin Anak Terhadap Proliferasi Limfosit, produksi
Interferon, Fungsi Fagositosis Makrofag Dan Produksi ROI. Semarang:
Universitas Diponegoro dan PT Sido Muncul; 2009.
6. Hariwangsa N T. Pengaruh Pemberian Tolak Angin Anak Cair Terhadap
Kadar Interferon Gamma (IFN-γ) Pada Mencit Swiss. Semarang:
Universitas Diponegoro; 2010.
7. Wahab A S, Madarina Julia. Sistem Imun, Imunisasi, dan Penyakit Imun.
Jakarta: Penerbit Widya Medika; 2002. h.13
8. Abbas K A, Lichtmant A H, Pillai S. Cellular and Molecular Immunologi.
Seventh ed. Philadelphia : W B Saunders Company; 2012.
9. Peakman Mark, Vergani Diego. Basic and Clinical Immunology Second
Edition. USA: Elsevier; 2009. h.77-81.
10. Baratawidjaja K G, Iris Rengganis. Alergi Dasar Edisi ke-1. Jakarta:
11. Paul, William. Fundamental Immunology SSeventh Edition. Philadelphia:
Lippincott Williams and Wilkins; 2013. 602-04.
12. Rich Robert. Clinical Immunology Fourth Edition. USA: Elsevier; 2013.
208-09.
13. Rich Robert. Clinical Immunology Fourth Edition. USA: Elsevier; 2013.
216.
14. Tolak Angin-Tolak Angin Anak. Obat Herbal Terstandard Tolak Angin.
[Internet]. [cited 2016 Jan 21]. Available from:
http://xa.yimg.com/kq/groups/78262509/931225350/name/TA-TAA-SARI.pdf
15. Kohei Kamiya, Toshiko Satake. Chemical constituents of Baeckea
frutescens leaves inhibit copper-induced low-density lipoprotein oxidation. Fitoterapia [Internet]. 2009. [cited 2015 Nov 12]. Available from: sciencedirect.com
16. Sunarti, Siti. Jungrahab (Baeckea frustescens L.). Satu-satunya Tumbuhan Obat dari Marga Baeckea di Indonesia dan Koleksinya di Herbarium Bogoriense; 2011.
17. Kamiya, Kohei. Chemical Constituents of Baeckea frustescens Leaves Inhibit Copper-induced low-density Lipoprotein Oxidation [Internet].
2009. [cited 2015 Nov 14]. 8(10): 185-189. Available from:
www.elsevier.com/locate/foodchem
18. Jia, Bei-Xi. Baeckeins F-I, Four Novel C-methylated Biflavonoids from
the Roots of Baeckea frutescens and Their Anti-inflamatory Activities [Internet]. 2014. [cited 2015 Nov 14]. 155(14): 31-37. Available from:
www.ellsevier.com/locate/foodchem
19. Dai, Do N. Chemical Composition of Essential Oil of Baeckea frutuescens
L. [Internet]. 2015. [cited 2015 Nov 14]. 8(1): 26-32. Available from:
20. Baliga, M. S. Radioprotective potential of mint: A brief review. J Cancer
Res Ther [Internet]. 2010. [cited 2015 Nov 12]. 6(3): pp 255-62.
21. Departemen Farmakologi dan Terapeutik Fakultas Kedokteran Universitas
Indonesia. Farmakologi dan Terapeutik. Edisi 5. Jakarta: Balai Penerbit.
Lampiran 1.
PROSEDUR ISOLASI MAKROFAG PERITONEAL MENCIT
(dikutip dari Lewis JG, 1995)
Untuk mendapatkan 1-3 x 106 sel/ml
Alat :
1. Gunting dan pinset
2. Semprit 10 ml steril dengan jarum ukuran 18 atau 20 gauge
3. Tabung sentrifus 50 ml steril
4. Pipet Pasteur steril
5. Tabung berlapis silikon
6. Hemacytometer
7. Laminar flow hood
8. Refrigerated centrifuge
Bahan / reagen :
1. Sodium pentobarbitol, 50 mg/ml
2. Ethanol, 70% (v/v)
3. Free Hank’s balanced salt solution (CMF-HBSS), mengandung Ca2+ dan
Mg2+ (GIBCO)
4. Asam acetat 3 % (v/v) + crystal violet 1 mg/100 ml
6. Fetal Bovine Serum, FBS
7. Glutamin (GIBCO)
8. Penicillin-Streptomycin (GIBCO)
Prosedur :
1. Mencit dibunuh dengan dislokasi leher atau inhalasi dengan sodium
pentobarbitol atau CO2, dibaringkan telentang dan seluruh permukaan ventral disiram ethanol 70%
2. Buat irisan kecil pada kulit menggunakan gunting pada medial abdomen.
Robek kulit menggunakan 2 pinset kearah kepala dan ekor mencit, sehingga
kulit terkelupas, dan tampak peritoneum. Basahi peritoneum dengan ethanol
70% untuk menyingkirkan bulu- bulu yang rontok
3. Injeksikan 2-3 ml CMF-HBSS dalam rongga peritoneum menggunakan
semprit 10ml dengan jarum no. 18 atau 20 (lebih baik pakai no 26). Injeksi
dilakukan di bagian perut bawah dimana lemak berada di sekitar kandung
kemih. Lokasi ini dipilih karena setelah penyuntikan jarum akan ditarik dan
abdomen/peritoneum dipijat, lemak akan melekat pada lubang jarum
sehingga cairan tidak keluar selama pemijatan. Peritoneum dipijat pelan
kemudian disemprot lagi dengan ethanol 70%
4. Injeksikan 7-8 ml HBSS. Sedot kembali cairan dalam rongga peritoneum
sampai habis (dengan jarum 18/ 20 ujung jarum menghadap ke atas/ventral),
bila masih ada sisa cairan dihisap menggunakan pipet Pasteur steril.
Masukkan cairan ke dalam tabung sentrifuse steril
5. Cairan disentrifus 800 xg pada suhu 20o C selama 5 menit. Bila cairan
terkontaminasi darah, maka cuci sel- sel tersebut 2 kali menggunakan
6. Tambahkan medium komplit yang terdiri dari RPMI 1640 mengandung
penicillin (50 U/ml), streptomycin (50μg/ml), glutamine (20mM) dan 10%
FBS
7. Setelah itu cairan peritonium diambil sebagian dimasukkan ke dalam
tolliven blue. Hitung sel- sel dengan Hemacytometer setelah dilarutkan
dalam 3% asam acetat untuk melisiskan sel darah merah
8. Kultur sel dalam medium komplit dengan kepadatan 5 x 105 sel/ml selama 2
jam dalam CO2 inkubator pada suhu 37o C
9. Cuci sel- sel tersebut dengan HBSS sebanyak 3 kali, kemudian tambahkan 1
ml medium komplit untuk selanjutnya dikultur dalam CO2 inkubator pada suhu 37o C selama 24 jam
Modifikasi dari Lewis JG. Isolation of Alveolar Macrophages, Peritoneal Macrophages, and Kupffer cells. In : Methods in Immunotoxicology vol 2, editor : Burleson GR, Dean JH, Munson AE. New York: A John Wilye Liss & sons Inc
Lampiran 2. Prosedur Isolasi Splenosit
PROSEDUR ISOLASI SPLENOSIT
(Metode Mishell (1980) dan Ding (1994)
Untuk mendapatkan 5 x 107– 2 x 108 sel/ mencit
Alat :
1. Pemanas alkohol
2. Beaker glass volume 50 – 75 ml
3. Gunting
4. Pinset
5. Petri dishes plastik
6. Refrigerated centrifuge
7. Pipet Pasteur
8. Laminar flow hood
9. Spuit disposable 5 cc
Bahan :
1. Sodium pentobarbitol, 50 mg/ml
2. Ethanol, 70% (v/v)
3. Free Hank’s balanced salt solution (CMF-HBSS), mengandung Ca2+ dan
Mg2+ (GIBCO)
4. Lysing buffer (NH4Cl 0,17 M)
6. Fetal Bovine Serum, FBS
7. Glutamin (GIBCO)
8. Penicillin-Streptomycin (GIBCO)
Prosedur :
1. Mencit dibunuh dengan dislokasi leher atau inhalasi dengan sodium
pentobarbital, dibaringkan telentang dan seluruh permukaan ventral
disiram ethanol 70%.
2. Buat irisan kecil pada kulit menggunakan gunting pada medial abdomen.
Robek kulit menggunakan 2 pinset kearah kepala dan ekor mencit,
sehingga kulit terkelupas, dan tampak peritoneum. Basahi peritoneum
dengan ethanol 70% untuk menyingkirkan bulu- bulu yang rontok.
3. Rendam gunting dan pinset dalam ethanol 95%. Gunting peritoneum
dengan irisan berbentuk huruf U mengelilingi limpa. Peritoneum dilipat ke
atas, angkat limpa dengan menggunakan pinset. Pisahkan limpa dari
pembuluh darah dan jaringan sekitarnya menggunakan gunting. Letakkan
limpa pada petri dish berisi 1,5 ml HBSS.
4. Semprotkan media menggunakan spuit ke dalam limpa sampai semua sel
keluar.
5. Dengan menggunakan pipet Pasteur, pindahkan suspense sel tabung
pemusing. Biarkan sel- sel yang menggumpal mengendap selama 5 atau 6
6. Pindahkan suspense sel ke tabung yang lain dan pusingkan sel pada
kecepatan 200 xg selama 10 menit pada suhu 4oC. Pellet yang didapat
diresuspensikan dalam 2 ml lysing buffer pada suhu ruang (25oC)
dikocok-kocok untuk melisiskan eritrosit, lalu pusingkan pada kecepatan 200 xg
selama 10 menit pada suhu 4oC.
7. Buang supernatant dan pellet dicuci 2x dengan RPMI dengan cara dipipet
berulang- ulang dan dipusingkan pada kecepatan 200 xg selama 10 menit
pada suhu 4oC.
8. Hitung sel- sel menggunakan hematocytometer.
9. Untuk keperluan pemeriksaan sitokin (mis : IFN–γ), kultur sel dengan
kepadatan 3 x 106 sel/ml dalam medium komplit yang terdiri dari RPMI
1640 mengandung penisilin (50 U/ml), streptomycin (50 µg/ml),
glutamine (1 mM) dan 10 % FBS selama 72 jam dalam CO2 inkubator
Lampiran 4. Prosedur Pemeriksaan TNF-
PROSEDUR PEMERIKSAAN TNF-
Reagen (kit) yang tersedia :
1. Microwell plate berlapis Ab monoklonal spesifik terhadap TNF- mencit
2. Biotin-Conjugate
3. Streptavidin-HRP
4. Mouse TNF- standard lyophilized
5. Calibrator diluent
6. Sample diluent
7. Assay buffer
8. Wash buffer
9. Substrate Solution
10. Stop Solution
11. Adhesive films
Alat dan bahan tambahan yang dibutuhkan :
1. Micropipet
2. Distilled water
3. ELISA reader
4. Tube eppendorf
Persipan reagen :
- Siapkan tube 7 buah (S1-S7).
- Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam masing-masing tube.
- Tambahkan 100 μl mouse TNF- standard ke dalam tube S1.
- Lakukan pengenceran bertingkat.
2. Pengenceran wash buffer : 50 ml wash buffer diencerkan dalam 950 ml
distilled water.
3. Pengenceran Assay buffer : 5 ml assay buffer diencerkan dalam 95 ml
distilled water.
4. Pengenceran Biotin-conjugate : 0,06 ml biotin-conjugate diencerkan dalam
5,94 ml assay buffer.
5. Pengenceran Streptavidin-HRP : 0,06 ml Streptavidin-HRP dalam 5,94 ml
Assay buffer.
Persiapan sampel :
Sampel berupa supernatant yang berasal dari kultur splenosit selama 72 jam.
Prosedur pemeriksaan :
1. Tentukan jumlah microwell strips yang dibutuhkan.
2. Cuci microwell strips 2 kali dengan wash buffer.
3. Tambahkan 100 μl standard dilution ke dalam standard well.
4. Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam blank well.
5. Tambahkan 50 μl sample diluent ke dalam sample well.
6. Tambahkan 50 μl sample A, B, C ke dalam sample well.
8. Tambahkan 50 μl biotin-conjugate ke semua well.
9. Tutup microwell strips dan inkubasi 2 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
10. Siapkan Streptavidin-HRP.
11. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
12. Tambahkan 100 μl streptavidin-HRP ke semua well.
13. Tutup microwell strips dan inkubasi 1 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
14. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
15. Tambahkan 100 μl substrate solution ke semua well.
16. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan (18-25o C).
17. Tambahkan 100 μl stop solution ke semua well.
Lampiran 4. Prosedur Pemeriksaan IFN-γ
PROSEDUR PEMERIKSAAN IFN-γ
Reagen (kit) yang tersedia :
12. Microwell plate berlapis Ab monoklonal spesifik terhadap IFN- γ mencit
13. Biotin-Conjugate
14. Streptavidin-HRP
15. Mouse IFN- γ standard lyophilized
16. Sample diluent
17. Assay buffer
18. Wash buffer
19. Substrate Solution
20. Stop Solution
21. Pewarna (blue-dye, green-dye, red-dye)
22. Adhesive films
Alat dan bahan tambahan yang dibutuhkan :
5. Micropipet
6. Distilled water
7. ELISA reader
8. Tube eppendorf
Persipan reagen :
- Siapkan tube 7 buah (S1-S7).
- Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam masing-masing tube.
- Tambahkan 100 μl mouse IFN- γ standard ke dalam tube S1.
- Lakukan pengenceran bertingkat.
7. Pengenceran wash buffer : 50 ml wash buffer diencerkan dalam 950 ml
distilled water.
8. Pengenceran Assay buffer : 5 ml assay buffer diencerkan dalam 95 ml
distilled water.
9. Pengenceran Biotin-conjugate : 0,06 ml biotin-conjugate diencerkan dalam
5,94 ml assay buffer.
10. Pengenceran Streptavidin-HRP : 0,06 ml Streptavidin-HRP dalam 5,94 ml
Assay buffer.
Persiapan sampel :
Sampel berupa supernatant yang berasal dari kultur splenosit selama 72 jam.
Prosedur pemeriksaan :
19. Tentukan jumlah microwell strips yang dibutuhkan.
20. Cuci microwell strips 2 kali dengan wash buffer.
21. Tambahkan 100 μl standard dilution ke dalam standard well.
22. Tambahkan 100 μl sample diluent ke dalam blank well.
23. Tambahkan 50 μl sample diluent ke dalam sample well.
24. Tambahkan 50 μl sample A, B, C ke dalam sample well.
26. Tambahkan 50 μl biotin-conjugate ke semua well.
27. Tutup microwell strips dan inkubasi 2 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
28. Siapkan Streptavidin-HRP.
29. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
30. Tambahkan 100 μl streptavidin-HRP ke semua well.
31. Tutup microwell strips dan inkubasi 1 jam pada suhu ruangan (18-25o C).
32. Kosongkan dan cuci microwell strips 3 kali dengan wash buffer.
33. Tambahkan 100 μl substrate solution ke semua well.
34. Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan (18-25o C).
35. Tambahkan 100 μl stop solution ke semua well.
HASIL OUTPUT ANALISIS DATA
6 368.9276 399.11185 202.6730 7.46 948.92
6 214.3011 141.75122 196.2375 52.10 389.74
6 46.9091 53.66405 25.2300 8.14 148.51
18 210.0460 268.17118 95.0863 7.46 948.92
Kelompok P1 P2 P3 Total
N Mean Std. Deviation Median Minimum Maximum
IFN-gamma
Test of Homogeneity of Variances
IFN-gamm a
12.074 2 15 .001
Levene
Statistic df1 df2 Sig.
Test of Homogeneity of Variances
Log10IFN_gam ma
1.781 2 15 .202
Levene
Oneway
2.294 2 1.147 3.575 .054
4.813 15 .321
Squares df Mean Square F Sig.
Case Summaries
TNF-alfa
5 17.2586 11.37048 16.3340 .62 28.33
5 258.9940 90.72331 230.1100 186.65 417.01
5 1828.8900 213.13784 1864.2000 1467.00 2007.60
15 701.7142 840.50073 230.1100 .62 2007.60
Kelompok P1 P2 P3 Total
N Mean Std. Deviation Median Minimum Maximum
TNF-alfa
Tests of Normality
.722 5 .016
.838 5 .160
.798 5 .078
Kelompok P1 P2 P3 Log10TNF_alfa
Statistic df Sig.
Shapiro-Wilk
Lilliefors Significance Correction a.
Test of Homogeneity of Variances
TNF-alfa
3.133 2 12 .080
Levene
NPar Tests
N Mean Rank Sum of Ranks
Test Statisticsb
Not corrected for ties. a.
NPar Tests
Not corrected for ties. a.
N Mean Rank Sum of Ranks
Test Statisticsb
Not corrected for ties. a.
Foto Kegiatan Penelitian
