1
Uji Potensi Antimikroba Ekstrak N-Heksana Kulit Biji (Pericarp) Jambu Mete
(Anacardium Occidentale) Terhadap Bakteri SalmonellaEnteritidis SP-1-PKH secara In Vitro
In vitro Antimicrobial Potential Assay of Cashew (Anacardiumocidentale) Nut Shell (Pericarp) n-Hexane Extracts Against Salmonella enteritidis SP-1-PKH
Muhammad Yunan Farid, Sri Murwani, Herawati
Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya
drh.yunan@gmail.com ABSTRAK
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui potensi antimikroba ekstrak n_Heksana kulit biji jambu mete terhadap bakteri Salmonella enteritidis secara in vitro. Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental dengan metode post test control design only yang dilakukan secara in vitro menngunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dan diuji secara statistik menggunakan one way ANOVA, uji Tukey HSD, serta uji korelasi-regresi dengan (α:0.05). Uji antimikroba dilakukan dengan metode Tube dilution test untuk mengamati Kadar Hambat Minimal (KHM) dan Kadar Bunuh Minimal (KBM) dengan kelompok perlakuan konsentrasi ekstrak 25%,30%,35%,40%,45%,dan50%. Hasil menunjukkan bahwa ekstrak kulit biji jambu mete dengan pelarut n_Heksana memiliki potensi antimikroba dengan nilai KBM pada konsentrasi 45%, sedangkan nilai KHM dalam penelitian ini tidak dapat ditentukan. Dari hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa ekstrak pericarp
Jambu mete dengan pelarut n-Heksana memiliki potensi antimikroba terhadap Salmonella enteritidis SP-1-PKH secara in vitro.
Kata Kunci: S.enteritidis, antimikroba, Ekstrak n-Heksana, kulit biji (pericarp) jambu mete, in vitro
ABSTRACT
This study aims to determine the antimicrobial potency of cashew nut shell of n-Hexane extract against
Salmonella enteritidis in vitro. This study is an experimental study in the form of post-test only control group design with the tube dilution method. This study is an experimental research method post test control design is done only in vitro alkaline completely randomized design (CRD) and statistically tested using one-way ANOVA, Tukey HSD test, correlation and regression test (α: 0.05). Antimicrobial test done by Tube dilution test methods for observing Minimal Inhibitory Concentration (MIC) and Minimal Bacteriacidal Concentration (MBC) with extract concentration treatment group of 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, and 50%. Results showed that the extract of cashew nut shell by n_Hexane solvent antimicrobial potential value of MBC at a concentration of 45%, while the value of MIC in this study can not be determined. From the results can be concluded that the pericarp cashew extract with n-Hexane solvent has antimicrobial potency against Salmonella enteritidis SP-1-PKH in vitro
2 Pendahuluan
Salmonella enteritidis merupakan salah satu emerging foodborne zoonotic pathogens, ditemukan pada spesies unggas dan dengan mudah dapat ditularkan ke manusia. Penyakit akibat infeksi Salmonella disebut salmonellosis, lebih dari 44% wabah salmonellosis yang terjadi di seluruh dunia. Hasil survei yang dilakukan di Belanda menyebutkan 94% tinja ayam pedaging dan 47% tinja ayam petelur mengandung salmonella (Boumler et al, 2000)
Berdasarkan hasil pengujian, beberapa serotipe Salmonella yang berasal dari spesimen hewan memiliki resistensi terhadap 17 jenis antibiotika. Resistensi terhadap antibiotika ini pada umumnya dikarenakan pengobatan pada manusia dan hewan yang melebihi batas normal (Headrick and Cray 2001). Sekitar 40% antibiotika terkandung di dalam pakan ternak dan digunakan sebagai Antimicrobial Growth Promoters (AGP) untuk pemacu pertumbuhan dan mengurangi kejadian penyakit. Pemakaian antibiotika sebagai AGP walaupun dalam konsentrasi kecil, yaitu berkisar antara 2,5 – 125 mg/kg (ppm), dapat mengakibatkan terjadinya resistensi bakteri patogen terhadap antibiotika (Barton, 2001)
Melihat begitu banyaknya ancaman kesehatan akibat resistensi bakteri S.enteritidis terhadap berbagai antibiotik, maka pengendalian terhadap bakteri ini sangatlah penting. Solusi untuk masalah ini adalah dengan penggunaan tanaman obat. Tanaman obat mempunyai komponen bioaktif yang mudah didegradasi, aman dan mempunyai efek samping yang lebih sedikit (Prusti et al., 2008). Jambu mete (Anacardium occidentale) merupakan salah satu tumbuhan yang telah lama digunakan sebagai obat. Berdasarkan sebuah penelitian disebutkan bahwa kulit biji (pericarp) jambu mete (Annacardium occidentale) mengandung minyak Chasew Nut Shell Liquid (CNSL) yang terdiri dari 70% asam anakardat, 20-25% kardol dan
sisanya adalah kardanol dan metil kardol (Simpen, 2008). Kardol dan kardanol adalah senyawa tanin beracun yang diketahui sebagai golongan polifenol alami. Polifenol memiliki efek antimikroba dengan mekanisme yang tidak spesifik terhadap protein mikroorganisme serta dapat merusak membran sel bakteri dan dapat menyebabkan denaturasi protein bakteri (Venturella, 2000). Penelitian yang dilakukan oleh Parasa et al (2011), menunjukkan bahwa ekstrak kulit biji Jambu mete dengan pelarut aceton dapat membunuh Meticylin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) secara in vitro.
Pengambilan kandungan aktif kulit biji mete dalam penelitian ini dilakukan dengan ekstraksi menggunakan pelarut n-heksana. Penelitian sebelumnya telah diketahui bahwa n-heksana bersifat non polar, sehingga pelarut ini baik digunakan untuk bahan yang tidak larut air seperti minyak yang terkandung dalam ekstrak kulit biji jambu mete. Berdasarkan uraian diatas, besar kemungkinan bahwa ekstrak pericarp Jambu mete dapat digunakan sebagai antimikroba terhadap Salmonella enteritidis. Untuk itu perlu dibuktikan efek ekstrak pericarp jambu mete dengan pelarut n-Heksana sebagai antimikroba terhadap bakteri S.enteritidis secara in vitro, potensi antimikroba akan di uji berdasarkan dengan KHM KBM dan pertumbuhan koloni pada pemberian berbagai konsentrasi ekstrak.
Materi dan Metode Penelitian Alat dan Bahan Penelitian
Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini oven pengering, mesin penggiling, rotary evaporator, tabung erlenmeyer, mikroskop, kertas penghisap, lampu bunsen, gelas objek, tabung reaksi streril, ose, mikropippet 1 ml, inkubator, lampu bunsen, label, vortex, dan spektrofotometer.
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah pelarut n-Heksana, aquades, DMSO dan kulit biji Jambu 1
3 Mete, isolat Salmonella enteritidis, Pewarna gram (kristal violet, lugol, alkohol, dan safranin), minyak emersi, Nutrient Broth (NB), dan Nutrient Agar Plate (NAP).
Ekstraksi Kulit Biji Jambu Mete
Metode ekstraksi yang digunakan adalah maserasi dengan pelarut n-Heksana. Pembuatan ekstrak dilakukan dengan merendam masing-masing simplisia daun kelor dan kulit biji mete selama 72 jam dengan komposisi 100 gram simplisia dalam 1 liter larutan n-Heksana. Kemudian dilakukan evaporasi untuk memisahkan pelarut dengan hasil ekstraksi. Suhu yang dipilih dalam proses evaporasi adalah 69
0
C yang sesuai dengan titik didih pelarut. Uji konfirmasi Salmonella enteritidis
Identifikasi yang dilakukan adalah pewarnaan Gram dan pengujian biokimia. Identifikasi dilakukan terhadap sampel SP-1-PKH untuk memastikan sampel bakteri tersebut adalah murni bakteri Salmonella enteritidis.
Uji Antimikroba Metode Dilusi Tabung Uji antimikroba menggunkan metode dilusi tabung memiliki dua indikator untuk menunjukkan suatu bahan memiliki potensi antimikroba, yaitu KHM dan KBM (Dzen et al, 2003). Suspensi bakteri yang diujikan pada metode dilusi tabung memiliki konsentrasi 106 CFU/ml.
Pembuatan suspensi bakteri pada penelitian ini mengacu pada prosedur Chaouce et. al (2012). Konsentrasi dilusi tabung yang digunakan dalam penelitian ini adalah 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, dan 50% sebagaimana yang ditunjukkan pada penelitian pendahuluan. Pengamatan nilai KHM dilakukan dengan pengamatan secara fisik terhadap tingkat kekeruhan setiap tabung, sedangkan nilai KBM diperoleh dari penghitungan jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada media padat dengan ketentuan ≤ 0,1% OI.
Hasil dan Pembahasan
Kadar Hambat Minimal Ekstrak N-Heksana Kulit Biji Jambu Mete terhadap Salmonella enteritidis
Uji potensi antimikroba ekstrak n-Heksana kulit biji jambu mete terhadap bakteri Salmonella enteritidis menggunakan metode dilusi tabung. Hasil dari metode dilusi tabung adalah penentuan nilai KHM dengan pengamatan terhadap tingkat kekeruhan. Menurut Dzen et al. (2003) penilaian KHM metode dilusi dinilai dengan mengamati tingkat kekeruhan pada setiap tabung setelah diinkubasi selama 18-24 jam yang ditunjukkan oleh warna tabung yang jernih. Tingkat kekeruhan ini merupakan tanda awal dari potensi antimikroba ekstrak n-Heksana kulit biji jambu mete terhadap bakteri Salmonella enteritidis.
Gambar 1. Hasil uji dilusi tabung ekstrak n-Heksana kulit biji jambu mete terhadap Salmonella enteritidis
4 Berdasarkan pengamatan kekeruhan, KHM tidak dapat ditentukan karena warna ekstrak keruh. Seharusnya penentuan KHM untuk ekstrak yang keruh menggunakan metode lain seperti uji difusi
cakram, atau uji dilusi agar, akan tetapi dalam penelitian ini tidak dilakukan uji tersebut karena keterbatasan waktu. Selanjutnya penanaman pada media padat.
Kadar Bunuh Minimal Ekstrak n-Heksana Kulit Biji Jambu Mete terhadap Salmonella enteritidis
Tabel 1 Jumlah koloni S. enteritidis pada beberapa macam konsentrasi ekstrak n-Heksana kulit biji jambu mete
Perlakuan
Jumlah Koloni (CFU/Plate) pada Ulangan
ke-
Rata-rata Standar deviasi
1 2 3 4 25% 1410 1272 1237 1392 1327,75 86,09442491 30% 649 599 707 666 655,25 44,70924587 35% 229 324 343 387 320,75 66,61518846 40% 12 13 13 24 15,5 5,686240703 45% 2 1 3 1 1,75* 0,816496581 50% 0 0 0 0 0 0 OI 1801 1755 1725 1788 1767,25 34,17967232
Ket. : * = KBM (Kadar Bunuh Minimal) dengan jumlah koloni ≤ 1,75 x 103 Kadar bunuh minimal merupakan
konsentrasi terendah yang memungkinkan pertumbuhan koloni hanya < 0,1% dari original inoculum (Baron et al, 1994). 0,1% dari OI dalam penelitian ini adalah 1,75 x 103 CFU/mL maka konsentrasi 25% dengan jumlah rata-rata koloni 1,25 x103 adalah Kadar Bunuh Minimal dalam penelitian ini.
.Selanjutnya data hasil penghitungan rata-rata jumlah koloni dilakukan uji ANOVA untuk mengetahui apakah terdapat perbedaan pengaruh yang bermakna antar konsentrasi yang berbeda. Hasil Uji ANOVA sesuai pada Lampiran 5 menunjukkan nilai signifikansi (P-value) sebesar 0,05 yang artinya tolak H0 atau
berarti minimal terdapat satu pasang perlakuan yang berbeda secara nyata. Hasil Uji ini menunjukkan bahwa perbedaan konsentrasi Ekstrak pericarp Jambu mete terbukti memiliki efek antimikroba terhadap Salmonella enteritidis SP-1-PKH secara in vitro.
Berdasarkan hasil uji lanjutan menggunakan Tukey HSD atau uji Beda
Nyata Jujur (BNJ) dan subset yang terbentuk (Lampiran 5), terlihat bahwa kelompok perlakuan konsentrasi 50%, 45% dan 40%, tidak memiliki perbedaan pengaruh yang nyata. Perlakuan konsentrasi 40%, 35%, 30%, dan 25% masing-masing memiliki perbedaan pengaruh yang nyata terhadap pertumbuhan Salmonella enteritidis SP-1-PKH.
Uji korelasi (Lampiran 5) menunjukkan bahwa konsentrasi ekstrak dan jumlah koloni Salmonella enteritidis berkorelasi negatif (-0.897). Tanda negatif pada hasil uji korelasi menunjukkan hubungan yang terbalik antara konsentrasi ekstrak pericarp Jambu mete dengan jumlah koloni Salmonella enteritidis SP-1-PKH yang artinya semakin tinggi konsentrasi ekstrak pericarp Jambu mete maka semakin rendah jumlah pertumbuhan koloni Salmonella enteritidis SP-1-PKH.
Analisa selanjutnya adalah analisis regresi linier yang hasilnya tertera pada Lampiran 4 dengan persamaan regresi yang didapat yaitu y = 1277 – 254,4x
5 dengan R2 = 0,810 (81%) ini berarti bahwa perlakuan konsentrasi ekstrak pericarp jambu mete mempengaruhi sebesar 81%
penurunan jumlah koloni Salmonella enteritidis SP-1-PKH.
Gambar 2 Grafik Regresi Linier pengaruh ekstrak pericarp Jambu Mete terhadap pertumbuhan Salmonella enteritidis
Berdasarkan regresi linier pada gambar 2, hubungan antara konsentrasi ekstrak pericarp jambu mete dengan Jumlah koloni Salmonella enteritidis dapat dinyatakan dengan rumus Y = 1277 – 254,5X Y adalah jumlah koloni Salmonella enteritidis, sedangkan X adalah konsentrasi ekstrak pericarp Jambu mete dengan pelarut n-Heksana. Hal ini dapat diartikan bahwa berarti tanpa pemberian ekstrak pericarp Jambu mete maka jumlah koloni yang tumbuh akan cenderung meningkat konstan sebesar 1,277 x 103 koloni dan pengaruh setiap 1% pemberian ekstrak pericarp Jambu mete menyebabkan penurunan jumlah koloni Salmonella enteritidis sebesar 2,5 x 103 koloni. Nilai R2 = 0,810 (81%) ini berarti bahwa perlakuan konsentrasi ekstrak pericarp jambu mete mempengaruhi sebesar 81% terhadap penurunan jumlah koloni Salmonella enteritidis SP-1-PKH.
Berbagai penelitian yang berhubungan kulit biji mete telah banyak dilakukan. Kandungan kulit biji mete yang terbesar adalah chasew nut shell liquid (CNSL) atau minyak laka yang didalamnya terkadung asam anakardat, kardol, dan kardanol (Simpen, 2008).
Pemanfaatan CNSL dalam dunia medis yang sudah dilakukan yaitu, untuk menguji kemampuan dalam bidang mikrobiologi dan parasitologi. Penelitian yang dilakukan oleh Parasa et.al. (2011), ekstrak CNSL menggunakan aseton 70% memberikan efek penghambatan pertumbuhan methilen resistance Stapyloccocus aureus (MRSA) yang setara dengan oxacillin 1mg/ml yang dilihat dari diameter hambat 25 mm untuk ekstrak CNSL dan 21 mm untuk oxacillin 1mg/ml. Penelitian yang dilakukan oleh Ademola dan Eloff (2010), ekstrak aseton pada jambu mete menunjukkan efek penghambatan setara dengan albendazole terhadap pertumbuhan haemonchus contortus.
Penelitian yang dilakukan Vijayakumar dan Kalaichelvan (2011), menyebutkan ekstrak daun jambu mete memiliki aktivitas antimikroba terhadap dua bakteri Gram positif dan empat bakteri Gram negatif yaitu, M.luteus, S.aureus, K.pneumonia, E.Coli, P.aeruginosa, dan S.typi. Selain itu, dalam uji toksisitas, penelitian yang dilakukan oleh Tedong et. al. (2007) menunjukan ekstrak heksana dari daun jambu mete memiliki nilai
6 toksisitas terhadap tikus dengan lethal dose (LD50) 16 g/kg.
Komposisi kimia dari CNSL adalah asam anakardat, kardol serta ditemukan adanya kardanol(3-alkilfenol), dan 2-metilkardol (2-metil-5-alkilresorsinol). Asam anakardat merupakan komponen terbesar dalam CNSL, dengan prosentase 70% dan sisanya kardol, kardanol dan dimetilkardol. Menurut penelitian yang lain, asam anakardat yang telah diisolasi dari buah semu jambu mete juga menunjukkan aktifitas sitotoksis melawan sel kanker payudara BT-20 (Budiati et al, 2004).
Sasaran utama kandungan antimikroba dalam esktrak pericarp jambu mete adalah adalah dinding sel. Dinding sel merupakan lapisan lipid-bilayer yang mirip dengan membran sel. Membran sel ini dapat melindungi bakteri Gram negatif dari substansi anti peptidoglikan seperti penisilin yang tidak dipunyai oleh bakteri Gram positif. Ikatan antar asam amino dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif lebih renggang dibandingkan dengan bakteri Gram positif (McKane dan Kandel, 1986), sehingga memudahkan senyawa asam anakardat, kardol, dan kardanol untuk masuk kedalam ikatan. Selain itu, dinding selnya tidak selektif permeabel, sehinga senyawa-senyawa tersebut mudah dalam penetrasi menembus dinding sel yang akan menimbulkan terganngunya integritas dinding sel bakteri.
Gugus OH pada CNSL dinilai memiliki peran aktif dalam fungsinya sebagai bahan antibakteri. Kardol memiliki dua gugus OH fenolik sedangkan asam anakardat memiliki satu gugus OH dan satu gugus COOH pada cincin aromatisnya, hal inilah yang memungkinkan kardol lebih bersifat sebagai zat antibakteri daripada asam anakardat. Berdasarkan beberapa sumber yang telah disebutkan diatas, besar kermungkinan zat aktif kardol dapat menjadi penyebab utama terjadinya penurunan pertumbuhan bakteri secara signifikan seiring dengan bertambahnya
konsentrasi ekstrak pericarp Jambu mete. Meningkatnya konsentrasi ekstrak menjadikan konsentrasi kardol semakin tinggi sehingga gugus OH yang bersifat sebagai zat antibakteri akan bereaksi dengan bakteri Salmonella enteritidis, sehingga semakin banyak bakteri yang mengalami kematian (Kresnamurti dan Budiati, 2008).
Kesimpulan
Ekstrak pericarp Jambu mete dengan pelarut n-Heksana memiliki potensi antimikroba terhadap isolat Salmonella enteritidis SP-1-PKH secara in vitro. Kadar Hambat Minimum (KHM) dalam penelitian ini belum dapat ditentukan, sedangkan Kadar Bunuh Minimal (KBM) ekstrak pericarp Jambu mete terhadap Salmonella enteritidis adalahI konsentrasi ekstrak 45%.
Ucapan Terima Kasih
Peneliti mengucapkan terimakasih kepada Dr. Sri Murwani, drh, MP sebagai ketua payung penelitian atas bimbingan, fasilitas laboratorium mikrobiologi PKHUB dan terimakasih kepada drh. Dahaliatu Qosimah M.Kes sebagai dosen pendamping penelitian.
Daftar Pustaka
Ademola, IO., & Eloff, JN. 2011. Anthelmintic efficacy of cashew (Anarcadium occidentale L.) on in vitro susceptibility of the ova and larvae of Haemonchus contortus. African Journal of Biotechnology Vol. 10(47) : 9700-9705
Baron, S., J. Elenn, Balley, and Scott. 1994. Diagnostic Microbiology, 9th Edition. Newyork: Mosby-year
7 Barton, M.D., and W.S. Hart. 2001.
Public Health Risk: Antibiotic resistance. Asian-Aust. J. Anim. Sci. 14 : 414 – 422
Boumler, A.J., B.M. Hargis, & R.M. Tsolis, 2000, Trancing Origin of Salmonella Outbreaks, Science, 278 (5450) ; 50-52
Budiati, T., N.C. Zaini., dan S.Soedigdo. 2004. Sintesis Metil Anakardat dan Uji Aktivitasnya sebagai Inhibitor Enzim Sulfhidril. JBP 6: 47-51 Chaouce, T., F. Atik Bekkara, F.
Haddouchi, and Z. Boucherit. 2012. Antibacterial activity of different ekstract of
Echiumpycnanthum pomel.USA: JCPRC5 4(1):216-220
Dzen, S.M., Roekistiningsih, S. Santoso & S. Winarsih. 2003. Bakteriologi Medik. Malang: Bayumedia Publising
Headrick M, Cray P. 2001. Antimicrobial Susceptibility Patterns for Salmonella Isolates of Animal Origin. J of Infect Dis (170)128-134.
Kresnamurti, A., T. Budiati & G.V. Candra. 2008. Perbandingan Uji Sitotoksik Asam Anakardat Dan Asam Anakardat jenuh Dengan metode Brine Shrimp Lethality Test. Jurnal Obat Bahan Alam 7: 98-107
McKane, L & J. Kandel. 1986. Microbiology: Essentials And Applications. Singapore: McGraw-Hill. p. 61-88.
Prusti, A., S.R. Mishra, S. Sahoo and S.K. Mishra. 2008. Antibacterial Activity in Some Indian Medical
Plants. Ethobotanical Leaflet. 12: 227-230
Parasa, L.S., T. Sunita., K. Babu Rao., A. Hanumantha Rao., J. Srinivasa Rao., and L. C. A. Kumar. 2011. Acetone Extract Of Cashew (Anacardium occidentale, L.) Nuts Shell Liquid Against Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus (MRSA) by Minimum Inhibitory Concentration (MIC). Journal of Chemical and Pharmaceutical Research 3(5): 736-742
Simpen, I.N. 2009. Isolasi Cashew Nut Shell Liquid Dari Kulit Biji Jambu Mete (Anacardium Occidentale L) Dan Kajian Beberapa Sifat Fisiko-Kimianya. Jurnal Kimia 2 (2): 71-76
Tedong, D.T., P.A. Davefiet., A.E. Asongalem., S.D. Sokeng., P. Collard., J. Flejou., Kamtchouing P. 2007. Antihypoglycemic and renal protective activities of A. occidentale leaves in Streptozotocin induced diabetic rats. African Journal of Traditional, Contemporary and Alternative Medicines., 3(1) : 23-35
Venturella, V.S. Natural Product in: H. Gardner. 2000. Remington the Science and Practice of Pharmachy 20th Edition. Lippincott Williams & Wilkins. Philadelphia hal 675-683
Vijayakumar, A. & K.P. Thangavel. 2011. Antioxidant and antimicrobial activity using different extracts of anacardium occidentale l. IJBPT. ISSN 0976-4550
