40
Lampiran 1 Metode total plate count
Media agar 0,05 ml 0,1 ml Biakan bakteri 1:10 @ 0,9 ml PBS 0,1 ml 0,1 ml 1:10000 1:1000 1:100
Setiap pengenceran bakteri disebar dalam media (duplo)
Inkubasi selama 18 jam dan dihitung jumlah koloni yang tumbuh (30-300 koloni)
41 Lampiran 2 Pembuatan media bakteri
Seawater Complete (SWC)
Media SWC merupakan media umum untuk menumbuhkan bakteri air laut. Komposisi bahan untuk membuat media SWC cair yaitu bacto peptone 5 g, yeast extract 1 g, glycerol 3 ml, air laut 750 ml dan akuades 250 ml. Media SWC agar dibuat dengan komposisi yang sama ditambah bacto agar sebanyak 15-20 g. Media SWC dibuat dengan mencampurkan bahan-bahan tersebut, selanjutnya dipanaskan di atas hot plate sampai homogen (hampir mendidih) sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer. Media SWC disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama 15-20 menit. Setelah hangat kuku, media SWC agar dituangkan ke dalam cawan petri (± 15 ml) secara aseptik dan dibiarkan sampai membeku.
Thiosulfate Citrate Bilesalt Sucrose (TCBS) Agar
Media TCBS merupakan media selektif untuk menumbuhkan bakteri Vibrio. Media TCBS agar dibuat dengan melarutkan bubuk media TCBS sebayak 98 g ke dalam 1.000 ml akuades yang telah disterilkan. Larutan tersebut selanjutnya dipanaskan di atas hot plate sampai homogen (hampir mendidih) sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer. Setelah hangat kuku, media TCBS dituangkan ke dalam cawan petri (± 15 ml) secara aseptik dan dibiarkan sampai membeku.
Phosfat Buffer Saline (PBS)
Media PBS dibuat dengan mencampurkan NaCl 0,8 g; KH2PO4 0,2 g; NaHPO4.2H2O 1,5 g; KCl 0,2 g dan akuades 1.000 ml. Media dipanaskan di atas
hot plate sampai larut sempurna sambil diaduk menggunakan magnetic stirrer. Media SWC disterilkan dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121oC dan tekanan 1 atm selama 15-20 menit.
42
Lampiran 3 Sistem resirkulasi pada wadah perlakuan
b a 2 1 3 4 5 10 9 8 1 1 7 6 Keterangan gambar : a. Akuarium perlakuan
b. Sistem resirkulasi air (satu perlakuan dengan tiga ulangan) 1. Shelter
2. Anco
3. Pipa saluran air hasil treatment 4. Ember filter (pasir + karang + busa) 5. Pompa air
6. Bioball
7. Wadah treatment air 8. Talang saluran air kotor 9. Outlet air
10. Akuarium 11. Inlet air 11
43 Lampiran 4 Ekstraksi IMNV dari tubuh udang yang terinfeksi
Udang yang positif terinfeksi IMNV dibersihkan dan diambil bagian dagingnya. Daging udang dicacah sampai halus kemudian ditambahkan larutan PBS dengan perbandingan 1:10 w/v dan disentrifuse dengan kecepatan 6.500 rpm pada suhu 4 oC selama 20 menit. Supernatan diambil dan disentrifuse kembali dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4 oC selama 20 menit. Selanjutnya supernatan disaring dengan filter mess size 0,45 µm. Ekstrak virus hasil filtrasi kemudian disimpan pada suhu -70 oC sampai dengan digunakan.
Lampiran 5 Tahapan dan waktu kegiatan penelitian pada uji in vivo
Uji resistensi udang vaname terhadap IMNV
Uji performa pertumbuhan.
Kegiatan Hari ke
-15 0 5 10 15 20 25 30 35 40
Persiapan dan adaptasi udang Pemberian sinbiotik
Injeksi IMNV Pengamatan sintasan Pengamatan gejala klinis Pengukuran parameter imunitas
Kegiatan Hari ke
-15 0 5 10 15 20 25 30 Persiapan dan adaptasi udang
Pemberian sinbiotik Penimbangan bobot udang
Pengukuran jumlah konsumsi pakan Analisis proksimat
44
Lampiran 6 Perhitungan total hemosit dengan menggunakan hemasitometer
Contoh perhitungan:
Jumlah sel hemosit terhitung = 100 sel (dalam 25 kotak besar)
Volume hemasitometer = 1 x 1 x 0,1 mm3 = 1 x 10-4 ml
Pengenceran hemolimph = 5 kali
Total hemosit = jumlah sel terhitung x (volume hemasitometer)-1 x pengenceran = 100 x (1 x 10-4)-1 x 5
= 5 x 106 sel ml-1
Lampiran 7 Prosedur analisis proksimat
Analisis kadar air
Cawan dipanaskan di dalam oven pada suhu 110 oC selama 1 jam kemudian dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit sebelum ditimbang (X1). Sampel ditimbang sebanyak 2-3 g (A) kemudian dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan di dalam oven pada suhu 110 oC selama 4 jam. Cawan didinginkan dalam desikator selama 30 menit sebelum ditimbang kembali (X2). Kadar air dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑖𝑟 =(𝑋1+ 𝐴) − 𝑋2
𝐴 × 100%
1mm mm
Perhitungan sel hemosit pada 25 kotak besar
45 Analisis kadar abu
Cawan dipanaskan di dalam oven pada suhu 110 oC selama 1 jam kemudian dimasukkan ke dalam desikator selama 30 menit sebelum ditimbang (X1). Sampel ditimbang sebanyak 2-3 g (A) kemudian dimasukkan ke dalam cawan dan dipanaskan di dalam tanur pada suhu 600 oC sampai bahan menjadi abu. Setelah suhu cawan turun sampai suhu 100-200oC, cawan didinginkan dalam desikator selama 30 menit sebelum ditimbang kembali (X2). Kadar abu dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑏𝑢 =(𝑋2− 𝑋1)
𝐴 × 100%
Analisis kadar protein (metode Kjehdall)
Pada tahap oksidasi, sampel sebanyak 0,5 g dimasukkan ke dalam labu Kjehdall, kemudian ditambahkan 3 g katalis K2SO4+CuSO4.5H2O (9:1) dan 10 ml H2SO4 pekat. Labu dipanaskan pada suhu 400oC (±1 jam) sampai larutan dalam labu berwarna hijau bening. Selanjutnya larutan didinginkan selama ±30 menit dan ditambahkan 25 air destilasi. Setelah itu larutan dimasukkan ke dalam labu takar dan diencerkan dengan akuades sampai volume larutan tersebut mencapai 100 ml (A).
Pada tahap destilasi, H2SO4 0,05 N sebanyak 10 ml dituang ke dalam erlenmeyer dan ditambahkan 2 tetes indikator methylred (B). Selanjutnya, 10 ml NaOH 30% ditambahkan pada larutan A sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam labu Kjehdall. Kemudian dilakukan destruksi selama 10 menit mulai saat tetesan pertama pada larutan B.
Pada tahap titrasi, hasil destruksi dititrasi dengan NaOH 0,05 N. Blanko dibuat dengan melakukan prosedur yang sama tanpa penambahan sampel. Kadar protein dihitung menggunakan rumus berikut:
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 =0,0007
∗× (𝑉
𝑏− 𝑉𝑠) × 6,25∗∗× 20
𝐴 × 100%
Ket: Vb = Volume titran NaOH 0,05 N untuk blanko (ml) Vs = Volume titran NaOH 0,05 N untuk sampel (ml) A = Bobot sampel (g)
* = Setiap ml titran NaOH (0,05 N) ekivalen dengan 0,0007 g N ** = Faktor nitrogen
Analisis lipid (metode Folch)
Sampel sebanyak 2 g (A) ditambahkan 40 ml larutan kloroform:metanol (2:1). Senjutnya, dihomogenkan selama 5 menit dengan sentrifuse pada 5.000 rpm dan disaring menggunakan vacuum pump. Hasil penyaringan dipindahkan ke dalam labu pemisah yang sebelumnya telah diisi dengan larutan MgCl2.6H2O sebanyak
46
0,2 kali volume larutan kloroform-metanol yang digunakan. Selanjutnya, larutan kembali disaring dan dibilas dengan menggunakan 10 ml larutan kloroform-metanol. Setelah disaring larutan di dalam labu pemisah ditutup dan diaduk hingga merata selama 1 menit dan didiamkan selama 1 malam hingga terpisah menjadi 2 lapisan. Lapisan bagian bawah diambil dan ditampung dengan labu lain yang telah diketahui bobotnya (C). Selanjutnya larutan dalam labu tersebut diuapkan dengan menggunakan rotary evaporator hingga larutan dalam labu menguap semua, kemudian labu tersebut ditimbang kembali (B). Kadar lemak dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑙𝑖𝑝𝑖𝑑 = (𝐶 − 𝐵)
𝐴 × 100%
Analisis serat kasar
Kertas saring dipanaskan dalam oven selama 1 jam pada suhu 110 oC, setelah itu didinginkan dalam deksikator sebelum ditimbang (X1). Sampel A sebanyak 0,5 g ditambahkan 50 ml H2SO4 0,3 N dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer 250 ml untuk dipanaskan selama 30 menit. Selanjutnya, 25 ml NaOH 1,5 N ditambahkan dan dipanaskan kembali selama 30 menit. Larutan dan bahan yang telah dipanaskan kemudian disaring dalam corong Buchner yang dihubungkan dengan vacuum pump untuk mempercepat proses penyaringan. Larutan dan bahan yang tertinggal dalam corong dibilas secara berturut-turut menggunakan 50 ml air panas; 50 ml H2SO4 0,3 N; 50 ml air panas dan 25 ml aseton. Kertas saring dan isinya dimasukkan ke dalam cawan porselin lalu dikeringkan selama 1 jam dan kemudian didinginkan dalam deksikator sebelum ditimbang (X2). Selanjutnya kertas saring dan isinya tersebut dipanaskan dalam tanur pada suhu 600oC hingga berwarna putih, kemudian didinginkan dalam deksikator dan ditimbang (X3). Kadar serat kasar dihitung dengan menggunakan rumus berikut:
𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑠𝑒𝑟𝑎𝑡 𝑘𝑎𝑠𝑎𝑟 =(𝑋2− 𝑋1− 𝑋3)
47 Lampiran 8 Prosedur analisis enzim
Aktivitas enzim amylase (Bergmeyer dan Grassi 1983)
Perlakuan Blanko (ml) Standar (ml) Sampel (ml) Buffer borat (0,01 M; pH 8,0) 1,0 1,0 1,0
Substrat kasein (20 mmol;, pH 8,0) 1,0 1,0 1,0
Enzim dalam CaCl2 (2 mM) - - 0,2
Tirosin standar - 0,2 -
Aaquades 0,2 - -
Inkubasi pada 37 oC tepat, 10 menit
TCA (0,1 M) 2,0 2,0 2,0
CaCl2 (2 mM) - - 0,2
Enzim dalam CaCl2 (2 mM) 0,2 0,2 -
Inkubasi pada 37 oC tepat, 10 menit
Sentrifusi 4.000 rpm selama 10 menit
Filtrat 1,5 1,5 1,5
Na2CO3 (0,4 M) 5,0 5,0 5,0
Pereaksi folin (1:2) 1,0 1,0 1,0
Diamkan selama 20 menit pada 7 oC
Ukur absorbansi pada 578 nm
Aktivitas enzim amylase (Bernfeld 1955)
Perlakuan Blanko (ml) Standar (ml) Sampel (ml) Enzim 0,1 - 0,1 Larutan pati 0,1 0,1 0,1 Inkubasi 20 oC, 3 menit Pereaksi DNS 2,0 2,0 2,0
Ditempatkan dalam air mendidih selama 5 menit
48
Lampiran 9 Hasil analisis proksimat udang vaname dan pakan perlakuan
Komposisi biokimia tubuh udang vaname (n=5) sebelum (awal) dan setelah pemberian empat jenis pakan perlakuan selama 30 hari
Parameter analisis
Komposisi tubuh udang perlakuan*
Awal Kontrol Pro+Pre 1% Pro+Pre 2% Pro+Pre 3%
Kadar abu 14,38 13,27 13,55 12,18 11,67
Protein 56,32 61,78 58,19 62,34 64,13
Lemak 6,97 5,62 5,31 5,89 6,92
Serat kasar 6,61 4,94 3,93 3,41 4,22
BETN 15,71 14,39 19,02 16,19 13,06
*dalam persen bobot kering
Komposisi pakan udang perlakuan Parameter
analisis
Komposisi pakan perlakuan*
Kontrol Pro+Pre 1% Pro+Pre 2% Pro+Pre 3%
Kadar abu 10,73 10,82 10,76 10,74
Protein 39,42 39,03 37,89 38,78
Lemak 15,35 14,97 14,41 14,34
Serat kasar 3,23 3,31 2,61 2,43
BETN 31,34 30,74 31,49 30,82
*dalam persen bobot kering
Lampiran 10 Hasil analisis oligosakarida pada ekstrak ubi jalar dan pakan udang dengan HPLC
Ekstrak ubi jalar (50%)* Name Migration
Time
Area Height PPM Percentage
Maltoheptaosa 3.925 48.759 4.776 19.311 1,93 Raffinosa 4.246 94.006 7.907 40.723 4,07 Sukrosa 4.635 668.159 57.490 264.331 26,43 5.464 32.775 2.952 5.991 7.971 701 *Pengenceran 100 kali
49
Pakan komersil*
Name Migration Time
Area Height PPM Percentage
Maltoheptaosa 3.953 3.879.672 339.306 30.730 3,07 Sukrosa 4.646 1.155.931 120.275 9.146 0,90 5.121 156.865 14.816 5.420 187.711 19.338 6.117 99.637 6.033 *Pengenceran 2 kali
50
Lampiran 11 Hasil perhitungan pertumbuhan bakteri SKT-b
Jam ke Konsentrasi bakteri SKT-b
Cfu ml-1 Log cfu ml-1
0 4,80 x 105 5,68 2 3,70 x 106 6,57 4 6,92 x 106 6,84 6 8,90 x 108 8,95 8 1,77 x 109 9,25 10 4,90 x 109 9,69 12 8,03 x 109 9,90 14 1,12 x 1010 10,05 16 5,90 x 1010 10,77 18 2,80 x 1010 10,45 20 1,77 x 1010 10,25 22 3,13 x 108 8,50
Lampiran 12 Hasil pengamatan tingkat infeksi IMNV pada udang vaname
Perlakuan Ulangan Tingkat infeksi (ekor)
Ringan Sedang Berat Sangat berat Mati Kontrol (-) 1 13 1 0 0 1 2 10 4 0 0 1 3 7 7 0 0 1 Kontrol (+) 1 0 1 0 1 13 2 0 0 2 1 12 3 0 1 1 1 12 Pro+Pre 1% 1 1 1 1 1 11 2 0 3 1 0 11 3 0 1 3 0 11 Pro+Pre 2% 1 0 0 0 7 8 2 1 2 1 2 9 3 0 4 2 0 9 Pro+Pre 3% 1 1 6 0 2 6 2 1 1 1 3 9 3 2 2 0 4 7
51 Lampiran 13 Hasil pengukuran kualitas air pemeliharaan udang selama perlakuan
Parameter Waktu pengukuran Perlakuan Kontrol (-) Kontrol (+) Pro+Pre 1% Pro+Pre 2% Pro+Pre 3% Suhu (oC) Awal 29,0 28,5 29,0 28,5 28,5 Pertengahan 29,0 29,0 29,0 28,0 29,0 Akhir 28,5 28,0 29,0 28,0 29,0 Salinitas (o/oo) Awal 31,0 32,0 32,0 31,0 32,0 Pertengahan 32,0 35,0 35,0 34,0 35,0 Akhir 35,0 35,0 35,0 32,0 35,0 Oksigen terlarut (mg/l) Awal 6,6 7,5 7,9 7,2 7,5 Pertengahan 6,5 6,4 6,1 6,4 6,1 Akhir 3,9 3,5 3,9 4,0 3,5 Amonia (mg/l) Awal < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Pertengahan < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 Akhir < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 pH Awal 8,0 7,9 7,8 7,9 7,8 Pertengahan 7,5 7,5 7,4 7,5 7,4 Akhir 7,0 7,0 7,0 7,0 7,0
52
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Ciamis pada tanggal 24 Februari 1984 sebagai anak ke dua dari lima bersaudara oleh pasangan Suwarno Prajadinata dan Euis Irayani. Penulis menikah dengan Firnas Nadirman dan telah dikarunia dua orang anak, Reina Almira Firnas dan Najib Aqil Firnas.
Penulis menyelesaikan pendidikan sekolah menengah atas di SMA Negeri 2 Ciamis tahun 2001. Pada Tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) dan memilih Program Studi Teknologi dan Manajemen Akuakultur, Departemen Budidaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Pendidikan sarjana penulis selasaikan tahun 2006. Pada tahun 2010, penulis mendapatkan kesempatan untuk menempuh pendidikan magister ke Sekolah Pascasarjana IPB, program studi Ilmu Akuakultur. Bantuan dana untuk pendidikan magister diperoleh dari Program Diploma IPB.
Setelah lulus pendidikan sarjana, di tahun yang sama, penulis diterima sebagai staf Research and Development di Tambak Pinang Gading. Mulai tahun 2007 sampai sekarang, penulis bekerja sebagai staf pengajar di Program Diploma IPB, pada Program Keahlian Teknologi Produksi dan Manajemen Perikanan Budidaya. Bidang ilmu yang diampu meliputi mikrobiologi, penyakit dan kesehatan ikan serta lingkungan akuatik. Penulis juga terlibat dalam kegiatan konseling (sebagai konselor) untuk mahasiswa Program Diploma.
