BUKU PETUNJUK PRAKTIKUM
MIKROBIOLOGI UMUM
Disusun oleh : Ella Saparianti, STP. MP.
Dian Widya Ningtyas, STP. MP.
Mochamad Nurcholis, STP.MP.
Irma Sarita R, STP., MP., M.Sc.
Feronika Heppy S., STP., MP.
JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
2014
LEMBAR PENGESAHAN
1. Judul Modul Praktikum : Mikrobiologi Umum 2. Tim Penyusun Modul :
No Nama
1 Dian Widyaningtyas, STP, MP 2 Feronika Heppy S., STP., MP 3 Fenty Nurtyastuti E.P, STP 4 Ajeng Astrini Brahmanti, STP
3. Tim Reviewer Modul :
No Nama
1 Agustin Krisna Wardani, S.TP, M.Si, Ph.D 2 Dr. Ir. Aji Sutrisno M.Sc
3 Dr. Ir. Joni Kusnadi, M.Si 4 Dr. Ir. Elok Zubaidah, MP
Malang, 18 Februari 2014
Menyetujui,
Ketua Program Studi Koordinator Penyusun Modul
Jurusan Teknologi Hasil Pertanian
(Dr. Widya Dwi Rukmi P., S.TP, MP) (Dian Widya Ningtyas, STP, MP) NIP. 19700504 199903 2 002 NIP. 19810713 200501 2 002
Mengetahui,
Ketua Jurusan Teknologi Hasil Pertanian
(Agustin Krisna Wardani, S.TP, M.Si, Ph.D) NIP. 19690807 199702 2 001
DAFTAR ISI
LEMBAR PENGESAHAN ... i
DAFTAR ISI ... ii
DAFTAR TABEL ... iii
DAFTAR GAMBAR ... iv
Tata Tertib Praktikum Mikrobiologi Umum ... v Materi Praktikum Mikrobiologi Umum ...
Bab 1. Metode Aseptis dan Sterilisasi ...
Bab 2. Teknik Isolasi, Kultivasi dan Preservasi Kultur ...
Bab 3. Teknik Enumerasi Mikroba ...
Bab 4. Identifikasi dan Karakterisasi Mikroba ...
Bab 5. Pengaruh Suhu terhadap Pertumbuhan Mikroba ...
DAFTAR TABEL
Tabel 1. Hasil pengamatan pada metode MPN ... 37
DAFTAR GAMBAR
Gambar 1. Autoclave listrik ... 13
Gambar 2. Prosedur pengenceran sampel atau kultur mikroba ... 22
Gambar 3. Teknik Isolasi Mikroba Dengan Metode Sebar (Spread plate) dan Metode Tuang (Pour plate) ... 23
Gambar 4. Bagan Teknik Transfer kultur (Sub Culture) ... 25
Gambar 5. Cara transfer kultur dari tabung reaksi ke tabung reaksi secara aseptis ... 27
Gambar 6. Cara transfer kultur dari tabung reaksi ke cawan petri secara aseptis ... 28
Gambar 7. Langkah-langkah dalam metode cawan gores ... 29
Gambar 8. Karakteristik Pertumbuhan Koloni Mikroorganisme Pada Media Agar Cawan ... 30
Gambar 9. Karakteristik Pertumbuhan Koloni Pada Media Agar Miring dan Media Agar Tegak ... 30
Gambar 10. Teknik Preservasi dengan Metode Gores pada Agar Miring dan Agar Tegak ... 31
Gambar 12. Skema Uji Koliform ... 39
Gambar 13. Contoh cara melakukan Metode MPN menggunakan Tabung durham ... 40
Gambar 14. Tabel Nilai MPN tiga seri tabung ... 41
Gambar 15. Haemocytometer ... 50
Gambar 16. Mikroskop dan bagian-bagiannya ... 55
Gambar 17. Pengecatan Gram ... 59
Gambar 18. Skema Pengukuran dengan spektrofotometer ... 63
Gambar 19. Hubungan antara absorbansi dan kadar sel, ditunjukkan garis linier terjadi pada pembacaan absorbansi kurang dari 0,4 ... 65
TATA TERTIB PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM
1) Selama praktikum wajib memakai jas lab untuk menghindari kemungkinan terjadinya kontaminasi, infeksi dan sebagainya.
2) Selama praktikum wajib memakai sepatu dan dilarang memakai kaos oblong.
3) Selama praktikum dilarang makan, minum, atau merokok di dalam laboratorium.
4) Dilarang makan/minum dengan menggunakan alat laboratorium, kecuali hal tersebut berkaitan dengan acara praktikum, pengujian organoleptik dan sebagainya.
5) Alat-alat yang akan digunakan dalam praktikum harus dalam keadaan bersih .
6) Praktikan harus mengetahui cara pemakaian peralatan laboratorium sebelum menggunakannya, bila perlu menanyakan ke petugas.
7) Sebelum praktikum dimulai, meja kerja harus dibersihkan dengan disinfektan (detol) atau alkohol 70% atau 200 ppm klorin.
8) Selama praktikum, meja atau peralatan yang terkena kultur mikrobia harus dibersihkan dengan disinfektan (detol) atau alkohol 70% dan dilap dengan lap disposable
9) Selama bekerja di laboratorium sebaiknya dihindari untuk mengusap (menyentuh) mulut, telinga, hidung, mata ataupun muka.
10) Dilarang menggunakan pipet dengan mulut untuk menghindari kemungkinan masuknya bahan yang berbahaya (bahan kimia atau mikrobia) ke dalam tubuh.
11) Dilarang membuang biakan yang masih hidup atau media ke dalam bak pencuci atau sembarang tempat pembuangan, tetapi dibuang di tempat khusus yang telah disediakan.
12) Biakan mikrobia yang tidak terpakai lagi, harus dibuang/diletakkan di tempat khusus yang telah disediakan atau disterilkan dengan otoklaf kemudian segera dicuci.
13) Apabila terjadi kecelakaan (tertusuk, terluka, mata kemasukan sesuatu) segera lapor ke petugas.
14) Setelah praktikum selesai, semua alat-alat harus dibersihkan dan dikembalikan sesuai dengan ketentuan yang ditetapkan.
15) Setelah praktikum selesai, meja harus dibersihkan dengan desinfektan.
16) Sebelum meninggalkan laboratorium, praktikan dianjurkan untuk mencuci tangan dengan bersih.
17) Secara umum dianjurkan bahwa tata tertib yang ditentukan di atas menjadi kebiasaan praktikan terutama sewaktu bekerja dengan mikrobia.
PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI UMUM
A. DESKRIPSI
Mata kuliah ini mencakup prinsip analisis dasar mikrobiologi seperti metode aseptis dan sterilisasi, teknik isolasi, kultivasi, dan preservasi kultur mikroba, teknik enumerasi mikroba, teknik identifikasi mikroba, dan faktor pertumbuhan mikroba. Praktikum ini juga mencakup prinsip penggunaan alat instrumen diantaranya mikroskop dan spektrofotometer.
B. TUJUAN INSTRUKSIONAL UMUM
Setelah menyelesaikan praktikum Mikrobiologi Umum, mahasiswa mampu mengetahui dan melakukan masing-masing prinsip dasar dan teknik dasar analisis mikrobiologi yang meliputi metode aseptis dan sterilisasi, teknik isolasi, kultivasi, dan preservasi kultur mikroba, teknik enumerasi mikroba, teknik identifikasi mikroba, serta kurva pertumbuhan mikroba.
C. MATERI PRAKTIKUM 1. Metode aseptis dan sterilisasi
2. Teknik isolasi, kultivasi, dan preservasi kultur mikroba 3. Teknik enumerasi mikroba
4. Identifikasi dan karakterisasi mikroba 5. Kurva pertumbuhan mikroba
D. PENILAIAN HASIL BELAJAR 1. Pre-lab
2. Aktivitas Praktikum 3. Laporan
4. Pre Test / Post Test
BAB 1
METODE ASEPTIS DAN STERILISASI
1.1 METODE ASEPTIS LANDASAN TEORI
Kultur disebut murni apabila kultur ini hanya terdiri dari satu spesies mikroba saja (Cappuccino dan Sherman, 1983). Pekerjaan di laboratorium mikrobiologi pada umumnya melibatkan berbagai kultur murni. Jika spesies mikroba yang lain masuk secara tidak sengaja ke dalam kultur murni, kultur tersebut dikatakan telah terkontaminasi, dan tidak lagi dikatakan sebagai kultur murni tetapi kultur campuran. Kemungkinan terjadinya kontaminasi ini merupakan hal yang harus diperhatikan karena kontaminan ini akan mempengaruhi hasil pengujian yang sedang dilakukan, atau akan terjadi kesalahan hasil.
Oleh karena itu, untuk mempertahankan kultur tetap murni, medium pertumbuhan yang digunakan harus steril dan kontaminasi harus dicegah.
Pada saat telah diperoleh kultur yang murni, maka hal-hal yang harus diperhatikan (Sumbali dan Mehrotra, 2009) :
1. Seluruh material yang akan berhubungan langsung dengan mikroba harus steril.
2. Seluruh media yang digunakan untuk menumbuhkan sel juga harus steril.
Metode yang digunakan untuk memelihara kultur murni atau bekerja dengan kultur murni disebut metode aseptis (Gunasekaran, 2005). Prosedur umum yang harus diikuti setiap bekerja dengan kultur murni adalah:
1. Medium pertumbuhan dan tempatnya harus steril
2. Tempat pertumbuhan harus selalu ditutup untuk mencegah masuknya debu yang membawa mikroba dan aerosol. Apabila penutup harus dibuka, harus dalam waktu yang sesingkat mungkin, dilarang meletakkan penutup pada sembarang tempat.
3. Peralatan (ose dan pipet) dan larutan yang digunakan untuk pekerjaan harus steril.
Apabila tidak steril, ose atau pipet ini akan mentransfer kontaminan pada kultur murni.
4. Ose yang telah selesai digunakan harus disterilkan dan pipet yang telah digunakan untuk memindahkan kultur harus ditempatkan pada larutan disinfektan sesegera mungkin.
5. Area tempat bekerja juga harus dijaga agar tidak terkontaminasi dengan kultur yang digunakan.
Sebelum memulai acara-acara praktikum mikrobiologi terlebih dahulu harus diketahui cara memindahkan sel secara aseptis. Beberapa hal yang perlu diperhatikan adalah:
1. Jangan digunakan ose yang belum steril untuk menyentuh kultur. Hal ini bertujuan untuk mencegah terjadinya kontaminasi.
2. Mulut tabung harus dipanasi baik pada saat ose dimasukkan atau saat dikeluarkan dari tabung. Pemanasan pertama ditujukan untuk mencegah masuknya udara luar yang membawa partikel debu masuk ke dalam tabung, sedang pemanasan kedua ditujukan untuk membakar sel-sel yang jatuh atau menempel pada mulut tabung saat ose dimasukkan atau ditarik.
3. Diusahakan tabung dalam kondisi terbuka dalam waktu yang sesingkat-singkatnya.
4. Dihindari menempatkan tutup tabung pada permukaan area pekerjaan atau menyentuhnya. Diusahakan agar tutup tabung tidak bersinggungan dengan sumber kontaminan.
5. Ose yang telah digunakan harus disterilkan untuk mencegah kontaminasi.
1.2 STERILISASI LANDASAN TEORI
Sterilisasi merupakan proses destruksi atau penghilangan mikroba yang hidup.
Obyek yeng terbebas dari kehidupan mikroba disebut steril. Sterilisasi merupakan salah satu cara untuk mengontrol mikroba, sedang cara yang lain adalah dengan menghambat pertumbuhan mikroba. Namun sterilisasi berbeda dengan cara yang kedua, dalam hal, bahwa pada sterilisasi seluruh mikroba yang ada dimatikan atau dihilangkan dan obyek menjadi steril (Cappuccino dan Sherman, 1983).
Sterilisasi adalah hal yang penting dalam melakukan aktivitas laboratorium terutama yang melibatkan mikroba. Karena pada umumnya percobaan dilakukan menggunakan kultur murni. Bekerja dengan kultur murni memerlukan beberapa persyaratan, yaitu media nutrien serta tempat untuk pertumbuhan harus steril, demikian pula segala peralatan yang terkait. Seandainya sterilisasi tidak dikerjakan, mikroba kontaminan akan tumbuh dan hasil yang seharusnya diperoleh dari percobaan menggunakan kultur murni akan menyimpang.
Metode yang umum digunakan untuk mengontrol pertumbuhan mikroorganisme yang tidak diinginkan adalah dengan melibatkan agen kimia dan fisika. Kedua agen tersebut dapat mempengaruhi struktur dan fungsi mikroba. Bagian sel dari mikroba yang dapat rusak dan mengakibatkan malfungsi diantaranya adalah dinding sel, membrane sel, sitoplasma, enzim, dan asam nukleat. Kondisi dimana mikroba dapat mati secara
langsung akibat perlakuan tersebut disebut efek mikrobisidal. Sedangkan efek mikrobisatik adalah kondisi dimana kapasitas reproduktif sel dihambat dan jumlah populasi mikroba diijaga konstan (Cappuccino dan Sherman, 1983).
Metode sterilisasi dipilih berdasarkan bahan atau material yang akan digunakan, jenis mikroba yang terlibat, dan tujuan dari sterilisasi itu sendiri (Gunasekaran, 2005).
Berikut adalah beberapa jenis metode sterilisasi yang biasa digunakan untuk mengontrol pertumbuhan mikroba yang tidak diinginkan:
Sterilisasi dengan panas
a. Api langsung (direct flame). Cara yang paling sederhana untuk sterilisasi panas adalah dengan api langsung, yaitu dengan membakar obyek yang akan disterilkan pada nyala api. Cara ini dapat mencegah adanya kontaminasi mikroba dari udara pada saat pemindahan kultur karena panas dan gas yang ditimbulkan oleh api Bunsen dapat membunuh mikroba pada permukaan alat sehingga tidak bisa masuk ke dalam alat dan mencegah kontaminasi. Nyala api dengan suhu tinggi ini akan membunuh seluruh mikroba yang ada pada obyek. Metode api langsung ini biasanya digunakan untuk sterilisasi ose, forceps, mulut tabung reaksi saat memindahkan kultur secara aseptis (Wheelis, 2008). Metode api langsung biasanya dikombinasikan dengan penggunaan cairan alkohol 70% sebagai larutan pembilas.
b. Panas kering (oven udara kering). Panas kering ini biasanya digunakan untuk sterilisasi pipet, tabung reaksi, Erlenmeyer, gelas piala dan instrumen kedokteran (untuk operasi). Suhu yang digunakan untuk sterilisasi panas kering adalah 160 C selama 90 menit sampai 3 jam (Gunasekaran, 2005). Obyek yang akan disterilkan ditempatkan pada oven udara panas dan dibakar sampai seluruh mikroba terbunuh. Panas kering dapat membunuh mikroba karena terjadi oksidasi struktur sel dan makromolekul. Panas kering tidak dapat digunakan untuk sterilisasi cairan (seperti media cair) karena kebanyakan cairan akan mendidih pada suhu 100oC, dan selama mendidih temperaturnya tidak akan naik. Pendidihan belum tentu dapat mensterilkan obyek, karena bebrapa spora bakteri tetap bertahan dengan pendidihan selama berjam-jam pada suhu 100oC.
c. Autoklaf (uap panas). Proses sterilisasi ini menggunakan uap panas dan tekanan sehingga obyek yang disterilkan dapat mencapai suhu 121oC, selama 15 menit.
Sterilisasi cara ini sering digunakan karena dapat membunuh beberapa spora mikroba.
Berbagai jenis media yang digunakan untuk kegiatan di laboratorium mikrobiologi disterilkan dengan cara ini.
