11
III. Bahan dan Metode
A. Bahan
Sampel yang digunakan adalah bakteri penghasil
biopigmen hasil isolasi dari Acropora nasuta yang diambil dari Taka Cemara Karimunjawa, Jepara, Jawa Tengah.
Bahan kimia yang digunakan diantaranya yeast extract,
peptone, agar bacteriological, untuk isolasi dan kultur
bakteri, etanol, n-heksana, aseton, metanol, asetonitril,
ammonium asetat, gas N2, akuades, dan akuabides untuk
ekstraksi dan identifikasi pigmen dengan UV-Tampak dan
KCKT. TE buffer, lysozym, SDS 10%, NaCl 5 M, CTAB,
Chloroform, Isopropanol, Etanol 70% digunakan untuk
ekstraksi DNA. Akuabides steril, primer 27oF, primer
1492R, DNA template pengenceran 100x, Mega Mix Royal untuk identifikasi bakteri.
B. Metode
Sampling Organisme Laut
Sampel karang lunak Acropora nasuta diambil dari perairan Taka Cemara Karimunjawa di kedalaman kurang
lebih 2 meter dengan peralatan scuba diving. Setelah pengambilan, sampel karang lunak segera dimasukkan ke
12
Sampel dicuci 3× dengan akuades steril untuk
menghindari kontaminasi air laut.
Pembuatan Media dan Isolasi Bakteri
Media yang digunakan adalah ZoBell 2216E marine
agar medium. Sebanyak 1 L media Zobell 2216E Agar
dibuat dengan mencampurkan 7.5 gram agar
bacteriological, 2.5 gram peptone, 0.5 gram yeast extract
ditambahkan air laut hingga mencapai volume 1000 mL
dan dihomogenisasi dengan pengaduk magnetik.
Campuran tersebut selanjutnya disterilisasi dalam
autoclave pada suhu 121°C selama 15 menit.
Isolasi bakteri dilakukan dengan pemotongan
bagian tubuh organisme laut, kemudian diencerkan dan
ditanam pada media Zobell 2216E Agar dalam cawan petri. Inkubasi dilakukan pada suhu kamar (±30oC)
selama 48 jam (Radjasa dkk, 2007). Berdasarkan
morfologi warna dari koloni-koloni bakteri yang tumbuh,
dilakukan pemurnian dengan teknik goresan (streak
13 Reaksi berantai polimerase (PCR) 16S rDNA
1. Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA dilakukan menurut Ausubel dkk
(1995). Kultur bakteri cair sebanyak 3 mL dimasukkan ke
dalam tabung eppendorf 1,5 mL, kemudian disentrifugasi
pada 13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan (cairan)
dibuang sehingga akan didapat sel-sel bakteri dalam
bentuk pelet. Pelet bakteri ditambahkan 500 μL TE buffer
lalu divortex selama 5 menit, ditambahkan 40 μl Lysozym
dan diinkubasi dalam waterbath pada suhu 37°C selama
1 jam. Selanjutnya larutan ditambahkan 200 μL SDS 10%
dan diinkubasi kembali, selanjutnya larutan ditambahkan
100 μL NaCl 5 M dan 80 μL CTAB dan diinkubasi pada
suhu 68°C selama 10 menit sampai larutan jernih.
Larutan ditambahkan kloroform sampai volume tabung
1,5 mL lalu tabung dibolak-balik dan disentrifugasi pada
13.000 rpm selama 10 menit. Supernatan di bagian atas
cincin dipindahkan ke tabung eppendorf baru,
ditambahkan Isopropanol (dengan volume 0,6x volume
supernatan) kemudian dibolakbalik dan disentrifugasi
pada 13.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dibuang,
lalu ditambahkan 100 μL Etanol 70% dan disentrifugasi
kembali pada 13.000 rpm selama 1 menit. Etanol dibuang
14
dikering anginkan. Setelah kering, pelet ditambahkan 15
μL TE Buffer. Ekstrak DNA disimpan dalam lemari
pendingin pada suhu -20oC.
2. Amplifikasi PCR 16S rDNA
Campuran bahan-bahan yang digunakan yaitu
akuabides steril (9,5 µl), primer 27oF (1 µL), primer 1492
R (1 µL), DNA template pengenceran 100x (1 µL), Mega Mix
Royal (12,5 µL) sehingga total volume 25 µL. Primer yang
digunakan untuk PCR 16S rDNA adalah primer universal
27oF (5'-AGAGTTTGATCMTG GC TCAG-3') dan primer
spesifik eubacteria 1492R (5'-TACG GYTACCTTGTTACGACTT-3') (Isnansetyo dan Kamei,
2003). Bahan-bahan tersebut dicampur dalam tabung
PCR 0,2 mL, dengan perlakuan suhu yang digunakan
pada PCR adalah: denaturasi pada 94oC selama 3 menit,
kemudian sebanyak 30 siklus (annealing pada 55oC
selama 60 detik, extension pada 72oC selama 90 detik dan
terakhir ~4oC (Sabdono, 2001).
Visualisasi produk PCR 16S rDNA ini dilakukan
melalui elektroforesis dengan memasukkan 5 μL produk
PCR ke dalam sumur gel agarosa 1%. Pembuatan gel
agarosa 1% dilakukan dengan melarutkan 1 g agarosa
dalam 100 mL larutan TAE buffer 1x, lalu dipanaskan
15
cetakan dengan sisir cetakan yang dipasang dengan posisi
tegak hingga melewati sisir sesuai dengan ketebalan yang
diinginkan. Gel dibiarkan beberapa saat sampai
mengeras. Selanjutnya gel direndam dalam larutan buffer
TAE 1×, kemudian dielektroforesis dengan voltase sebesar
100 V selama ± 30 menit. Setelah elektroforesis, gel
direndam dalam etidium bromida selama 10 menit untuk
mewarnai pita DNA yang terperangkap pada gel. Terakhir,
pita hasil PCR dapat dilihat dengan alat UV
transluminator.
3. Purifikasi Produk PCR 16S rDNA
Purifikasi dilakukan untuk mendapatkan DNA
murni hasil amplifikasi PCR 16S rDNA. Bahan yang
digunakan yaitu High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, Germany) yang terdiri dari tiga larutan yaitu,
larutan 1 (binding buffer), larutan 2 (washing buffer) dan larutan 3 (elution buffer).
Langkah awal dalam proses purifikasi adalah
fragmen DNA target pada gel agarosa dipotong secara
utuh menggunakan cutter tajam dan steril yang kemudian fragmen DNA tersebut ditampung dalam tabung ependorf 1,5 mL (berat tabung sudah ditera sebelumnya). Tabung
ependorf ditimbang kembali untuk mendapatkan berat gel
16
100 mg gel agarosa ditambahkan 300 µL larutan 1)
kemudian divortex selama 15-30 detik. Selanjutnya DNA
diinkubasi dalam waterbath pada suhu 56oC selama 10
menit, namun setiap 3 menit sekali divortex. Setelah gel
mencair, larutan ditambahkan isopropanol 150 µL pada
setiap 100 mg gel agarosa. Selanjutnya larutan
dimasukkan dalam tabung filter yang telah dimasukkan dalam tabung receiver sebelumnya dan disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 30 detik. Penyaringan dilakukan
sampai larutan hasil pengenceran gel agarosa habis.
Tabung filter mempunyai matriks pengikat DNA yang akan menahan DNA target. Pelet yang tersaring dalam
tabung filter diambil, ditambahkan 500 µL larutan 2, lalu disentrifugasi pada 13.000 rpm selama 1 menit.
Supernatan dibuang dan ditambahkan kembali dengan
larutan 2 sebanyak 200 µL lalu divortex selama 1 menit.
Supernatan dibuang, tabung filter dipindahkan ke dalam tabung ependorf steril yang baru. Sebanyak 50 µL larutan 3 dimasukkan ke dalam tabung filter dan disentrifugasi kembali pada 13.000 rpm selama 1 menit. Hasil purifikasi
DNA (larutan yang tertampung dalam tabung) kemudian
dielektroforesis menggunakan gel agarosa 1% untuk
17 Sekuensing
Sekuensing dilakukan menurut siklus PCR
sekuensing menggunakan Big Dye Terminator v.3.1. Formula untuk reaksi PCR sekuensing yaitu: 2 μL big dye, 2 μL buffer 10x, 4 μL templet DNA, 1 μL primer dengan konsentrasi 3,2 pmol, ddH2O hingga volume akhir
10 μL.
Amplifikasi DNA dilakukan dengan pengkodisian
alat (96°C selama 2 menit), selanjutnya sebanyak 25
siklus dengan ketentuan denaturasi (96°C selama 10
detik); annealing (50°C selama 5 detik); dan extension (60°C selama 4 menit). Hasil PCR dipurifikasi dan
disekuen menggunakan primer 27F
5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3' dan 1492R
5'TACGGYTACCTTGTTACGACTT3'. Sekuen dianalisis
secara otomatis (ABI 3130XL, Applied Biosystem).
Analisa Data BLAST Homologi
Analisis sekuen DNA isolat bakteri terbaik
dibandingkan dengan sekuen DNA pada basis data (data base) DNA. Penelusuran dilakukan menggunakan internet melalui program pelacakan data base Basic Local
18
Biotechnology Information, National Institute for Health,
USA (www.ncbi.nlm.nih.gov) (Altschul dkk, 1997).
Analisa Filogenetik
Analisis filogenetik bakteri dilakukan dengan
membandingkan sekuen bakteri terdekat dengan sekuen
16S rDNA bakteri target pada data base Gen Bank. Analisis BLAST dilakukan menggunakan bakteri
pembanding sebagai out group. Sekuen diolah dengan program ClustalX. Program ClustalX diaktifkan dan ditentukan model Multiple Alignment Mode, kemudian ditekan File dan Load Sequences lalu dipilih data sekuen yang ada. Langkah selanjutnya ditekan Alignment dan dipilih Do Complete Alignment, kemudian ditekan tombol
Align sehingga keluar ALN dan DND file. Tekan Trees dan
ceck list exsclude Positions with Gaps kemudian dipilih
Bootstrap N-J Tree dan tekan OK, sehingga keluar PHB
file. Terakhir, dibuka program njplot dan pilih Full Tree
pada bagian Operation dan Bootstrap values pada bagian
Display. Buka file lalu Open dan pilih PHB file yang telah
dibuat tadi. Setelah itu akan keluar pohon filogenik,
langkah terakhir edit dan copy, lalu paste di program
19 Seleksi β-karoten dengan Ekstraksi dan
Spektroskopi UV-Tampak
Sampel dalam kultur agar dikerok secara hati-hati
kemudian dilarutkan kedalam aquades steril dan di
presipitasi menggunakan refrigerated sentrifuge (4°C, 10.000 rpm, 10 menit). Pelet yang diperoleh kemudian
ditimbang sebanyak 0.4210 g dan kadar air diukur
menggunakan moisture balance (Shimadzu Kyoto) (kadar air 47,0%). Sampel yang sudah ditimbang kemudian
dimasukan ke dalam conical bottom tube dan ditambahkan 10 ml aseton 100%. Ekstraksi dilakukan
menggunakan vortex (IKA Vortex) skala 6 selama 4 menit. Ekstraksi dilakukan dalam kondisi inert dalam atmosfer gas N2 (UHP grade) dan pencahayaan merah.
Ekstraksi diulang sebanyak dua kali hingga pelet tidak
berwarna. Ekstrak pigmen kemudian disaring dengan
nylon filter (Whatman, 0.2 µm) kemudian dikeringkan
menggunakan gas N2.
Kemudian seleksi bakteri dilanjutkan dengan
mengamati spektrum ekstrak kasarnya yang dilarutkan
dalam aseton menggunakan spektrofotometer
ultraviolet-tampak berkas rangkap Varian Cary 50 pada panjang
20 Karakterisasi β-karoten dengan KCKT
Untuk analisa karakterisasi pigmen, ekstrak
pigmen kering kemudian dilarutkan kembali dalam 0.5
mL aseton dan siap untuk diinjeksi dalam analisa KCKT.
Metode KCKT yang digunakan mengacu pada metode
Hegazi dkk. (1998). Data KCKT dan spektra serapan dari
pengukuran β-karoten digambarkan dengan Program
Origin Pro 8.1.
Identifikasi β-karoten dengan UV-Tampak
Isolasi β-karoten dilakukan dengan menampung
pigmen murni saat puncaknya muncul di kromatogram
analisa KCKT pada menit-menit terakhir (60,24 menit).
Pigmen murni kemudian dikeringkan dengan gas N2 dan
dilarutkan ke dalam pelarut aseton, etanol, dan
n-heksana dan diukur menggunakan spektrofotometer 1700
pada panjang gelombang 300-500 nm (Shimadzu, Kyoto).
Kuantifikasi Kandungan β-karoten
Metode kuantifikasi dilakukan dengan
menggunakan metode analisa multi-kromatogram
21
dideteksi pada panjang gelombang 450 nm hingga 600 nm
dengan rentang selisih 1 nm.
Nilai rata-rata luas puncak kemudian di masukan
dalam persamaan garis :
Y = 0,0108X + 12.677 (Limantara dkk., 2013)
Dimana :
X = Luas puncak serapan
