ANTIOKSIDAN EKSTRAK KAPANG ENDOFIT Phomopsis spp.
DARI TANAMAN KINA (Cinchona calisaya Wedd.)
FIRDAUS RAMADHAN
PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
2017 M / 1439 H
ANTIOKSIDAN EKSTRAK KAPANG ENDOFIT Phomopsis spp.
DARI TANAMAN KINA (Cinchona calisaya Wedd.)
SKRIPSI
Sebagai Salah Satu Syarat Memperoleh Gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi
Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta
FIRDAUS RAMADHAN
1110095000026
PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
2017 M / 1439 H
Scanned by CamScanner
ABSTRAK
FIRDAUS RAMADHAN. Antioksidan Ekstrak Kapang Endofit Phomopsis spp. Dari Tanaman Kina (Cinchona calisaya Wedd.). Skripsi. Program Studi Biologi. Fakultas Sains dan Teknologi. Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. 2017. Dibimbing oleh Dr. Nani Radiastuti dan Yusraini Dian Inayati Siregar, M.Si.
Phomopsis spp. merupakan salah satu kapang endofit yang berhasil diisolasi dari tanaman kina (Cinchona calisaya). Kemampuan kapang endofit untuk menghasilkan senyawa bioaktif yang identik dengan inangnya menjadi solusi untuk memperoleh senyawa bioaktif tanpa banyak melakukan eksploitasi pada tanaman kina (C. calisaya). Penelitian ini bertujuan untuk menentukan aktivitas antioksidan (IC
50) dan mengetahui senyawa yang berperan sebagai antioksidan dari ekstrak kapang endofit Phomopsis spp. Parameter yang diamati berupa nilai pH awal dan akhir medium, ketebalan miselium, nilai IC
50dan identifikasi senyawa yang berperan sebagai antioksidan. Pengujian IC
50menggunakan metode uji 1,1-difenil-2-pikrilhidrazil (DPPH) dengan spektrofotometer UV-Vis (λ 517 nm) dan analisis kandungan senyawa pada ekstrak dengan GCMS. Berdasarkan hasil uji DPPH ekstrak kapang endofit Phomopsis M70 memiliki aktivitas antioksidan tertinggi (nilai IC
50terendah) yaitu, 1283,95 ppm. Hasil GCMS menunjukkan senyawa hexadecanoic acid, octadecanoic acid 2-(2-hydroxyethoxy) ethyl ester, benzeneethanol, 4-hydroxy-, 9- octadecanoic acid, hexadecanoic acid 2-hydroxy-1-(hydroxy methyl) ethyl ester dan octadecanoic acid, 2-hydroxy-1-(hydroxymethyl) ethyl ester yang berperan sebagai antioksidan dalam ekstrak kapang endofit Phomopsis sp. isolat M70.
Kata Kunci : Antioksidan, IC
50, Kapang endofit, Phomopsis spp., Tanaman kina
ABSTRACT
FIRDAUS RAMADHAN. Antioxidant Extract of Endophytic Fungi
Phomopsis spp. from Quina Plant (Cinchona calisaya Wedd.). UndergraduateThesis. Study Program Biology. Faculty of Science and Technology. State Islamic University Syarif Hidayatullah Jakarta. 2017. Advised by Dr. Nani Radiastuti and Yusraini Dian Inayati Siregar, M.Si.
Phomopsis spp. is one of the endophytic fungi that was isolated from quina plant (Cinchona calisaya). Endophytic fungi ability to produce bioactive compounds similar to host, as a solution to get bioactive compounds without doing a lot of exploitation in the quina plant. This study aims to determine antioxidant activity (IC
50) and know compound that has role as antioxidant in Phomopsis spp endophytic fungi extract. The measure parameters such as pH medium (early and final), mycelium thickness, IC
50, and analysis of bioactive compound in extracts of endophytic fungi Phomopsis spp. The IC
50test used 1.1- diphenyl-2-picrilhidrazil (DPPH) method with UV-Vis (λ 517 nm) and identification bioactive compound with GCMS. Based on the results of DPPH test isolates of Phomopsis sp. M70 has the highest antioxidant activity with IC
501283.95 ppm. Result of GCMS showed hexadecanoic acid, octadecanoic acid 2- (2-hydroxyethoxy) ethyl ester, benzeneethanol, 4-hydroxy-, 9-octadecanoic acid, hexadecanoic acid 2-hydroxy-1-(hydroxy methyl) ethyl ester and octadecanoic acid, 2-hydroxy-1-(hydroxymethyl) ethyl ester compounds which act as antioxidants in the extract isolates of Phomopsis sp. M70.
Keywords : Antioxidant, Endophytic fungi, IC
50, Phomopsis spp., Quina plants
i
KATA PENGANTAR
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT. Tuhan semesta alam yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat menyelesaikan proposal penelitian ini dengan sungguh-sungguh. Skripisi ini merupakan salah satu kewajiban yang diperuntukkan kepada mahasiswa dalam memenuhi persyaratan penelitian sebagai tugas akhir pada Program Studi Biologi Fakultas Sains dan Teknologi (FST) Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.
Skripsi dengan judul “Antioksidan Ekstrak Kapang Endofit Phomopsis spp. Dari Tanaman Kina (Cinchona calisaya Wedd.)” ini bertujuan untuk mengetahui potensi dan menentukkan nilai aktivitas antioksidan kapang endofit Phomopsis spp dari tanaman kina (C. calisaya Weed.) sebagai penghasil senyawa antioksidan.
Penulis sadar bahwa selesainya proposal penelitian ini merupakan peran dari berbagai pihak dalam memberikan kritik, saran, motivasi dan bimbingannya yang melengkapi segala kekurangan penulis sehingga pada kesempatan ini penulis menyampaikan rasa terima kasih kepada :
1. Dr. Agus Salim selaku Dekan Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.
2. Dr. Dasumiati dan Etyn Yunita, M.Si selaku Ketua dan Sekertaris Program
Studi Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi UIN Syarif Hidayatullah
Jakarta.
ii
3. Dr. Nani Radiastuti dan Yusraini Dian Inayati Siregar, M.Si. selaku pembimbing I dan II yang telah bersabar membimbing, banyak memberikan saran dan dukungan kepada penulis sehingga tersusunnya skripsi ini.
4. Keluarga tercinta (ayah, ibu dan kakak) atas segala dukungan materi dan doa kepada penulis.
5. Dr. Priyanti dan Etyn Yunita, M.Si selaku penguji sidang munaqasah penulis, sehingga karya ini lebih baik lagi.
6. Dr. Laode Sumarlin dan Dr. Megga Ratnasari Pikoli selaku penguji diseminar hasil yang memberikan banyak masukan hingga semakin baik kedepannya.
7. Dr. Irawan Sugoro dan Dede Sukandar, M.Si. selaku penguji di seminar proposal yang memberikan banyak masukan dan perbaikan pada bagian proposal.
8. Puji Astuti S.Si., Nur Amaliah Solihat S.Si., dan semua pranata lab yang telah memberikan pengetahuan dan informasi lebih kepada penulis.
9. Segenap dosen pengajar dan seluruh civitas akademik, Fakultas Sains dan Teknologi Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta, terima kasih atas ilmu dan nasehat yang ikhlas diberikan semoga dapat penulis manfaatkan.
10. Teman-teman penelitian kapang endofit Ario, Dalli, Alfida dan Ayu yang
telah bersedia berbagi ilmu dan pengalaman kepada penulis.
iii
11. Indhina, Alfan, Herwandi, Rachma, teman teman Biologi angkatan 2010 dan semua pihak yang berkontribusi dalam penulisan skripsi ini.Mardiansyah, M.Si., Saiful Bahri, M.Si., Ahmad Danial, M.Si., dan Fahri Fahrudin, M.Si. atas diskusi ringan dan pengalaman selama penulis menempuh program strata 1 (S1).
12. Ka Reza, Ka Dwi, Ka Jaelani, Rizky Aprizal, Maulana Malik, M. Hilal, A.
Rizal, Alby, teman teman kelompok studi GENOM dan semua pihak yang terlibat dan berperan dalam penulisan ini.
Penulis sangat menyadari bahwa dalam penyusunan skripsi ini masih belum sempurna, maka dari itu dengan kerendahan hati sebagai manusia biasa, penulis sangat mengharapkan saran dan kritik yang membangun.
Ciputat, Oktober 2017
Penulis
iv DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR ... i
DAFTAR ISI... iv
DAFTAR GAMBAR ... vi
DAFTAR TABEL ... vii
DAFTAR LAMPIRAN ... viii
BAB I PENDAHULUAN... 1
1.1 Latar Belakang ... 1
1.2 Perumusan Masalah ... 3
1.3 Hipotesis... 3
1.4 Tujuan Penelitian ... 3
1.5 Manfatat Penelitian ... 4
BAB II TINJAUAN PUSTAKA... 5
2.1 Tanaman Kina (Cinchona calisaya Wedd.) ... 5
2.2 Kapang Endofit ... 7
2.3 Phomopsis spp. ... 8
2.4 Antioksidan ... 10
2.5 Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH (1,1-difenil-2- pikrilhidrazil) ... 11
2.6 Spektrofotometer UV-Vis ... 13
2.7 Analisis Kromatografi Gas Spekstroskopi Massa(GC-MS) .. 13
BAB III METODOLOGI PENELITIAN ... 15
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ... 15
3.2 Alat, Bahan dan Sumber Isolat ... 15
3.3 Prosedur Kerja... 16
3.3.1 Pembuatan Medium Pertumbuhan ... 16
3.3.2 Pembiakan Isolat Kapang Endofit... 16
3.3.3 Fermentasi Cair ... 17
3.3.4 Pengukuran pH Medium dan Ketebalan Miselium ... 17
v
3.3.5 Ekstraksi... 17
3.3.6 Pengujian Aktivitas Antioksidan (IC
50) Menggunakan Metode DPPH ... 17
3.3.7 Analisis Kandungan Senyawa Menggunakan GC- MS ... 19
3.4 Analisis Data ... 19
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 20
4.1 Nilai pH Medium ... 20
4.2 Ketebalan Miselium ... 22
4.3 Aktivitas Antioksidan Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis ... 24 4.4 Analisis Kandungan Senyawa Kimia Menggunakan GC-MS . 29 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 32
5.1 Kesimpulan ... 32
5.2 Saran... 32
DAFTAR PUSTAKA ... 33
LAMPIRAN... 41
vi
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 1. Tumbuhan kina (Cinchona calisaya Weed.)... 6 Gambar 2. Proses masuknya endofit ke jaringan tanaman ... 7 Gambar 3. Pengamatan makroskopis atas dan bawah Phomopsis sp. .. 9 Gambar 4. Konidia Phomopsis sp. dari C. calisaya... 10 Gambar 5. Struktur kimia senyawa radikal bebas DPPH ... 12 Gambar 6. Mekanisme reaksi senyawa antioksidan dengan pereaksi
DPPH ... 12 Gambar 7 Hasil pengukuran pH awal dan akhir fermentasi isolat
kapang endofit Phomopsis spp ... 20 Gambar 8. Ketebalan miselium kapang endofit Phomopsis spp.pada
akhir fermentasi ... 23
Gambar 9. Nilai IC
50ekstrak isolat kapang endofit Phomopsis spp. .... 25
vii
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 1. Daftar Isolat Kapang Phomopsis spp. ... 16 Tabel 2. Kategori aktivitas antioksidan berdasarkan nilai IC
50... 19 Tabel 3. Peningkatan nilai pH medium pada isolat kapang Phomopsis
spp.. ...
22
Tabel 4. Hasil identifikasi senyawa yang terdapat dalam ekstrak
kapang endofit Phomopsis sp. M70 ... 29
viii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Morfologi kapang endofit Phomopsis spp ... 41 Lampiran 2. Hasil uji aktivitas antioksidan dari ekstrak kapang endofit
Phomopsis spp... 45 Lampiran 3. Hasil uji aktivitas antioksidan vitamin C ... 47 Lampiran 4. Hasil uji beda nyata peningkatan pH medium pada isolat
kapang Phomopsis spp. dengan One Way ANOVA ... 48
1 BAB I PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang
Tanaman kina (Cinchona calisaya Wedd.) merupakan tanaman yang telah dikenal sebagai tanaman obat. Simanjuntak et al. (2002) melaporkan terdapat senyawa alkaloid yang memiliki aktivitas antimalaria sehingga dijadikan bahan baku obat. Pemanfaatan kina dalam skala industri yang besar dapat menyebabkan populasi kina menurun. Terdapat 78-80% dari jumlah tanaman obat langsung diambil tanpa dibudidayakan dan hanya 20-22% yang dibudidayakan (Nugroho, 2010).
Pemanfaatan mikroba endofit salah satu solusi untuk produksi bioaktif dari tanaman tanpa mengakibatkan penurunan populasi tanaman. Mikroba endofit merupakan mikroba yang ada di dalam jaringan tanaman tanpa merugikan tanaman tersebut. Mikroba endofit yang telah berhasil diisolasi dari berbagai tanaman adalah jenis kapang. Kapang endofit tersebar hampir di seluruh tanaman vaskuler (Radji, 2005). Kapang endofit mampu menghasilkan senyawa bioaktif yang memiliki karakter mirip atau sama dengan inangnya seperti alkaloid, terpenoid, fenol, flavonoid, quinon, steroid dan lain sebagainya (Tan & Zhou, 2001). Beberapa jenis dari tanaman kina juga memiliki aktivitas antioksidan dan kadar fenolik (Ravishankara et al., 2003; Al-Mustafa & Al-Thunibat, 2008).
Phomopsis merupakan salah satu dari genus kapang endofit yang telah
berhasil diisolasi dari tanaman vaskuler. Beberapa penelitian sebelumnya
melaporkan kapang endofit Phomopsis spp. memiliki senyawa bioaktif sebagai
2
antibakteri (Adelin et al., 2011; Rakshith et al., 2013), antijamur (Hussain et al., 2015), antikanker (Adelin et al., 2013), dan antimalaria (Phongpaichit et al., 2007). Kemampuan kapang endofit Phomopsis spp. sebagai penghasil senyawa antioksidan untuk meredam radikal bebas dengan metode uji DPPH telah dilaporkan memiliki IC
50600 ppm (Kandasamy et al., 2015), 100 ppm (Nath et al., 2012), dan 31,25 ppm (Jayanthi et al., 2013).
Phomopsis spp. merupakan kapang endofit dominan yang berhasil diisolasi dari tanaman kina. Radiastuti (2015) melaporkan terdapat 687 strain kapang endofit yang terdiri dari 96 morfotipe telah berhasil diisolasi dari berbagai organ tanaman kina. Beberapa diantaranya telah diketahui dari genus Colletotrichum dan Phomopsis. Genus Colletotrichum hasil isolasi dari tanaman kina telah dilaporkan memiliki kemampuan produksi kuinin, aktivitas antibakteri (Zakiyah et al., 2015; Radiastuti et al., 2017). Septiawan (2015) melaporkan ekstrak biomassa dan filtrat kapang endofit Colletotrichum spp. memiliki aktivitas antioksidan yang lebih rendah dari vitamin C. Senyawa fenol, asam heksadekanoat, dan asam oktadekanoat merupakan senyawa yang berperan sebagai antioksidan pada ekstrak kapang Colletotrichum spp. Pada kapang Phomopsis spp. baru dilaporkan memiliki kemampuan menghasilkan senyawa alkaloid (Radiastuti et al., 2015) dan aktivitas antibakteri (Pamungkas, 2014),
Penelitian mengenai aktivitas antioksidan dari kapang Phomopsis spp.
tanaman kina belum dilaporkan. Kurangnya informasi mengenai aktivitas
antioksidan pada kapang endofit Phomopsis spp. tanaman kina disebabkan
sebagian besar penelitian senyawa bioaktif kapang tersebut difokuskan pada
3
senyawa alkaloid. Melihat potensi kapang endofit Phomopsis spp. sebagai penghasil bioaktif, maka perlu dilakukan penelitian mengenai aktivitas antioksidan ekstrak kapang endofit Phomopsis spp. dari tanaman kina.
1.2. Rumusan Masalah
1. Bagaimanakah aktivitas antioksidan dari ekstrak kapang endofit Phomopsis spp. dari tanaman kina (C. calisaya) ?
2. Senyawa apakah yang berperan sebagai antioksidan pada ekstrak kapang endofit Phomopsis spp. dari tanaman kina (C. calisaya)?
1.3. Hipotesis
1. Aktivitas antioksidan ekstrak kapang endofit Phomopsis spp. dari tanaman kina (C. calisaya) lebih rendah dari vitamin C.
2. Senyawa yang berperan sebagai antioksidan adalah golongan fenolik.
1.4. Tujuan
1. Mengetahui aktivitas antioksidan yang dari ekstrak kapang endofit Phomopsis spp. dari tanaman kina (C. calisaya).
2. Mengetahui senyawa yang berperan sebagai antioksidan ekstrak kapang
endofit Phomopsis spp. dari tanaman kina (C. calisaya).
4
1.5. Manfaat
Penelitian ini bermanfaat untuk mendapatkan ekstrak isolat kapang endofit
Phomopsis spp. dari tanaman kina (C. calisaya) yang memiliki potensi sebagai
penghasil senyawa antioksidan. Pemanfaatan kapang endofit yang terdapat pada
tanaman tersebut akan mengurangi pemakaian tanaman secara langsung, sehingga
kelestarian tanaman kina dapat terjaga dengan baik.
5 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Tanaman Kina (Cinchona calisaya Wedd.)
Tanaman kina merupakan tanaman yang berasal dari Amerika Selatan di sepanjang Pengunungan Andes yang meliputi wilayah Venezuela, Colombia, Equador, Peru sampai Bolivia. Daerah tersebut meliputi hutan-hutan yang memiliki ketinggian 900-3.000 m dpl. Tanaman Kina masuk ke Indonesia sekitar tahun 1852-1854 dan dikenal dengan beberapa nama, yaitu kina di Jawa Barat, kina merah di Jawa Tengah, kina kalisaya di Jawa Timur, dan kina ledgeriana di Sumatera Barat (Sultoni, 1995).
Terdapat dua jenis tanaman kina yang dibudidaya dalam skala perkebunan
di Indonesia, yaitu C. calisaya dan C. succirubra Pavon (Succi). Perbanyakan
tersebut dilakukan karena tanaman kina terutama kulit batangnya memiliki
senyawa yang bermanfaat di bidang farmasi seperti senyawa alkaloid dan di
bidang industri makanan dan minuman (Santoso et al., 2004). Allah SWT
menganjurkan pada manusia untuk memperhatikan tanda-tanda kebesaran Allah di
muka bumi, seperti tumbuh-tumbuhan yang berbagai macam, agar manusia
senantiasa berpikir bahwa ada manfaat didalamnya. Manfaat tumbuhan sebagai
obat-obatan sesungguhnya telah dijelaskan Allah SWT dalam Firman-Nya pada
surah Asy – Syu’ara’ ayat 7-8 :
6
“Dan apakah mereka tidak memperhatikan bumi, betapa banyak Kami
tumbuhkan di bumi itu berbagai macam (tumbuh-tumbuhan) yang baik? (7).
Sungguh pada yang demikian itu terdapat tanda (kebesaran Allah), tetapi
kebanyakan mereka tidak beriman (8).” (QS. 26 : 7-8) (Kemenag RI, 2011).Cinchona calisaya merupakan tanaman yang memiliki letak daun saling berhadapan, berbentuk melonjong, panjang berkisar antara 8-15 cm, lebar berkisar antara 3-6 cm, panjang tangkai berkisar antara 1-1,5 cm, bunga berbentuk malai, bunga menyerupai terompet, dan buah berwarna kemerahan (Gambar 1). Menurut Tjitrosoepomo (2005), klasifikasi tanaman kina adalah sebagai berikut Famili Rubiaceae, Genus Cinchona, Spesies : Cinchona calisaya.
A (B) (C) (D)
Gambar 1. Tanaman kina (C. calisaya ) (www. warintek. ristek. go.id /pertanian/
kina.pdf) (A), daun (B), bunga (C), dan ranting (D) & Dokumentasi pribadi).
Keadaan lingkungan yang cocok untuk tanaman kina adalah curah hujan
tahunan 2.000-3.000 mm/tahun dan merata sepanjang tahun. Ketinggian 800-2000
m dpl dengan lingkungan bersuhu 13,5-21°C, kelembaban relatif harian minimum
dalam satu tahun 68-97%. Tanah dengan nilai pH 4,6–6,5 yang subur, gembur,
banyak mengandung bahan organik dan tidak berbatu.
7
2.2. Kapang Endofit
Kapang (mould/filamentous fungi) merupakan mikroorganisme heterotrof dan tidak berklorofil yang tergolong anggota kingdom fungi yang membentuk hifa (Carlile et al., 2001). Kapang endofit adalah kapang yang hidup di dalam jaringan tanaman baik pada bagian akar, daun, batang, buah ataupun ranting dengan membentuk koloni tanpa membahayakan inangnya (Clay, 1988). Proses masuknya kapang endofit ke dalam jaringan tanaman inang terjadi secara langsung dan tidak langsung. Secara langsung ditandai dengan masuknya endofit ke dalam bagian internal pembuluh tanaman dan diturunkan melalui biji, sedangkan secara tidak langsung endofit menginfeksi bagian eksternal yaitu bagian pembungaan (Bacon, 1985) (Gambar 2).
Gambar 2. Proses masuknya endofit ke jaringan tanaman (Jalgaonwala et al., 2011).
Beberapa fungsi kapang endofit melindungi tanaman inang dari hama
serangga, mikoorganisme patogen dan hewan hebivora dengan menghasilkan
senyawa metabolit (Khan et al., 2007 ; Vega et al., 2008). Tanaman inang
8
berperan dalam menyediakan tempat tinggal dan nutrisi bagi kapang endofitnya (Carlile et al., 2001).
Fungi endofit sangat beragam jenisnya, tetapi umumnya tergolong ke dalam filum Ascomycetes (de Errasti et al., 2010 ; Jalgaonwala et al., 2011).
Genus kapang endofit hasil isolasi dari beberapa tanaman yang telah berhasil diidentifikasi dari filum Ascomycetes yaitu, Penicillium spp. dan Aspergillus spp.
dari tanaman Broussnetia papyrifera Vent. (Kenardo, 2011). Kapang endofit Xylaria sp. merupakan anggota Ascomycetes yang diisolasi dari tanaman Cinchona pubescens (Shibuya et al., 2003).
2.3.
Phomopsis spp.Phomopsis spp. merupakan salah jenis kapang endofit yang telah diketahui terdapat dalam jaringan tanaman obat. Beberapa tanaman obat seperti Artabotrys odoratissimus, Cassia auriculata, Guazuma ulmifolia, Terminalia catappa, Vitex negunda dan Urginea indica telah dilaporkan memiliki Phomopsis spp. sebagai kapang endofit (Gopinath et al., 2013; Desale & Bodhankar, 2013; Kameshwari et al., 2015). Kapang endofit jenis Phomopsis spp. penghasil senyawa turunan anthraquinone juga telah berhasil diisolasi pada lingkungan mangrove (Klaiklay et al., 2012).
Phomopsis sp. merupakan anamorf atau fase aseksual dari Diaporthe sp.
(Ash et al., 2010). Kapang ini memiliki koloni seperti farinaceous yaitu seperti
wol menyerupai kapas. Berwarna keputih-putihan, pucat hingga cokelat muda
atau pucat keabu-abuan. Morfologi mikroskopis Phomopsis sp. (Gambar 3) terdiri
9
dari bentuk miselium terbenam, bercabang, septat, hialin berwarna coklat pucat.
Pycnidia berwarna hitam yang terbenam di dalam jaringan epidermis. Pycnidia berbentuk bulat, berukuran 240-450 x 230-380 µm (Jurkovic et al., 2007).
(A) (B)
Gambar 3. Pengamatan makroskopis atas Phomopsis sp (A), dan bawah (B) (Dokumen Pribadi).
Morfologi mikroskopis Phomopsis sp. terdiri dari bentuk miselium terbenam, bercabang, septat, hialin berwarna coklat pucat. Konidia terbenam dengan warna coklat. Tubuh buah berwarna hitam kecil yang terbenam di dalam jaringan epidermis (Jurkovic et al., 2007). Konidia eustromatik, superfisial, tersebar, berwarna hitam, sedikit membulat hingga tak beraturan, dinding konidia sekitar 10 sel yang tebal dengan lapisan luar berwarna coklat hingga kehitaman, bentuk hifa tidak teratur di daerah atas, ostiola tunggal, dan berbentuk bundar.
Konidiospora memendek dengan 1, 2, atau multiseptat dan bercabang, dan sel
konidia enteroblastik (Gambar 4). Konidia terdiri dari dua jenis, yaitu alfa dan
beta konidia. Alfa konidia memiliki ukuran berkisar antara 5,4-5,7 x 1,3-1,6 μm
hialin, fusiform, lurus, dan aseptat. Beta konidia memiliki ukuran berkisar 23,6-
10
27,1 x 1,6-2,1 μm hialin, filiform, lurus atau melengkung, dan aseptat (Radiastuti, 2015)
.Gambar 4. Konidia Phomopsis sp. dari C. calisaya (perbesaran 1000x) (Pamungkas, 2014).
Phomopsis sp. hidup pada suhu 5-35°C dan optimum pada suhu 25°C.
Tumbuh optimum pada nilai pH 5,5, tidak menghasilkan pycnidial pada nilai pH 3,5. Pembentukan pycnidial optimum pada pH 8,5 (Zivkovic et al., 2007).
Klasifikasi Phomopsis sp. Kingdom Fungi, Filum Ascomycota, Kelas Sordariomycetes, Ordo Diaporthales, Famili Valsaceae, Genus Phomopsis, Spesies Phomopsis sp. (NCBI, 2014).
2.4. Antioksidan
Antioksidan adalah senyawa kimia yang memiliki satu atau lebih elektron
bebas. Elektron bebas pada antioksidan digunakan sebagai donor H pada radikal
bebas sehingga berubah menjadi bentuk yang lebih stabil (Aini, 2007). Secara
umum sumber radikal bebas dapat dibedakan menjadi dua, yaitu endogen dan
eksogen. Radikal bebas endogen merupakan radikal bebas yang berasal dari dalam
sistem tubuh dan radikal bebas eksogen merupakan radikal bebas yang berasal
dari luar sistem tubuh. Radikal bebas endogen dapat terbentuk melalui
11
autoksidasi, oksidasi enzimatik, fagositosis dalam respirasi, transfer elektron di mitokondria dan oksidasi ion-ion logam transisi (Rohmatussolihat, 2009).
Radikal bebas eksogen dapat berasal dari sinar UV, radiasi, polusi, makanan dan pestisida (Supari, 1996).
Tanpa adanya antioksidan beberapa gangguan dan penyakit degeneratif seperti penuaan dini, kanker dan gangguan degeneratif neuron dapat terjadi akibat radikal bebas dan jenis oksidan reaktif lainnya (Arouma, 1998). Berdasarkan penggolongannya antioksidan terbagi menjadi antioksidan enzim dan vitamin.
Antioksidan enzim meliputi superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase (GSH.Prx). Antioksidan vitamin mencakup alfa tokoferol (vitamin E), beta karoten (pro vitamin A) dan asam askorbat (vitamin C) (Rohmatussolihat, 2009).
Antioksidan dapat diperoleh dari berbagai sumber, untuk jenis enzim umumnya dihasilkan oleh tubuh sendiri yaitu, pada mitokondria, sitoplasma dan lain-lain (Rohmatussolihat, 2009). Antioksidan jenis vitamin diperoleh dengan mengkonsumsi sayur-sayuran hijau dan buah-buahan seperti jeruk dan manggis.
Udang, ikan salmon, dan kerang juga merupakan sumber antioksidan. Bahan- bahan tersebut umumnya banyak mengandung vitamin C, vitamin A, fenolik, saponin, terpenoid (Rohmatussolihat, 2009; Nurjanah et al., 2011).
2.5. Uji Aktivitas Antioksidan dengan DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil)
Difenil pikrilhidrazil (α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl) atau DPPH
merupakan senyawa organik yang mengandung nitrogen dan kekurangan satu
12
elektron (Gambar 5). Senyawa ini merupakan radikal bebas yang stabil dan dapat dilarutkan saat digunakan sebagai pereaksi. DPPH digunakan sebagai radikal bebas untuk mengevaluasi aktivitas antioksidan dari beberapa senyawa alami.
Senyawa ini juga dapat bertahan stabil dalam waktu yang lama apabila disimpan dalam keadaan yang kering dan kondisi penyimpanan yang baik (Winarsi, 2007).
Gambar 5. Struktur kimia senyawa radikal bebas DPPH (Molyneux, 2004).
Prinsip pengujian antioksidan adalah reaksi penangkapan hidrogen dari antioksidan oleh radikal bebas DPPH diubah menjadi 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil yang kemudian diukur intensitasnya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 517 nm (Alam et al., 2013). Besarnya aktivitas antioksidan pada sampel menyebabkan perubahan warna dan penurunan nilai absorbansi.
Perubahan warna ini disebabkan adanya transfer elektron dari senyawa antioksidan ke senyawa radikal DPPH (Antolovich et al., 2002) (Gambar 6.).
Gambar 6. Mekanisme reaksi senyawa antioksidan dengan pereaksi DPPH
(Molyneux, 2004).
13
2.6. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer adalah alat yang terdiri dari spektrometer dan fotometer.
Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi. Prinsip kerja alat ini adalah spektrum elektromagnetik dibagi dalam beberapa daerah cahaya. Suatu daerah akan diabsorbsi oleh atom atau molekul dan panjang gelombang cahaya yang diabsorbsi dapat menunjukan struktur senyawa yang diteliti. Spektrum elektromagnetik meliputi suatu daerah panjang gelombang yang luas dari sinar gamma gelombang pendek berenergi tinggi sampai pada panjang gelombang mikro (Owen, 2000).
Pada uji DPPH metode ini didasarkan pada perubahan warna radikal bebas. Absorbansi yang diukur pada metode ini adalah absorbansi larutan DPPH sisa yang tidak beraksi dengan senyawa antioksidan. Spektrofotometer UV-Vis akan mengukur besarnya energi yang diabsorbansi atau diteruskan oleh suatu zat.
Larutan yang mengandung zat yang dapat menyerap cahaya monokromatik akan mengakibatkan terjadinya pemantulan, penyerapan atau penerusan dari cahaya tersebut (Harmita, 2006)
2.7. Analisis Kromatografi Gas Spektroskopi Massa (GC-MS)
Kromatografi spektroskopi massa adalah teknik analisis yang
menggunakan dua metode analisa yaitu kromatografi gas (KG) dan spektroskopi
massa (SM). Kromatografi gas yaitu untuk menganalisis jumlah senyawa secara
kuantitatif dan kedua spektrofotometri massa untuk menganalisis struktur
14
senyawa yang dianalisis. Prinsip kerja dari KG yaitu pemisahan campuran berdasarkan perbedaan kecepatan migrasi komponen-komponen penyusunnya.
KG umumnya digunakan untuk mengidentifikasi suatu senyawa yang terdapat pada campuran gas dan juga menentukan konsentrasi suatu senyawa dalam fase gas. Penggunaan KG dapat dipadukan dengan SM sehingga menghasilkan data yang lebih akurat dalam mengidentifikasi senyawa yang dilengkapi standar molekulnya (Pavia et al., 2006).
Pemisahan komponen dalam instrument ini terjadi di dalam kolom
(kapiler) KG dengan melibatkan dua fase, yaitu fase gerak dan fase diam. Fase
gerak merupakan gas pembawa dan fase diam adalah zat yang ada di dalam
kolom. Proses pemisahan terjadi karena terdapat perbedaan kecepatan alir dari
tiap molekul di dalam kolom. Komponen yang telah dipisahkan masuk kedalam
ruang SM sebagai detektor secara intrumentasi (McMaster, 2008).
15
BAB IIIMETODOLOGI PENELITIAN 3.1. Waktu dan Tempat
Penelitian dilaksanakan pada bulan Maret 2015 sampai Maret 2016.
Lokasi penelitian yaitu di Laboratorium Mikrobiologi dan Laboratorium Pangan, Pusat Laboratorium Terpadu (PLT) Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah (UIN) Jakarta.
3.2. Alat, Bahan dan Sumber Isolat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah peralatan gelas laboratorium, pH meter, jangka sorong, rotary evaporator (EYELA SB1000), timbangan elektrik (OHaus), spektrofotometer UV-Vis (Perkin Elmer) dan kromatografi gas spektroskopi massa (GC-MS) (Shimadzu QP2010). Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah isolat kapang Phomopsis spp., alkohol 70%, metanol (Merck), akuades, etil asetat p.a. (Mallinckrodt), larutan 1,1-difenil- 2-pikrilhidrazil (DPPH) (Merck) dan vitamin C.
Isolat kapang endofit yang digunakan sebanyak 11 isolat Phomopsis spp.
dan Diaporthe spp. (teleomorf dari Phomopsis) yang berbeda dan diisolasi dari berbagai organ tanaman C. calisaya di Pusat Perkebunan Teh dan Kina, Gambung, Ciwidey, Bandung, Jawa Barat (l7° 8'35.78"S 107°30'59.55"E).
Kondisi lingkungan memiliki nilai pH tanah 6,8 dan kelembaban tanah 35%.
Isolat tersebut telah diidentifikasi pada penelitian sebelumnya secara morfologi
(Lampiran 1.) dan molekuler dengan ITS rDNA (Radiastuti, 2015) (Tabel 1).
16
Tabel 1. Daftar isolat Phomopsis spp.
No. Kode Isolat Sumber Isolasi Spesies 1 5_3_1_C3_M13 Ranting Diaporthe hongkongensis 2 2_3_4_A3_M15 Ranting Phomopsis sp. 3
3 5_1_2_A1_M22 Daun Phomopsis sp. 4 4 1_3_3_C3_M24 Ranting Diaporthe sp. 2 5 3_1_1_A7_M36 Daun Phomopsis sp. 3 6 1_3_4_B3_M39 Ranting Phomopsis longicola 7 3_5_3_D3_M65 Akar Phomopsis hongkongensis 8 5_3_3_D2_M70 Ranting Phomopsis sp. 9
9 2_2_2_B1_M78 Tangkai Daun Phomopsis sp. 12 10 4_3_5_D2_M89 Ranting Diaporthe sp. 10 11 1_3_4_C2_M95 Ranting Phomopsis sp. 16
3.3. Prosedur Kerja
Prosedur kerja penelitian ini terdiri dari beberapa rangkaian kerja yaitu, pembuatan medium, pengukuran nilai pH awal. pembiakan isolat kapang endofit, fermentasi cair, pengukuran nilai pH akhir, pengukuran ketebalan miselium, ekstraksi, pengujian aktivitas antioksidan, dan analisis kandungan bioaktif.
3.3.1. Pembuatan Medium Pertumbuhan
Potato Dextrose Agar (PDA) ditimbang sebanyak 39 g, dan Potato Dextrose Broth (PDB) ditimbang sebanyak 26,5 g, selanjutnya ditambahkan
aquades hingga volumenya mencapai 1000 mL. Media tersebut dihomogenkan menggunakan magnetic strirrer diatas hot plate. Tahap terakhir disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121°C, tekanan 2 atm selama 15 menit.
3.3.2. Pembiakan Isolat Kapang Endofit
Isolat murni kapang endofit, kemudian ditumbuhkan kembali pada media
PDA baru sebagai isolat tunggal, yaitu sebanyak 11 isolat tunggal. Isolat
17
selanjutnya diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang dan isolat tunggal yang didapatkan, kemudian disimpan sebagai kultur stok untuk pengujian antioksidan.
3.3.3. Fermentasi Cair
Isolat kapang endofit dari medium PDA, kemudian dilakukan fermentasi cair menggunakan medium PDB sebanyak 200 mL. Selanjutnya, medium tersebut disterilisasi pada suhu 121
oC selama 15 menit dan diinkubasi selama 4 hari untuk melihat ada atau tidaknya kontaminan pada media tersebut atau tidak. Isolat kapang endofit diinokulasikan ke dalam PDB sebanyak 3 cuplikan (Rukachaisirikul et al., 2008) dan diinkubasi pada suhu ruang dengan metode statis selama 21 hari. Setelah 21 hari hasil fermentasi, kemudian diekstraksi untuk pengujian antioksidan.
3.3.4. Pengukuran pH Medium dan Ketebalan Miselium
Pengukuran pH dilakukan pada saat awal (sebelum fermentasi) dan akhir (sesudah 21 hari fermentasi) menggunakan pH meter. Ketebalan miselium diukur pada akhir fermentasi dengan menggunakan jangka sorong.
3.3.5. Ekstraksi
Hasil fermentasi kemudian diekstraksi dengan menggunakan etil asetat hingga terbentuk 2 lapisan. Lapisan atas dipisahkan dan dipekatkan dengan rotary
evaporator 4000 rpm dengan 45°C hingga didapatkan ekstrak pekat. Ekstrak siapdigunakan untuk uji antioksidan.
3.3.6. Pengujian Aktivitas Antioksidan Mengunakan Metode Uji DPPH
Sebanyak 0,002 mg DPPH dilarutkan dalam 100 ml metanol lalu disimpan
dalam botol gelap (0,002%), larutan ini selalu dibuat baru untuk setiap pengujian.
18
Ekstrak etil asetat dan dilarutkan dalam metanol sampai diperoleh larutan stok 10.000 ppm. Larutan stok tersebut dilakukan pengenceran variasi konsentrasi dari.125 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1000 ppm, 2000 ppm dan 4000 ppm (Lampiran 2.). Vitamin C digunakan sebagai pembanding variasi konsentrasi 0,2 ppm, 0,4 ppm, 1 ppm, dan 4 ppm (Lampiran 3.).
Absorbansi diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada λ 517 nm. Aktivitas aktioksidan diukur dari penurunan absorbansi larutan DPPH akibat penambahan ekstrak hasil fermentasi, sebagai pembanding digunakan vitamin C.
Aktivitas antioksidan yang dipaparkan dalam bentuk kurva dengan program Microsoft Excel 2007. Presentasi inhibisi ekstrak kapang dan vitamin C terhadap larutan DPPH dihitung dengan rumus :
% inhibisi =
Hasil pengujian diperoleh nilai absorbansi sampel uji dan absorbansi
kontrol, dari nilai absorbansi tersebut dinilai % inhibisi dari berbagai konsentrasi
kemudian disajikan dalam bentuk kurva regresi linier yang ditempatkan antara
konsentrasi pada sumbu X dengan aktivitas peredaman DPPH (% inhibisi) pada
sumbu X dengan aktivitas peredaman DPPH (% inhibisi) pada sumbu Y. Nilai
IC
50(Inhibition Concentration 50 ) ditetapkan dari persamaan regresi linier
dengan memasukkan nilai 50 ke dalam Y. Konsentrasi ini merupakan konsentrasi
ekstrak hasil fermentasi yang dibutuhkan untuk penghambatan radikal DPPH
terbesar 50% (Molyneux, 2004). Nilai IC
50tersebut dikategorikan aktivitas
antioksidannya pada Tabel 2.
19
Tabel 2. Kategori aktivitas antioksidan berdasarkan nilai IC
50(Jun et al., 2003)
Nilai IC50 (ppm) Kategori Aktivitas Antioksidan< 50 Kuat
51 - 100 Aktif
101 - 250 Sedang
251 - 500 Lemah
> 500 Tidak aktif
3.3.7. Analisis Kandungan Senyawa Bioaktif Menggunakan GC-MS
Ekstrak kapang endofit yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi (IC
50terendah) dipilih untuk dilakukan analisis kandungan senyawa dengan GC-MS.
Sampel sebanyak 1 μL diinjeksikan ke dalam GC-MS yang dioperasikan menggunakan kolom DB SMS Agilent 30 m, diameter 0,25 mm, dan ketebalan 0,25 µm. Temperatur kolom awal 50C, temperatur akhir 250C dengan kenaikan temperatur 5
oC/menit hingga 250C, gas pembawa helium bertekanan 53,6 kPa, total laju 14 mL/menit dan split rasio sebesar 10. Senyawa kimia yang diperoleh akan diidentifikasi dengan perangkat lunak Wiley7 dan NIST147 library.
3.4. Analisis Data
Data peningkatan nilai pH medium dianalisis statsistik dengan one way
ANOVA (p<0.05). Peningkatan nilai pH medium yang berbeda nyata diuji dengan
uji lanjutan Duncan Multiple Rate Test (DMRT). Perangkat lunak yang digunakan
untuk pengujian statistik yaitu SPSS versi 20. Data ketebalan miselium, nilai IC
50,
dan senyawa hasil identifikasi GC-MS dianalisis secara deskriptif.
20 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Nilai pH Medium
Nilai pH medium pada awal fermentasi (hari ke-0) yaitu 6,4 dan mengalami peningkatan rata-rata sebesar 1,49±0,09 pada akhir fermentasi (hari ke-21) (Gambar 7). Pengukuran pH medium merupakan parameter abiotik yang penting dalam pertumbuhan kapang untuk proses fermentasi. Hal tersebut terkait dengan proses pembentukan dan aktivasi enzim-enzim pada kapang yang memerlukan nilai pH tertentu.
Gambar 7. Hasil pengukuran pH awal dan akhir fermentasi isolat kapang endofit Phomopsis spp.
Keadaan nilai pH awal medium pada penelitian ini menunjukan nilai yang optimum yaitu pH 6 hingga 7 untuk menghasilkan metabolit sekunder seperti senyawa antioksidan (Gazi et al., 2004) dan bioaktif lainnya (Papagianni, 2004;
Merlin et al., 2013). Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa senyawa metabolit sekunder seperti fusarielins terbentuk di pH 6 pada Fusarium sp. dan lovastatin di pH 6,5 pada Aspergillus tereus (Bizukojc et al., 2012; Sorensen et al., 2013).
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
M13 M15 M22 M24 M36 M39 M65 M70 M78 M89 M95
Nilai pH
Isolat kapang endofit Phomopsis spp.
Nilai pH Awal Nilai pH Akhir
21
Flores et al. (2013) melaporkan Phomopsis longicolla dari tanaman Trichilia elegans memproduksi senyawa propionat pada pH 6,6.
Peningkatan nilai pH diduga karena proses metabolisme yang dilakukan oleh kapang endofit Phomopsis spp. pada media fermentasi. Kapang menghasilkan enzim protease untuk menghidrolisis komponen protein pada media. Protein yang dihidrolisis menjadi peptida-peptida kemudian asam amino.
Senyawa hasil hidrolisis digunakan sebagai sumber karbon dan energi, sebagian didegradasi hingga terbentuk ammonia sehingga terjadi peningkatan nilai pH (Purwoko, 2007).
Berdasarkan uji One Way ANOVA terdapat perbedaan yang signifikan pada peningkatan nilai pH medium isolat kapang Phomopsis spp. (Lampiran 6.) Hasil uji lanjut melaporkan perbedaan peningkatan nilai pH medium pada isolat kapang M70 berbeda dengan isolat lainnya (Tabel 3). Senyawa asam organik yang dihasilkan oleh isolat kapang M70 diduga mampu mempertahankan nilai pH medium agar tetap mendekati netral.
Isolat M13, M24, M65, M78, dan M95 merupakan isolat dengan
peningkatan nilai pH medium tertinggi pada yaitu 1,53-1,83. Pemanfaatan
kembali asam-asam organik yang dihasilkan merupakan penyebab meningkatnya
nilai pH. Selain itu, Walker & White (2011) menyatakan peningkatan nilai pH
medium dapat terjadi karena senyawa organik bersifat basa seperti ammoniak
lebih banyak dihasilkan dibandingkan dengan yang bersifat asam.
22
Tabel 3. Peningkatan nilai pH medium pada isolat kapang Phomopsis spp.
Hasil beda nyata ditandai dengan huruf yang berbeda
4.2. Ketebalan Miselium
Terbentuknya miselium merupakan ciri terjadinya pertumbuhan pada kapang. Miselium yang tumbuh kemudian mengalami penebalan akibat penambahan jumlah dan massa sel. Pertumbuhan dimulai dari spora atau konidia kemudian membentuk hifa yang kemudian membentuk miselium (Carlile et al., 2003). Ketebalan miselium isolat kapang endofit Phomopsis spp. berkisar antara 7-12 mm pada akhir fermentasi (Gambar 8). Perbedaan ketebalan miselium dari setiap isolat kapang endofit disebabkan adanya perbedaan kemampuan dalam menyerap nutrisi. Isolat M70 memiliki ketebalan miselium yang paling tebal (12 mm) dan isolat M13 memiliki ketebalan paling tipis (7 mm) dibandingkan dengan isolat lainnya. Kemampuan isolat M70 untuk menyerap nutrisi dalam media lebih cepat dari isolat lainnya yang menyebabkan memiliki miselium lebih tebal. Isolat M70 memiliki pertumbuhan yang cepat yaitu sekitar 4 cm dalam tiga hari berbeda dengan isolat lain yaitu, 2 cm (Lampiran 1).
Isolat Kapang Endofit Phomopsis spp. Peningkatan Nilai pH
M13 1.73 ± 0.06a
M15 1.30 ± 0.10b
M22 1.23 ± 0.15b
M24 1.70 ± 0.10a
M36 1.27 ± 0.12b
M39 1.80 ± 0.10a
M65 1.83 ± 0.15a
M70 0.97 ± 0.06c
M78 1.60 ± 0.10a
M89 1.40 ± 0.10b
M95 1.53 ± 0.06a
23
Gambar 8. Ketebalan miselium kapang endofit Phomopsis spp pada akhir fermentasi.
Beberapa faktor dapat mempengaruhi pertumbuhan miselium kapang selain faktor internal gen dan fisiologis. Jenis serta konsentrasi sumber karbon dan nitrogen, pH, mikromineral, dan suhu juga mempengaruhi proses pembentukan miselium kapang pada fermentasi cair (Carlile et al., 2001; Papagianni et al., 2004). Isolat kapang yang memiliki nilai pH medium akhir 7,37±0,06-7,80±0,10 seperti isolat M15, M36, M70, dan M89 (Gambar 7.) cenderung memiliki miselium yang lebih tebal dari isolat yang memiliki nilai pH basa.
Isolat M13, M39, M65, dan M78 memiliki miselium lebih tipis dibanding isolat lainnya disebabkan memiliki nilai pH yang basa yaitu 8,13±0,06-8,23±0,15.
Merlin et al. (2013) melaporkan kapang endofit Fusarium solani dari tanaman Tylophora indica yang pertumbuhannya terhambat pada pH yang basa. Nilai pH medium akhir yang basa dapat menyebabkan terhambatnya proses penyerapan nutrisi oleh isolat kapang. Walker & White (2010) menyatakan nilai pH medium mempengaruhi permeabilitas membran dan dinding sel. Proses penyerapan dan
0 2 4 6 8 10 12 14
M13 M36 M15 M22 M24 M39 M65 M70 M78 M89 M95 Ketebalan miselium (mm)
Isolat kapang endofit Phomopsis spp.
24
pelepasan ion-ion dalam medium pertumbuhan akan dipengaruhi oleh hal tersebut sehingga berdampak pada pertumbuhan kapang.
Pertumbuhan miselium yang tipis pada beberapa isolat dapat juga disebabkan masa adaptasi lebih lama dan sehingga proses penyerapan nutrisi medium lebih lambat. Agusta (2009) menyatakan beberapa strain kapang endofit membutuhkan waktu lebih lama untuk beradaptasi dan tumbuh dibandingkan kapang non-endofit. Beberapa faktor terhambatnya pertumbuhan miselium disebabkan adanya akumulasi senyawa metabolisme yang bersifat toksik dan pertumbuhan kapang yang telah mencapai fase stasioner (Purwoko, 2007).
4.3. Aktivitas Antioksidan Menggunakan Spektrofotometer UV-Vis
Interpretasi aktivitas antioksidan dalam penelitiani ini menggunakan nilai Inhibition Concentration (IC
50). Nilai Inhibition Concentration 50% (IC
50) merupakan konsentrasi suatu bahan yang mampu meredam radikal bebas DPPH sebanyak 50% (Molyneux, 2004). Nilai IC
50akan selalu berbanding terbalik dengan aktivitas antioksidan suatu bahan. Semakin rendah nilai IC
50pada suatu bahan maka semakin tinggi aktivitas antioksidan pada bahan tersebut (Yuhernita
& Juniarti, 2011).
Nilai IC
50pada setiap ekstrak kapang endofit Phomopsis spp. memiliki kisaran 1283,95-5073,75 ppm (Gambar 9). Ekstrak kapang M70 memiliki aktivitas antioksidan tertinggi dengan nilai IC
501283.95 ppm dan ekstrak kapang M13 memiliki aktivitas antioksidan terendah dengan nilai IC
505073.75 ppm.
Isolat kapang M70 memiliki aktivitas antioksidan tertinggi diduga karena
0.00 1000.00 2000.00 3000.00 4000.00 5000.00
M13 M36 M15 M22 M39 M65 M70 M78 M95 M24 M89 Vit C Konsentrasi (ppm)
Isolat kapang endofit Phomopsis spp. dan Vitamin C
25
memiliki miselium paling tebal. Miselium merupakan bagian penghasil senyawa bioaktif terbanyak pada kapang (Hanson, 2008). Semakin tebal miselium dapat menjadi salah satu faktor banyaknya senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh kapang secara intraseluler (Walker & White, 2001). Hal ini dapat dilihat dari isolat M36 dan M89 yang memiliki miselium lebih tebal yaitu 10 dan 11 mm dan memiliki nilai IC
50lebih rendah dibandingkan isolat lainnya.
Gambar 9. Nilai IC
50ekstrak isolat kapang endofit Phomopsis spp.
Ketebalan miselium hanya salah satu faktor yang mendukung jumlah senyawa bioaktif yang dihasilkan. Tebal miselium tidak selalu diikuti dengan tingginya aktivitas antioksidan. Hal tersebut terjadi pada isolat kapang M15 memiliki miselium lebih tebal yaitu 10 mm dibandingkan isolat M22 yaitu 9 mm (Gambar 8.) namun nilai IC
50lebih tinggi (Gambar 9.). Perbedaan jenis senyawa yang dihasilkan juga akan mempengaruhi tinggi rendahnya aktivitas antioksidan pada ekstrak. Senyawa bioaktif tertentu seperti antioksidan hanya ditemukan pada organisme spesifik, atau bahkan strain yang spesifik, dan hanya diproduksi pada kondisi-kondisi tertentu (Dewick, 2002).
0.00 1000.00 2000.00 3000.00 4000.00 5000.00
M13 M36 M15 M22 M39 M65 M70 M78 M95 M24 M89 Vit C Konsentrasi (ppm)
Isolat kapang endofit Phomopsis spp. dan Vitamin C
26
Kemampuan isolat dalam menghasilkan senyawa bioaktif masing-masing berbeda. Terdapat isolat yang berpotensi memproduksi hanya satu jenis dan lebih dari satu jenis senyawa bioaktif (Pratiwi, 2008). Radiastuti (2015) melaporkan isolat M13, M39, dan M70 merupakan isolat penghasil senyawa kuinin tertinggi pada penelitian sebelumnya. Pada penelitian ini isolat M70 merupakan isolat yang memiliki aktivitas antioksidan tertinggi yaitu 1283,95 ppm sedangkan M13 dan M39 yaitu 5073,75 dan 2534,57 ppm. Isolat kapang M70 diduga berpotensi memproduksi lebih dari satu senyawa bioaktif. Berbeda dengan isolat M13 dan M39 yang mampu menghasilkan senyawa kuinin tinggi tetapi rendah dalam senyawa antioksidan.
Aktivitas antioksidan yang tinggi juga dapat disebabkan oleh nilai pH medium. Isolat kapang yang memiliki pH 7,4-7,8 cenderung memiliki nilai IC
501283,95-2269,67 ppm yaitu pada isolat M70, M36, M89, dan M22. Isolat dengan pH 8,1-8,4 memiliki nilai IC
50yaitu 3281,75-5073,75 ppm pada isolat M13, M39, M65, M78, dan M95 memiliki nilai IC
50lebih tinggi. Hal tersebut disebabkan pengaruh pH pada akhir fermentasi yang menyebabkan perbedaan ketebalan miselium dan aktivitas antioksidan pada setiap isolat kapang endofit Phomopsis spp. Septiana & Simanjuntak (2017) melaporkan aktivitas antioksidan kapang endofit asal akar kunyit pada fermentasi pada pH <7 dan >7 tidak lebih besar dibandingkan dengan kapang endofit yang memiliki pH 7.
Kapang secara umum akan menghasilkan metabolit sekunder pada kisaran
pH normal, dan tidak ditemukan senyawa bioaktif pada pH terlalu ekstrim (Miao
et al., 2006). Hal ini diduga karena terjadinya produksi metabolit yang tertunda
27
yang disebabkan oleh terhambatnya pertumbuhan miselia atau karena produksi metabolit bioaktif yang menurun di kondisi pH >8. Abo-Elmagd, (2014) melaporkan kapang yang pembentukan miselium terhambat akan menghasilkan senyawa bioaktif yang lebih sedikit dibandingkan yang tidak terhambat.
Isolat kapang endofit Phomopsis M70 memiliki nilai IC
50terendah diduga memilki kemampuan menghasilkan senyawa antioksidan sama seperti tanaman kina. Aktivitas antioksidan (IC
50) dari tanaman kina telah dilaporkan pada penelitian sebelumnya yaitu 20-80 ppm pada ekstrak etanol (Al-Mustafa & Al- Thunibat, 2008) dan 8,08 ppm pada ekstrak metanol dan 64,19 ppm pada ekstrak air (Ravishankara et al., 2003). Kemampuan kapang endofit mampu memproduksi senyawa bioaktif lainnya disebabkan adanya alterasi gen antara tumbuhan inang dan kapang endofit (Strobel & Daisy, 2003).
Nilai IC
50kapang endofit Phomopsis M70 dari tanaman kina yang difermentasi 21 hari dan diekstrak dengan etil asetat lebih rendah (1283,95 ppm) dibandingkan dengan beberapa kapang endofit hasil isolasi tanaman lain yang difermentasi lebih sebentar (3-15 hari) dan diekstrak dengan pelarut lain.
Bharatidasan & Paneerselvam (2012) melaporkan Phomopsis amygdali hasil
isolasi tumbuhan mangrove memiliki nilai IC
502030±0,81 ppm yang ekstrak
dengan etanol. Phomopsis spp. hasil isolasi dari lima tanaman obat dari Sudan
dilaporkan memiliki nilai IC
502682±5.17 ppm (Khiralla et al., 2015) dan Praptiwi
et al. (2016) yang melaporkan Phomopsis sp. hasil isolasi tanaman Zingiber
officinale memiliki IC
502031 ppm.
28
Nilai IC
50pada M70 lebih rendah dibandingkan penelitian sebelumnya disebabkan perbedaan jenis pelarut dan waktu fermentasi. Oyi et al. (2007) menyatakan pelarut semi polar seperti etil asetat mampu mengekstrak senyawa polar dan non polar. Pelarut etil asetat diketahui memiliki kemampuan melarutkan senyawa terpenoid, sterol, flavonoid, dan fenol. Merlin et al. (2013) melaporkan masa fermentasi kapang yang diinkubasi kurang dari 10 hari pada umumnya akan menghasilkan pertumbuhan dan produksi metabolit yang lebih sedikit pada endofit Fusarium. Desale & Bodhankar (2013) melaporkan waktu inkubasi fermentasi 21 hari merupakan waktu yang optimum untuk Phomopsis sp.
menghasilkan senyawa metabolit sekunder.
Berdasarkan nilai IC
50, semua ekstrak kapang endofit Phomopsis spp.
tidak aktif sebagai antioksidan karena memiliki nilai IC
50> 500 ppm (Jun et al., 2003). Aktivitas antioksidan berdasarkan nilai IC
50pada semua ekstrak kapang endofit Phomopsis spp. jauh lebih rendah dibandingkan vitamin C yang memiliki IC
503,79 ppm. Vitamin C atau asam arkorbat memliki aktivitas antioksidan tinggi karena senyawa tersebut sudah murni tanpa ada campuran senyawa lain. Berbeda dengan ekstrak kapang endofit Phomopsis spp. yang masih tercampur dengan senyawa lain, sehingga memiliki aktivitas antioksidan yang rendah. Hal ini sesuai dengan yang dilaporkan Pratiwi et al. (2013) bahwa ekstrak etanol daun bawang mekah memiliki nilai IC
50lebih tinggi dari vitamin C karena masih terdiri dari beberapa campuran senyawa dalam ekstrak tersebut.
Vitamin C merupakan bahan yang sering dijadikan sebagai pembanding
aktivitas antioksidan. Vitamin C umum digunakan karena dapat bereaksi dengan
29
senyawa radikal bebas secara in vitro (Isnandar et al., 2016). Vitamin C juga mampu menangkap radikal bebas dengan atau tanpa bantuan katalisator enzim.
Reaksinya lebih cepat dibandingkan komponen cair lainnya terhadap senyawa oksigen reaktif (Winarsih, 2007).
4.4. Kandungan Bioaktif Antioksidan
Kandungan bioaktif yang berpotensi sebagai antioksidan dapat dilihat melalui hasil GC-MS. Ekstrak yang digunakan adalah ekstrak isolat kapang endofit Phomopsis sp. M70. Penggunan ekstrak M70 dipilih karena memiliki aktivitas antioksidan tertinggi (nilai IC
50terendah). Hasil identifikasi kandungan bioaktif pada ekstrak isolat M70 terdapat 11 senyawa pada ekstrak isolat M70.
Senyawa tersebut memiliki kesamaan bobot molekul berkisar 80-93% dengan library spektrofotometri massa Wiley7 dan NIST147 (Tabel 4).
Tabel 4. Hasil identifikasi pada ekstrak kapang endofit Phomopsis M70 No.
Puncak
Waktu Retensi
% Area
Nama Senyawa Kemiripan
(%) 1 10,160 2,19 Succinic acid, monomethyl ester 85
2 18,970 3,82 Benzeneethanol, 4-hydroxy-* 90
3 30,811 13,47 Hexadecanoic acid* 92
4 34,036 2,29 9-Octadecanoic acid* 87
5 34,518 4,56 Octadecanoic acid, 2-(2- hydroxyethoxy) ethyl ester*
91
6 35,230 0,44 Hexadecane, 2,6,10,14-
tetramethyl-
86 7 38,355 2,07 Hexadecanoic acid, 2-hydroxy-1-
(hydroxy methyl) ethyl ester*
93
8 38,600 1,05 Tricosane 89
9 40,240 2,44 1,2-benzenedicarboxylic acid, mono (2-ethylhexyl) ester
80
10 40,525 1,44 n-Pentacosane 92
11 41,710 1,38 Octadecanoic acid, 2-hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethyl ester*
91
*)
Memiliki aktivitas antioksidan30
Terdapat 4 golongan senyawa yaitu, alkohol (benzeneethanol 4-hydroxy), asam karboksilat
(hexadecanoic acid; 9-octadecanoic acid), ester (octadecanoicacid 2-(2-hydroxyethoxy) ethyl ester; hexadecanoic acid 2-hydroxy-1-(hydroxy methyl) ethyl ester; 1,2-benzenedicarboxylic acid mono(2-ethylhexyl) ester;
octadecanoic acid 2-hydroxy-1-(hydroxymethyl) ethyl ester), alkana (hexadecane, 2,6,10,14-tetramethyl; tricosane; n-pentacosane) (PubChem, 2017).
Terdapat 6 dari 11 senyawa diketahui memiliki aktivitas antioksidan yaitu,
benzeneethanol 4-hydroxy,hexadecanoic acid, 9-octadecanoic acid, octadecanoic acid 2-(2-hydroxyethoxy) ethyl ester, hexadecanoic acid 2- hydroxy-1-(hydroxy methyl) ethyl ester, dan octadecanoic acid 2-hydroxy-1- (hydroxymethyl) ethyl ester di dalam ekstrak kapang endofit Phomopsis M70.
Septiawan (2015) melaporkan aktivitas antioksidan pada ekstrak filtrat dan biomassa kapang endofit dari tanaman kina jenis Colletotrichum spp. disebabkan adanya senyawa asam heksadekanoat, asam oktadekanoat, dan fenol.
Senyawa benzeneethanol 4-hydroxy- merupakan senyawa yang diketahui memiliki aktivitas antioksidan karena tergolong kelompok fenolik.
Ashwathanarayana & Naika (2017) melaporkan ekstrak kulit batang dari tanaman obat Olea dioica memiliki aktivitas antioksidan yang kuat yaitu dengan IC
5032,99
± 0,20 ppm karena mengandung senyawa fenol yang tinggi. Kandungan fenol
yang tinggi dilaporkan memiliki keterkaitan dengan tingginya aktivitas
antioksidan pada eksrak kapang endofit Phomopsis sp. dan Xylaria sp. Huang et
al. (2007) melaporkan senyawa fenol berperan dalam kemampuan meredam
radikal bebas dari kapang endofit tanaman Nerium oleander.
31
Pokorny et al. (2007) melaporkan senyawa fenolik punya mekanisme sebagai proper antioxidant, yaitu antioksidan yang menginaktivasi radikal bebas.
Senyawa fenolik memiliki struktur khas yaitu terdapat satu atau lebih gugus hidroksil yang terikat pada cincin aromatik benzen. Senyawa metabolit sekunder yang mengandung fenol seperti asam fenolik, flavonoid, kuinin, dan kumarin telah terbukti memiliki aktivitas antioksidan (Gul et al., 2011).
Hexadecanoic acid merupakan senyawa yang memiliki persen area terbesar dalam ekstrak. Senyawa tersebut memiliki aktivitas antoksidan karena mampu menjaga sel paru-paru tikus percobaan dari kerusakan akibat fibrosis dan senyawa oksigen reaktif lainnya (Sharawy et al., 2013). Aktivitas antikanker pada ekstrak tumbuhan Ficus benghalanensis juga dilaporkan karena adanya senyawa tersebut (Verma et al., 2015).
Senyawa ester dari asam lemak juga diketahui memiliki aktivitas antioksidan. Hexadecanoic acid, 9-octadecanoic acid, dan octadecanoic acid 2- (2-hydroxyethoxy) ethyl ester dari ekstrak metanol daun Cassia italica memiliki aktivitas antioksidan (Uma et al., 2011; Sermakkani & Thangapandia, 2012;
Suryowati et al., 2015). Kandungan asam lemak tak jenuh seperti 9-octadecanoic
acid dan hexadecanoic acid ekstrak biji Anona muricata yang berperan sebagai
antioksidan (Elagbar et al., 2016).
32
BAB V PENUTUP
5.1. Kesimpulan
1. Aktivitas antioksidan dari ekstrak kapang endofit Phomopsis spp. lebih rendah dibandingkan vitamin C.
2. Senyawa yang berperan sebagai antioksidan dalam ekstrak kapang endofit Phomopsis M70 adalah hexadecanoic acid, octadecanoic acid 2-(2- hydroxyethoxy) ethyl ester, benzeneethanol, 4-hydroxy-, 9-octadecanoic acid, hexadecanoic acid 2-hydroxy-1-(hydroxy methyl) ethyl ester dan octadecanoic acid, 2-hydroxy-1-(hydroxymethyl) ethyl ester.
5.2. Saran
Diperlukan penelitian mengenai optimasi (sumber karbon dan nitrogen)
dan jenis pelarut (polar dan non-polar) dalam ekstraksi senyawa antioksidan untuk
mendapatkan aktivitas antioksidan yang lebih optimum pada ekstrak kapang
endofit Phomopsis spp. dari tanaman kina (C. calisaya Wedd.).
33
