KARAKTERISASI ISOLAT Bacillus sp. NTT 3a
DAN Bacillus sp. NTT 3e PENGHASIL AHL-LAKTONASE
RETNO KUSUMANINGRUM
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ABSTRAK
RETNO KUSUMANINGRUM. Karakterisasi Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e Penghasil AHL-Laktonase. Dibimbing oleh IMAN RUSMANA dan ALINA AKHDIYA.
Quorum sensing (QS) merupakan mekanisme komunikasi bakteri yang bergantung pada
jumlah populasi bakteri dan diperantarai oleh molekul autoinduser (AI). Molekul AI pada bakteri Gram negatif umumnya berupa molekul Acyl Homoserine Lactone (AHL). Enzim Acyl
Homoserine Lactone Lactonase (AHL-laktonase) yang disandikan oleh gen aiiA merupakan salah
satu enzim yang dapat menghidrolisis cincin lakton sehingga menghambat proses QS. Penelitian ini bertujuan untuk mengkarakterisasi Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e penghasil
AHL-Laktonase. Karakterisasi dilakukan berdasarkan morfologi koloni, karakteristik
pertumbuhanan pada media NB (kurva tumbuh, laju pertumbuhan spesifik, dan waktu generasi), dan aktivitas enzim AHL-laktonasenya. Aktivitas AHL-laktonase diamati menggunakan bioindikator Chromobacterium violaceum.
Koloni Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e berbentuk bulat, elevasi cembung, dan tepian licin. Warna koloni Bacillus sp. NTT 3a putih, sedangkan Bacillus sp. NTT 3e berwarna krem. Laju pertumbuhan spesifik kedua bakteri tersebut berturut-turut adalah 0,005 menit-1 dan 0,0042 menit-1. Aktivitas AHL-laktonase dalam kedua kultur bakteri tertinggi tercapai pada umur 42 jam (fase stasioner). Pada umur 48 jam, kadar total protein dalam supernatan kultur
Bacillus sp. NTT 3a (0,539 mg/ml) lebih rendah dibandingkan dengan Bacillus sp. NTT 3e (0,578
mg/ml). Walaupun demikian, aktivitas AHL-laktonase Bacillus sp. NTT 3a lebih tinggi dari
Bacillus sp. NTT 3e.
Kata kunci: quorum sensing, autoinduser, Anti-quorum sensing, AHL-laktonase
ABSTRACT
RETNO KUSUMANINGRUM. Characterization of Bacillus sp. NTT 3a and Bacillus sp. NTT 3e Isolates Producing AHL-Lactonase. Under supervision of IMAN RUSMANA and ALINA AKHDIYA.
Quorum sensing (QS) is a bacterial communication mechanism controled by bacterial population and mediated by autoinducer (AI) molecule. AI molecule of Gram-negative bacteria generally is Acyl Homoserine Lactone (AHL). Acyl Homoserine Lactone Lactonase (AHL-lactonase) enzyme encoded by aiiA gene is an enzyme that can hydrolyze the lactone ring so that inhibiting QS process. This study aimed to characterize the AHL-Lactonase producing bacteria i.e.
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e. the characterization is based on colony morphology,
characteristics of growth in NB medium (growth curve, specific growth rate and generation time), and activity of AHL-lactonase. AHL-lactonase activity was observed using bioindicator
Chromobacterium violaceum.
Colonies of Bacillus sp. NTT 3a and Bacillus sp. NTT 3e are round, have a convex elevation and slippery ledges. The colony color of Bacillus sp. NTT 3a is white, while Bacillus sp. NTT 3e is beige. The maximum specific growth rate of Bacillus sp. NTT 3a and Bacillus sp. NTT 3e was 0,005 minute-1 and 0,0042 minute-1 respectively. The highest activity of AHL-lactonase in both of bacterial culture reached the age of 42 hours (stationary phase). Protein content of Bacillus sp. NTT 3a (0,539 mg/ml) lower than Bacillus sp. NTT 3e (0,578 mg/ml) at the 48 hours. However, the activity of AHL-lactonase in Bacillus sp. NTT 3a is higher than Bacillus sp. NTT 3e
KARAKTERISASI ISOLAT Bacillus sp. NTT 3a
DAN Bacillus sp. NTT 3e PENGHASIL AHL-LAKTONASE
RETNO KUSUMANINGRUM
Skripsi
Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
Judul :
Karakterisasi Bakteri Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT
3e.
Nama :
Retno Kusumaningrum
NIM :
G34080047
Menyetujui,
Pembimbing I
Pembimbing II
Dr. Ir. Iman Rusmana, M.Si
Alina Akhdiya, M.Si
NIP 196507201991031002
NIP 196812082001122001
Mengetahui,
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
Institut Pertanian Bogor
Dr. Ir. Ence Darmo Jaya Supena, M.S
NIP 196410021989031002
PRAKATA
Alhamdulillahirobbil’alamin, puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas rahmat dan karunia-Nya sehingga penelitian ini dapat diselesaikan. Judul penelitian ini adalah “Karakterisasi Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e Penghasil AHL-laktonase”. Penelitian ini dilaksanakan sejak bulan Januari hingga Juli 2012.
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr.Ir. Iman Rusmana, M.Si dan Ibu Alina Akhdiya, M.Si selaku pembimbing yang telah memberikan arahan dan bimbingan selama penelitian dan penulisan skripsi ini. Terima kasih kepada Ibu Dra. Hilda Akmal, M.Si selaku penguji yang telah memberikan saran dan masukan sehingga tulisan ini menjadi lebih baik. Terima kasih kepada Ibu Heni dan Pak Jaka selaku laboran di laboratorium Mikrobiologi IPB atas segala bantuan dan saran selama melakukan penelitian ini. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Bapak, Ibu, Kakak, dan seluruh keluarga atas doa, motivasi dan kasih sayang yang diberikan. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Jaka Ahmad J, Nono, Ginna, Iky, Kebon, Ayang, teman-teman IR-crew, dan teman-teman seperjuangan di Biologi 45 atas kebersamaan dan segala motivasi yang telah diberikan.
Penulis berharap semoga karya tulis ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Bogor, Oktober 2012
RIWAYAT HIDUP
Retno Kusumaningrum, dilahirkan di Bekasi pada tanggal 26 Maret 1991 dari ayah bernama Baron Sumarto dan ibu Ch. Nunik Dwi Sumarmi. Penulis merupakan anak kedua dari dua bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari SMA Negeri 1 Bekasi, dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI) pada Departemen Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif menjadi anggota Divisi Biologi World (Bioworld) Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio), dan menjadi sekretaris acara Biologi On
Xperiment (BOX). Penulis juga menjadi asisten praktikum mata kuliah Biologi Tingkat Persiapan
Bersama tahun ajaran 2011/2012.
Penulis melakukan studi lapangan di kawasan Taman Wisata Alam Pangandaran dengan judul makalah “Habitat Raflesia patma di Cagar Alam Wisata Pananjung Pangandaran”. Penulis juga melakukan Praktik Lapangan di PT. Astaguna Wisesa (MORIN) di Cikarang dari bulan Juli sampai Agustus tahun 2011, dengan judul makalah “Proses Produksi dan Kontrol Kualitas Mikrobiologi Selai Buah Bluberi Kemasan Botol di PT. Astaguna Wisesa Cikarang”.
DAFTAR ISI
halaman
DAFTAR TABEL ...viii
DAFTAR GAMBAR ...viii
DAFTAR LAMPIRAN ...viii
PENDAHULUAN... 1
Latar Belakang ... 1
Tujuan ... 1
METODE ... 1
Waktu dan Tempat Penelitian ... 1
Pemurnian dan Peremajaan Isolat ... 1
Verifikasi produksi AHL-laktonase ... 1
Penentuan Kadar Protein ... 2
Pembuatan Kurva Tumbuh ... 2
Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik ... 2
Pengukuran Aktivitas Isolat Bakteri ... 2
HASIL ... 2
Pemurnian dan Peremajaan Isolat ... 2
Verifikasi Aktivitas AHL-laktonase ... 3
Kadar Protein Supernatan Kultur Bakteri ... 3
Kurva Pertumbuhan Bakteri ... 3
Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum (μm) Isolat ... 3
Aktivitas AHL-laktonase ... 3
PEMBAHASAN ... 4
SIMPULAN ... 5
DAFTAR PUSTAKA ... 5
DAFTAR TABEL
halaman
1. Morfologi koloni isolat bakteri Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e pada media NA. . 2
2. Kadar protein supernatan Kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e umur 24 jam .... 3
3. Pertumbuhan spesifik maksimum (µm) dan waktu generasi Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e ... 3
4. Hasil Uji Aktivitas AHL-laktonase dalam supernatan kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e menggunakan bioindikator C. violaceum ... 4
DAFTAR GAMBAR
halaman 1. Penampakan warna koloni Bacillus sp. NTT 3a... 22. Penampakan warna koloni Bacillus sp. NTT 3e... 2
3. Verifikasi aktivitas AHL-laktonase isolat Bacillus sp. NTT 3a ... 3
4. Verifikasi aktivitas AHL-laktonase isolat Bacillus sp. NTT 3e ... 3
5. Kurva pertumbuhan kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e ... 3
6. Zona degradasi violacein yang dihasilkan Bacillus sp. NTT 3a selama 24 jam pengamatan ... 4
7. Zona degradasi violacein yang dihasilkan Bacillus sp. NTT 3e selama 24 jam pengamatan ... 4
DAFTAR LAMPIRAN
halaman 1. Komposisi Media Pertumbuhan yang Digunakan ... 82. Kurva Standard Bradford ... 9
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Quorum sensing (QS) merupakan suatu
mekanisme komunikasi bakteri dengan
perantara molekul sinyal yang disebut
autoinduser. Pada proses QS, autoinduser (AI)
disekresikan, kemudian diakumulasi di
lingkungan, selanjutnya diserap kembali ke dalam sel dan dikenali oleh bakteri pada saat proses QS terjadi (Rukayadi & Hwang 2009).
Sistem QS mampu mengkoordinasikan
perilaku populasi bakteri seperti pembentukan biofilm, faktor virulensi, bioluminescence, dan produksi antibiotik (Romero et al. 2008).
N-Acyl Homoserine Lactone (AHL) adalah
AI pada bakteri Gram negatif, yang berperan penting dalam menginduksi ekspresi gen virulensi pada beberapa spesies bakteri
patogen tanaman diantaranya Erwinia
carotovora penyebab enyakit busuk lunak
(Dong et al. 2000). Kenyataan ini mem- bangkitkan pemikiran bahwa virulensi bakteri patogen dapat dinonaktifkan melalui inaktivasi sistem QS (Zhu & Sun 2008).
Salah satu prinsip dari pengendalian bakteri patogen dengan dasar QS adalah dengan mencegah akumulasi sinyal AHL sehingga gen-gen yang terlibat pada proses virulensinya tidak dapat diekspesikan. Akumulasi sinyal AHL dapat dicegah dengan mendegradasi molekul sinyal tersebut. Senyawa atau molekul yang dapat mencegah proses QS disebut sebagai anti-QS (Yin et al. 2010). Senyawa anti-QS merupakan salah satu alternatif pengendalian penyakit dengan cara memblok atau mengacau proses QS. Kelebihan Anti-QS dalam mengontrol infeksi bakteri yaitu tidak mempengaruhi pertumbuhan bakteri patogen -nya, sehingga dapat menghindari timbulnya tekanan seleksi yang sering menghasilkan generasi patogen yang lebih resisten terhadap antibiotik (White & Finan 2009).
AHL-Laktonase merupakan enzim anti-QS yang termasuk ke dalam senyawa degradator (Rukayadi & Hwang 2009). AHL-Laktonase
merusak sistem QS melalui hidrolisis
enzimatis cincin lakton pada molekul AHL sehingga tidak terjadi ekspresi gen-gen penyandi patogenitas. Gen Aiia merupakan salah satu gen penyandi AHL-Laktonase dan pertama kali ditemukan pada Bacillus sp. strain 240B1 (Dong et al. 2000).
Kemampuan suatu bakteri dalam
menghasilkan AHL-Laktonase dapat diuji antara lain dengan menggunakan biosensor
Chromobacterium violaceum. C. violaceum
dapat menghasilkan pigmen violacein
berwarna ungu yang disandikan oleh gen Vio (August et al. 2000).
AHL-laktonase merupakan salah satu senyawa anti-QS yang dapat digunakan sebagai alternatif dalam pengendalian bakteri fitopatogen yang ramah lingkungan dan tidak memicu resistensi. Pada penelitian sebelumnya dua bakteri (NTT 3a dan NTT 3e) penghasil enzim ini telah diisolasi dari lahan pertanian. Karakterisasi molekuler menunjukkan isolat NTT 3a dan NTT 3e memiliki gen yang homolog dengan gen aiiA pada Bacillus sp. 91. Gen 16S rRNA isolat NTT 3a mirip dengan
Bacillus sp. AF-777 dengan nilai identitas
99%, sedangkan isolat NTT 3e mirip dengan
Bacillus sp. NIOT-3 dengan nilai identitas
97% (Fitriyah 2011). Tujuan
Penelitian ini bertujuan untuk meng-karakterisasi pertumbuhan isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e serta aktivitas AHL-Laktonase yang dihasilkannya.
METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Januari sampai dengan Juli 2012, bertempat di
Laboratorium Mikrobiologi Departemen
Biologi FMIPA IPB.
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Kultur isolat bakteri NTT 3a dan NTT 3e
(Fitriyah 2011) diremajakan dengan
menggunakan metode gores kuadran pada media Nutrient Agar (Lampiran 1).
Verifikasi produksi AHL-Laktonase
Sebanyak dua lup kultur murni bakteri diinokulasi ke dalam 50 ml media Nutrient
Broth (NB) (Lampiran 1). Setelah diinkubasi
selama 24 jam di atas shaker (100 rpm pada suhu ruang), kultur disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm. Sebanyak 100 μL supernatan diteteskan pada paper disc yang diletakkan pada permukaan media cawan
Luria Agar semi padat (Lampiran 1) yang telah
diinokulasi dengan Chromobacterium
violaceum (1%). Cawan tersebut kemudian
diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam (Choo et al. 2006). Paper disk yang dikelilingi oleh zona tidak berwarna ungu menunjukkan adanya aktivitas degradasi AHL oleh enzim AHL-laktonase.
2
Tabel 1 Morfologi koloni isolat bakteri Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e pada media NA
Penentuan Kadar Protein
Kadar protein ditentukan dengan teknik
spektrofotometri menggunakan Commasie
Brilliant Blue G-250 sebagai pewarna. Sebagai
standar pengukuran protein digunakan larutan Bovine Serum Albumin (BSA). Campuran reaksi diukur absorbannya menggunakan
spektrofotometer (Spectronic 100) pada
panjang gelombang 595 nm (Bradford 1976). Sampel supernatan diambil dari kultur bakteri berumur 48 jam.
Pembuatan Kurva Tumbuh
Biakan induk disiapkan dengan cara menginokulasikan satu lup biakan bakteri ke dalam 50 ml media NB lalu diinkubasi selama 24 jam di atas shaker. Kemudian ke dalam 200 ml NB dimasukkan 10% biakan induk yang telah tersedia. Inkubasi dilakukan di atas
shaker (100 rpm) pada suhu ruang. Setiap 6
jam selama 60 jam dilakukan pengukuran kekeruhan sel pada panjang gelombang 620 nm dengan dua kali ulangan (duplo).
Penentuan Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum (μm) Isolat
Laju pertumbuhan spesifik maksimum bakteri (μm) diukur dari fase logaritmik bakteri terhadap waktu inkubasinya. Kemudian dibuat grafik antara ln OD sel bakteri sebagai sumbu y dan waktu inkubasi sebagai sumbu x. Nilai kemiringan (slope) pada persamaan regresi
garis pada fase log merupakan laju
pertumbuhan spesifik bakteri.
Pengukuran Aktivitas AHL-Laktonase Isolat Bakteri
Sebanyak 2 ml kultur biakan disentrifugasi pada 10.000 rpm selama 10 menit untuk diambil supernatannya. Sebanyak 100 µl supernatan diteteskan perlahan ke dalam paper
disc, kemudian paper disc diletakkan di atas
media LA semi padat yang telah
diinokulasikan dengan 1% kultur
Chromobacterium violaceum, lalu diinkubasi
selama 24 jam. Pengukuran dilakukan setiap 6 jam selama 60 jam.
HASIL
Pemurnian dan Peremajaan Isolat
Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e berhasil dimurnikan dan diremajakan pada media NA. Kedua isolat menunjukkan perbedaan warna koloni pada media NA. Isolat
Bacillus sp. NTT 3a berwarna putih (Gambar
1), sedangkan Bacillus sp. NTT 3e berwarna krem (Gambar 2). Warna koloni kedua isolat menjadi kekuningan setelah tujuh hari. Ciri dan morfologi kedua isolat ditampilkan pada tabel dibawah ini.
Isolat
Morfologi koloni pada umur 24 jam
Diameter koloni (mm)
Warna Bentuk Elevasi Tepian
Bacillus NTT 3a Putih Bundar Cembung Licin 6
Bacillus NTT 3e Krem Bundar Cembung Licin 4
Gambar 2 Penampakan warna koloni Bacillus sp. NTT 3e. Gambar 1 Penampakan warna koloni Bacillus sp. NTT 3a.
3
Verifikasi Aktivitas AHL-Laktonase
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT
3e menunjukkan adanya zona tidak ungu di sekeliling paper disc (Gambar 3 & 4). Zona tidak ungu ini menunjukkan aktivitas enzim AHL-laktonase.
Kadar Protein Supernatan Kultur Bakteri Absorbansi supernatan kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e berturut-turut adalah 0,2735 dan 0,316. Setelah dimasukkan ke dalam persamaan regresi kurva standar protein BSA (Lampiran 2), maka rata-rata kadar protein dari Bacillus sp. NTT 3a dan
Bacillus sp. NTT 3e adalah 0,539 mg/ml dan
0,578 mg/ml (Tabel 2).
Tabel 2 Kadar protein supernatan kultur
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e
pada umur 24 jam
Kurva Pertumbuhan Bakteri
Pengukuran kekeruhan kultur Bacillus sp. NTT 3e selama inkubasi menunjukkan pertumbuhan yang lambat pada 6 jam pertama. Berbeda dengan Bacillus sp. NTT 3e, kultur
Bacillus NTT 3a menunjukkan pertumbuhan
yang cepat di awal pertumbuhannya. Kedua kultur bakteri menunjukkan fase pertumbuhan eksponensial sampai umur 18 jam inkubasi. Selanjutnya kedua kultur mengalami fase stasioner sampai umur 54 jam (Gambar 5).
Laju Pertumbuhan Spesifik Maksimum (µm) Isolat
Berdasarkan persamaan yang diperoleh (lampiran 3), isolat Bacillus sp. NTT 3a memiliki laju pertumbuhan spesifik (µm) sebesar 0,005 menit-1, sedangkan Bacillus sp. NTT 3e sebesar 0,0042 menit-1 (Tabel 3). Tabel 3 Pertumbuhan spesifik maksimum (µm) dan waktu generasi Bacillus sp. NTT 3a dan
Bacillus sp. NTT 3e
Aktivitas AHL-Laktonase
Hasil pengukuran aktivitas AHL-laktonase yang berhasil diamati yaitu pada jam 0, ke-6, ke-12, dan ke-42. Kedua isolat menunjukkan adanya aktivitas AHL-laktonase pada jam ke-6. Dilihat dari diameter zona tidak ungu yang dihasilkan, dapat diketahui bahwa aktivitas degradasi AHL pada isolat Bacillus sp. NTT 3a lebih tinggi dari isolat Bacillus sp. NTT 3e.
Isolat µmax (menit -1) Waktu generasi (menit) NTT 3a 0,005 138 NTT 3e 0,0042 164
Isolat Kadar Protein
(mg/ml)
NTT 3a 0,539
NTT 3e 0,578
Gambar 3 Verifikasi aktivitas AHL-laktonase isolat Bacillus sp. NTT 3a.
Gambar 4 Verifikasi aktivitas AHL-laktonase isolat Bacillus sp. NTT 3e.
Gambar 5 Kurva pertumbuhan kultur Bacillus sp. NTT 3a ( ) dan Bacillus sp. NTT 3e ( ) pada media NB. Paper disc Paper disc Zona degradasi AHL Zona degradasi AHL 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 0 6 12 18 24 30 36 42 48 54 60 66 O D
4
Tabel 4 Hasil uji aktivitas AHL-laktonase dalam supernatan kultur Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e menggunakan bioindikator C. violaceum
Ket: dz = diameter zona tidak berwarna ungu
dp= diameter paper disc
PEMBAHASAN
Verifikasi produksi AHL-laktonase oleh kedua bakteri menggunakan bioindikator
Chromobacterium violaceum menunjukkan
terbentuknya zona tidak ungu disekeliling
paper disc pada cawan uji. Difusi
AHL-laktonase yang terkandung dalam supernatan kultur dari paper disc ke media disekitarnya menyebabkan degradasi senyawa AI yang diekskresikan oleh C. violaceum. Degradasi senyawa AI tersebut menyebabkan sel-sel C.
violaceum yang tumbuh di sekitar paper disc
tidak dapat berkomunikasi sehingga tidak
memproduksi pigmen violacein.
AHL-laktonase secara spesifik menghidrolisis cincin lakton pada molekul L-homoserine lacton. Aktivitas enzim ini stabil pada suhu di bawah 37o tetapi tidak stabil pada suhu yang tinggi (Wang et al. 2004).
Hasil pengamatan terhadap pertumbuhan
Bacillus sp. NTT 3e pada media NB (Gambar
5) menunjukkan adanya fase lag pada awal pertumbuhan (6 jam pertama). Fase lag adalah fase adaptasi bakteri dimana tidak ada pertambahan nyata pada populasi sel, namun sel mengalami pertambahan massa, dan komposisi kimiawi, serta peningkatan aktivitas metabolisme (Dias 2003). Fase lag tidak teramati pada kultur Bacillus sp. NTT 3a. Hal ini mengindikasikan bahwa bakteri tersebut mampu beradaptasi dengan cepat. Fase eksponensial kedua kultur bakteri berlangsung sampai umur 18 jam, dan selanjutnya masuk ke fase stasioner sampai umur 54 jam. Gambar
5 menunjukkan bahwa sepanjang
per-tumbuhannya, nilai OD kultur Bacillus sp. Umur contoh supernatan kultur (jam) dz-dp (mm) Bacillus sp. NTT 3a 0 6 12 42 0 1 2 3 Bacillus sp. NTT 3e 0 6 12 42 0 0,5 1 2
Gambar 6 Zona degradasi autoinduser yang dihasilkan Bacillus sp. NTT 3a selama 42 jam pengamatan. 0 jam 6 jam 6 jam 12 jam 12 jam 42 jam 42 jam
Gambar 7 Zona degradasi autoinduser yang dihasilkan Bacillus sp. NTT 3e selama 42 jam pengamatan.
5
NTT 3e lebih rendah dari OD kultur Bacillus sp. NTT 3a. Tingginya nilai OD kultur
Bacillus sp. NTT 3a menunjukkan tingkat
pertumbuhan yang lebih cepat dibandingkan dengan kultur Bacillus sp. NTT 3e. Hal ini
sesuai dengan hasil penghitungan laju
pertumbuhan spesifik dan waktu generasi kedua bakteri tersebut (Tabel 3).
Laju pertumbuhan spesifik maksimum (µm) isolat Bacillus sp. NTT 3a adalah 0,005 menit-1 sedangkan pada Bacillus sp. NTT 3e 0,0042 menit-1 dengan waktu generasi berturut-turut adalah 138 menit dan 164 menit. Laju pertumbuhan spesifik merupakan salah satu parameter dari kinetika pertumbuhan bakteri yang menunjukkan kecepatan maksimum
bakteri untuk membelah. Laju pertumbuhan
spesifik (µ) ini dipengaruhi oleh jenis dan konsentrasi substrat yang digunakan. Laju pertumbuhan spesifik akan menurun pada konsentrasi substrat yang tinggi karena sel bakteri telah mengalami kejenuhan dalam memanfaatkan substrat yang ada (Lehninger 1982). Pertumbuhan bakteri diindikasikan dengan peningkatan teratur jumlah sel, baik ukuran, berat, maupun volume sel tunggal atau koloni. Hal ini tergantung pada kemampuan sel membentuk protoplasma baru dari nutrien yang dapat digunakan di lingkungannya (Dias 2003). Suatu populasi dengan µm yang lebih tinggi akan tumbuh lebih cepat dibandingkan suatu populasi dengan µm yang rendah. Waktu generasi dan µm secara umum berbanding terbalik pada kisaran spesies yang sangat luas (Campbell et al. 2004).
Berdasarkan pengukuran yang dilakukan, kadar protein pada supernatan kultur Bacillus sp. NTT 3e lebih tinggi dari Bacillus sp. NTT 3a dengan selisih 0,039 mg/ml. Namun aktivitas degradasi autoinduser oleh enzim yang terkandung dalam supernatan kultur NTT 3a lebih tinggi walaupun kadar protein totalnya lebih rendah dari supernatan kultur NTT 3e. Hal ini diduga disebabkan oleh aktivitas spesifik AHL-laktonase pada kultur Bacillus sp. NTT 3a lebih tinggi dibandingkan dengan AHL-laktonase pada kultur NTT 3e. Selain itu, tingginya kadar protein total pada supernatan kultur NTT3e diduga disebabkan oleh berbagai protein selain AHL-laktonase yang diekskresi-kan ke dalam kultur.
Aktivitas enzim AHL-laktonase menunjuk-kan peningkatan seiring dengan bertambahnya populasi sel dalam kultur. Zona tidak ungu yang terbentuk sebagai hasil aktivitas AHL-laktonase mulai terdeteksi pada sampel supernatan kultur yang diambil pada fase log. Aktivitas AHL-laktonase tertinggi tampak
pada hasil pengujian sampel yang diambil pada fase stasioner yaitu pada umur 42 jam. Hai ini menunjukkan bahwa semakin tinggi populasi bakteri dalam kultur, semakin tinggi akumulasi AHL-laktonase yang diproduksinya sehingga semakin luas juga zona tidak ungu yang terbentuk. Aktivitas AHL-laktonase Bacillus sp. NTT 3a lebih tinggi dari Bacillus sp. NTT 3e (Gambar 5 dan 6).
SIMPULAN
Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT
3e mampu memproduksi enzim
AHL-laktonase. AHL-laktonase yang dihasilkan dari
kedua isolat dapat mendegradasi AHL
sehingga menghambat produksi violacein. Produksi AHL-laktonase kedua isolat tertinggi pada fase stasioner. Laju pertumbuhan NTT 3a lebih baik dari pada Bacillus sp. NTT 3e, begitu pula dalam pengukuran aktivitas AHL-laktonasenya.
DAFTAR PUSTAKA
August PR et al. 2000. Sequence analysis and
functional characterization of the
violacein biosynthetic pathway from
Chromobacterium violaceum. J Mol Microbiol Biotechnol 2: 513-519.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive
method for the quantitation of
microgram quantities of protein
utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72 : 248-254. Campbell NA, Reece JB, Mitchell LG. 2004.
Biologi. Ed ke-5. Wasmen Manalu,
penerjemah; A Safitri, editor. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Biology. Choo JH, Rukayadi Y, Hwang JK. 2006.
Inhibition of bacterial QS by vanilla extract. Lett Appl Microbiol 42:637– 641.
Dias LP. 2003. Karakteristik Morfologi dan Kurva Pertumbuhan Bacillus brevis dan
Bacillus apiarus [skripsi]. Bogor. Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor.
Dong YH, Xu JL, Li XC, Zang LH. 2000. aiiA, a novel enzyme inactivates
acyl-homoserine-lactone quorum-sensing
signal and attenuates the virulence of
Erwinia carotovora. Proc Natl Acad Sci
97: 3526-3531.
Fitriyah A. 2011. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Penghasil AHL-Laktonase Asal
6
Lahan Pertanian Luar Pulau Jawa [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
Lehninger AL. 1982. Principles of
Biochemistry. New York: Worth Publishers.
Romero M, Diggle SP, Heeb S, Camara M, Otero A. 2008. Quorum quenching activity in Anabaena sp. PCC7120: identification of AiiC, a novel AHL-acylase. FEMS Microbiol 280: 73-80. Rukayadi Y, Hwang JK. 2009. Pencegahan
quorum sensing: suatu pendekatan baru
dalam mengatasi infeksi bakteri.
Medicinus 22: 22-27.
Wang LH, Weng LX, Dong YH, Zhang LH. 2004. Specifity and enzym kinetics of
the quorum-quenching N-Acyl
Homoserine Lactone Lactonase
(AHL-lactonase). J Biol Chem. 279: 13645-13651.
White CE, Finan TM. 2009. Quorum sensing in Agrobacterium tumefaciens: chance or necessity?. J Bacteriol 191: 1123-1125.
Yin XT et al. 2010. Isolation and
characterization of an AHL-lactonase gene from Bacillus amyloliquefaciens.
World J Microbial Biotechnol 26:1361
– 1367.
Zhu H, Sun SJ. 2008. Inhibition of Bacterial Quorum Sensing-Regulated Behaviors by Tremella fuciformis Extract. Curr
LAMPIRAN
8
Lampiran 1. Komposisi media pertumbuhan yang digunakan A. Media Nutrien Agar (NA)
- 0.8 g nutrient broth - 1,5 g agar
- 100 ml akuades B. Media Nutrien Broth (NB)
- 0,8 g nutrient broth - 100 ml akuades C. Media Luria Agar (LA)
- 1 g Trypton - 1 g NaCL - 0,5 g yeast extract - 0,1 g CaCO3 - 1,5 g agar - 100 ml akuades
D. Media Luria Agar (LA) semi padat - 1 g Trypton - 1 g NaCL - 0,5 g yeast extract - 0,1 g CaCO3 - 1g agar - 100 ml akuades E. Media Luria Broth (LB)
- 1 g Trypton - 1 g NaCL
- 0,5 g yeast extract - 100 ml akuades
9
Lampiran 2. Kurva Standard Bradford
Lampiran 3. Kurva Pertumbuhan Spesifik Isolat Bacillus sp. NTT 3a dan Bacillus sp. NTT 3e. A. Bacillus sp. NTT 3a B. Bacillus sp. NTT 3e y = 0,931x + 0,2836 R² = 0,9603 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0 0,1 0,2 0,3 0,4 a bs o rba n konsentrasi absorban Linear (absorban) y = 0,005x - 4,8873 R² = 0,735 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 1 0 500 1000 1500 ln OD menit ln 3a Linear (ln 3a) y = 0,0042x - 4,8759 R² = 0,9228 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0 0 500 1000 1500 ln OD menit ln 3e Linear (ln 3e)
