Diagnosis Molekuler & Terapi Gen

(1)

Diagnosis Molekuler &

Terapi Gen

Purnomo Soeharso

Departeme Biologi Medik FKU

Departeme Biologi Medik FKUI

I

(2)

Diagnosis

Diagnosis Molekuler Molekuler ::

Menggunakan teknik biologi molekuler untuk Menggunakan teknik biologi molekuler untuk

mendapatkan informasi tentang etiologi penyakit, mendapatkan informasi tentang etiologi penyakit, mengidentifikasi kerentanan individu untuk

mengidentifikasi kerentanan individu untuk mendapat penyakit tertentu dan menentukan mendapat penyakit tertentu dan menentukan diagnosis/ prognosis

diagnosis/ prognosis penyakit berdasarkan analisis DNApenyakit berdasarkan analisis DNA atau hasil ekspresinya.

(3)

Prinsip Kera :

! mendeteksi kelainan/penyimpangan atau status patologi individu "pasien#.

! menggunakan sampel DNA atau hasil ekspresinya "$NA % protein# untuk mendapatkan informasi dan menegakkan diagnosis.

! menggunakan hasil ui/deteksi molekuler tersebut untuk

diagnosis, klasifikasi, prognosis dan memantau respon terapi /peralanan penyakit.

(4)

Keutamaan "pentingnya# diagnosis molekuler : ! informasi biologi molekuler "DNA dan hasil

ekspresinya# menelaskan berbagai aspek medik atau klinik penyakit, kelainan atau penyimpangan. ! penemuan!penemuan terbaru teknik biologi

molekuler memungkinkan pengertian/interpretasi yang mendalam tentang penyakit dan kelainan pada tingkat molekul.

! pengertian/interpretasi yang mendalam tentang

penyakit dan kelainan diimplementasikan untuk ui diagnostik, terapi, pemulihan dan pen&egahan

(5)

'uuan :

! mendapatkan konsep esensial "penting# yang

bermanfaat untuk identifikasi marka "penanda# molekuler penyakit.

! mengaplikasikan "menerapkan# ui molekuler untuk

memantau penyakit, menentukan strategi penanganan /pengelolaan penyakit dan mengantisipasi akibat /hasil penanganan suatu penyakit.

(6)

(earah perkembangan biologi molekuler % implikasinya pada diagnosis molekuler

6

)*+ -regor Mendel, a of 0eredity

)*++ 1ohann Mies&her, Purifi&ation of DNA )23

)245 $e&ombinant DNA 'e&hnology )244 DNA se6uen&ing

)2* In Vitro Amplifi&ation of DNA "P7$# 855) 'he 0uman -enome Proe&t

9atson and 7ri&k, (tru&ture of DNA (i&kle 7ell Anemia Mutation

(7)

Metodologi

angkah!langkah yang diambil dalam diagnosis molekuler :

). isolasi /ekstraksi DNA genom atau $NA dari sel 8. identifikasi DNA atau hasil ekspresinya "$NA %

protein# : P7$, hibridisasi blot (outhern, Northern, 9estern

3. karakterisasi gen : sikuensing, $;P, gene &loning, dll.

. analisa kualitatif : patologi, mutasi, polimorfisme, dll analisa kuantitatif : konsentrasi DNA/$NA/protein . kesimpulan

(8)

Diagnosis penyakit : infeksi :

! mendeteksi DNA/$NA bakteri, virus atau parasit ! mengidentifikasi genotip bakteri/virus/parasit

! mendeterminasi mutasi bakteri/virus/parasit

! mengui resistensi bakteri/virus/parasit terhadap antibiotik

degeneratif

! mengidentifikasi gen kausatif

! mendeterminasi mutasi atau polimorfisme gen tsb ! menganalisa hambatan atau malfungsi gen tsb

(9)

Keganasan

! mengidentifikasi marka "penanda# keganasan ! onkogen, virus, gen spesifik

! mendeterminasi perubahan < mutasi, delesi, translokasi gen marka keganasan

! mengui suseptibilitas individu terhadap keganasan ! genetika dan silsilah keluarga

(10)

Kelainan atau penyimpangan : genetika

! mengidentifikasi gen kausatif atau marka ! mendeterminasi perubahan gen kausatif ! mendeterminasi genotip individu ybs

! menganalisa pedigree "silsilah keluarga# ybs malformasi kongenital

! mengidentifikasi gen kausatif atau marka ! mendeterminasi perubahan gen kausatif

(11)

7ontoh :

Diagnosis penyakit infeksi < hepatitis =

0epatitis = disebabkan oleh infeksi virus hepatitis = ">0=#, menyebabkan infeksi akut dan/atau khronik.

?nfeksi akut ditandai dengan viremia dan kerusakan hati, sedangkan infeksi khronik ditandai viremia menetap

dengan titer bervariasi, asimptomatik dan kambuh pada aktu8 tertentu.

Diagnosis ditegakkan dengan mendeteksi DNA >0= dalam serum dengan P7$ se&ara kualitatif dan kuantitatif,

(12)

Diagnosis penyakit keganasan "kanker# < karsinoma nasofaring "KN;#

Karsinoma nasofaring "KN;# adalah keganasan yang konsisten dengan infeksi virus @pstein =arr "@=>#. Pada epitel nasofaring replikasi @=> ditandai dengan ekspresi gen litik virus immediate early =$;) dan

=;). Kedua gen ini berfungsi menginduksi fase litik tahap early dan late. @Bpresi gen litik "=$;) dan

=;)# se&ara spesifik ditemukan pada aringan tumor primer penderita KN;. Deteksi m$NA gen litik @=>

padaaringan tumor KN; men&erminkan patogenesis KN;. Pengukuran m$NA gen litik @=> se&ara

kuantitatif dari biopsi tumor dapat memberi informasi tentang progresifitas KN;.

(13)

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 ← 142 bp ← 157 bp "a# @kspresi m$NA MP) "positivitas 2),3 C#

"b# @kspresi m$NA =$;) "positivitas +,8 C#

Hasil RT-PCR LMP1 & BRLF1

(14)

2,,,-Diagnosis penyakit degeneratif infertilitas pria

(alah satu penyebab infertilitas pria adalah inefektifitas hormon gonadotropin ;(0 dan testosteron pada sel target yaitu sel sertoli dan sel!sel germinal dalam tubulus

seminiferus.

?nefektifitas dapat disebabkan karena ketidak sempurnaan reseptor hormon tersebut pada sel target karena mutasi

atau variasi alotip yang menyebabkan afinitas hormon terhadap reseptornya menurun.

Diagnosis ditegakkan dengan identifikasi reseptor ;(0 dan androgen dengan P7$ dilanutkan dengan deteksi mutasi dengan sikuensing DNA dan determinasi genotip/alotip gen reseptor ;(0 dan androgen dengan $;P.

(15)

.asil Penelitian

Gambar 1. Hasil PCR ge resep!"r F#H $ag melip%!i "'" ()7 'a 6*) e+" 1).

(16)

Gam*ar 2a/ .asil 00P gen reseptor %0. ang meliputi ko)on 3,7 eon 1,/ eterangan  1  "T+ 2  TT+ 3  "T+ 4  ""+ 5  TT+ 6  "T+ 7  "T+ 8  TT+ 9  TT + 1,  TT ( "  alanin T  treonin

(17)

-Gam*ar 2*/ .asil 00P gen reseptor %0. ang meliputi ko)on

68, eon 1,/

eterangan  1  !0+ 2  00+ 3  !!+ 4  !0 ( !  asparagin 0  serin

(18)

-Hasil SSCP untuk mendeterminasi jumlah pengulangan CAG pada gen reseptor androgen dengan jangkauan antara 19 ulangan (no. 15) dan 31 ulangan (no. !)

1 2 ( 4 5 6 7 *  1) 11 12 1( 14 15 16 17 1* 1 2)

PCR-##CP peg%laga C3G ge resep!"r a'r"ge

(19)

Diagnosis penyakit genetika < anemia sel sabit "si&kle &ell anaemia#

Anemia sel sabit adalah penyakit genetika disebabkan karena mutasi titik sehingga asam amino ke + dari

hemoglobin  berubah dari glutamat menadi valin "-A- -'-#. Mutasi mengubah gen menadi alel yang kodominan.

Diagnosis ditegakkan dengan identifikasi gen

hemoglobin  dengan P7$ dan deteksi mutasi kodon + dengan sikuensing DNA. Distribusi alotip dalam

(20)

Kelebihan diagnosis molekuler :

! lebih efisien dalam metodologi, aktu dan sampling ! lebih &epat dan akurat

! memerlukan sampel dengan umlah atau ukuran ke&il ! dapat disimpan dan diulang kembali dalam rentang

aktu lama

Kelemahan/kekurangan :

! memerlukan metodologi dan sarana yang kompleks % mutakhir.

! biaya operasional mahal

(21)

'erapi gen :

Menginsersikan gen normal "sehat# ke sel/aringan

individu yang menderita penyakit genetika resesif agar gen yang diinsersikan dapat mengganti/ mengkompensasi atau mengkoreksi fungsi gen yang tidak atau kurang

berfungsi.

'erapi gen sel somatik "somatic cell gene therapy# lebih diprioritaskan daripada germline cell therapy – gen asing yang diinsersikan tidak diturunkan ke generasi

(22)

Menginsersikan gen/DNA ke galur sel "&ell line# tertentu ! Mi&roine&tion dengan mi&roneedle glass menggunakan

mi&ro manipulator dilakukan pada in vitro fertiliEation "?7(?#.

! Penggunaan karier loposom "lipofe&tion#:

DNAdi&ampur dengan fosfolipid yang dapat membentuk kapsul lipid bilayer sintetik "liposom# liposom yang membaa DNA ditambahkan ke kultur sel teradi fusi liposom < membran sel % DNA masuk ke dalam sel, beberapa men&apai nukleus, berintegrasi dengan DNA

Diagnosis Molekuler & Terapi Gen