BAB IV Hasil dan Pembahasan
Dalam bab ini akan dipaparkan hasil tiap tahap penelitian beserta analisis dan pembahasannya yang terdiri atas analisis 584 sampel berupa urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dari berbagai suku bangsa di dunia yang diwakili oleh tiga suku bangsa yaitu suku bangsa Asia, Eropa dan Afrika dengan program Mito
Mutation Analyzer (MMA) dan analisis urutan nukleotida lengkap menggunakan
empat belas enzim restriksi endonuklease.
IV.1 Analisis Urutan Nukleotida Lengkap dengan Metode MMA
Pada penelitian ini pertama kali dilakukan pengeditan sampel, sebanyak 584 sampel yang diterima penulis berformat .seq, selanjutnya sampel-sampel tersebut diedit untuk mendapatkan urutan nukleotidanya saja. Tujuan pengeditan sampel adalah untuk mencegah pengkaburan informasi mutasi yang dikeluarkan oleh program MMA. Contoh salah satu file sampel file sampel urutan nukleotida lengkap yang belum diedit dapat di lihat pada Gambar IV.1, Sedangkan sisanya sebanyak 584 sampel dapat dilihat di lampiran dan di Compact Disc (CD) di dalam tesis ini.
Gambar IV.1 Contoh salah satu file sampel urutan nukleotida lengkap yang belum di edit. Ditampilkan sebagian urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dari sampel AB055387 yang terdiri atas 16554 pb.
Setelah semua sampel selesai diedit, tahap selanjutnya adalah penulisan nama file-file ke dalam file leogane. txt. File yang akan dianalisis harus dituliskan tepat pada setiap baris dalam file leogane.txt. Contoh salah satu file sampel yang telah diedit dapat dilihat pada Gambar IV.2. Hal ini bertujuan untuk menghindari berhentinya program MMA sehingga file-file sampel yang tertulis setelah kesalahan akan dianalisis oleh program MMA, sedangkan sisa file sampel dapat dilihat di lampiran dan di Compact
Disc (CD) yang terdapat di dalam tesis ini.
Gambar IV.2 Contoh salah satu file sampel urutan nukleotida lengkap yang telah selesai diedit. Ditampilkan sebagian urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dari sampel AF347000 yang terdiri atas 16569 pb. Semua file sampel yang akan dianalisis, file leogane. txt, program MMA harus ditempatkan pada folder yang sama. Jika tidak ditempatkan pada folder yang sama, maka program MMA tidak dapat dijalankan. Setelah semuanya ditempatkan pada folder yang sama, maka program MMA dapat dijalankan. Analisis urutan nukleotida keseluruhan dengan program MMA menghasilkan luaran berupa jenis, posisi dan jumlah mutasi, insersi serta delesi, yang salah satu contoh ilustrasinya dapat dilihat
pada Gambar IV.3. Sisa sampel yang telah di analisis dengan program MMA sebanyak 584 dapat di lihat di lampiran dan sebagian lagi di simpan di Compact Disc (CD) yang terdapat di dalam tesis ini.
Gambar IV.3 Contoh salah satu File sampel urutan nukleotida lengkap yang telah dianalisis dengan program MMA. Ditampilkan sebagian urutan nukleotia lengkap mtDNA manusia dari sampel AY495108 yang terdiri atas 16569 pb yang dianalisis dengan program MMA Jenis, posisi dan jumlah mutasi, insersi serta delesi yang dihasilkan dari analisis dengan program MMA sangat bervariasi. Jumlah mutasi tertinggi terdapat pada kode sampel AF34699 sebanyak 129 mutasi, yang diwakili oleh suku bangsa Afrika. Sedangkan mutasi terendah terdapat pada kode sampel AY339426 dan AY495120 sebanyak 12 mutasi yang diwakili oleh suku Bangsa Asia. Jenis dan posisi mutasi selanjutnya akan digunakan untuk menentukan haplogroup mtDNA manusia menggunakan empat belas enzim restriksi endonuklease.
IV.2 Penentuan Haplogroup dengan Enzim Restriksi Endonuklease
Hasil analisis dengan program MMA berupa jenis dan posisi mutasi dari urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dipindahkan ke program Excel, tujuan pemindahan ke program Excel adalah untuk memudahkan penentuan haplogorup menggunakan empat belas enzim restriksi endonuklease. Haplogroup, enzim restriksi, sisi pemotongan (recognition site), jenis dan posisi mutasi urutan
nukleotida yang digunakan untuk menentukan haplogroup dapat dilihat pada Tabel IV.1
Tabel IV.1 Haplogroup, enzim restriksi, sisi pemotongan dan jenis dan posisi mutasi urutan nukleotida. Terdapat 16 haplogroup dan masing-masing haplogroup diwakili oleh enzim-enzim tertentu, dimana enzim tersebut memiliki jenis dan posisi urutan nukleotida
No Haplogroup Enzim Posisi basa Sisi pemotongan CRS Posisi dan jenis mutasi
1 A HaeIII 663 GGCC AGCC 663G
2 B HaeIII 16517 GGCC GGTC 9bp Delesi
3 C AluI 13262 AGCT AACT 13263G HincII -13259 GTYRAC GTCAAC 13263G
4 D Alu I -5176 AGCT AGCT 5178C-A
5 E AluI 10397 AGCT AACT 10400T
6 G HhaI 4831 GCGC GCAC 4833G
HaeII 4830 RGCGCY GGCACC 4833G
7 F RSaI -16303 GTAC GTAC 16304C
8 H AluI -7025 AGCT AGCC 7028C
9 I MboI 16390 GATC GGTC 16391A
AvaII -16390 GGRCC GTACA 16390A BamHI 16389 GGATCC GGGTCC 16391A AluI 10032 AGCT AGTT 10034C
10 J NIaIII 4216 CATG TATG 4216C
HinfI -16065 GANTC
GA A/G C/T TC GACTCC 16069T
11 K RSaI -16310 GTAC GTAC 16311T
12 L RSaI 16310 GTAC GTAC 16311 C
HinfI 16389 GANTC GGGTCC 16390 A GA A/G C/T TC GAACTC AvaII -16390 GGRCC GGTCC 16390A GGG/ACC GGGCC
HpaI -3592 GTTAAC GTCAAC 3594 T/C
13 U TaqI 14068 TCGA TCAA 14070G
MboI 13104 GATC AATC 13104G HinfI -13103 GANTC 13104G
GA A/G C/T TC
AluI 11329 AGCT 11332T RSaI 4643 GTAC GTAT 4646C
14 T NIaIII 4216 CATG TATG 4216C
BamHI 13366 GGATCC GGGTCC 13368A AluI 15606 AGCT AACT 15607G AvaII -13367 GGRCC GGTCC 13368A MboI 13367 GATC GGTC 13368A
15 V NIaIII -4577 CATG CATG 4580A
16 X AccI 14465 GTVWAC
GT A/C G/T AC GTATAT 14470C
Enzim-enzim yang digunakan dalam penentuan haplogroup yaitu enzim HaeIII, AluI,
HincII, HhaI, HaeII, HpaI, RsaI, MboI, AvaII, BamHI, NIaIII, HinfI, TaqI dan AccI.
diwakili oleh enzim tertentu, contohnya enzim HaeIII, jenis mutasi urutan nukleotida dari enzim tersebut adalah A menjadi G, pada posisi 663 (A663G), jika terdapat mutasi urutan nukleotida dari A menjadi G pada posisi 663 (A663G), maka individu tersebut dikelompokkan ke haplogroup A. Hal yang sama dilakukan pada keseluruhan sampel yaitu 584 sampel dengan melihat jenis dan posisi mutasi basa pada urutan nukleotida dari enzim yang digunakan. Contoh salah satu hasil analisis menggunakan empat belas enzim restriksi diperlihatkan pada Gambar IV.4, sedangkan sisanya terdapat pada lampiran dan sebagian disimpan di Compact Disc (CD) di dalam tesis ini.
Gambar IV.4 Contoh salah satu hasil analisis urutan nukleotida lengkap yang dengan empat belas enzim restriksi. Individu dengan kode AY255152, jumlah basa 16567pb setelah dianalisis dengan enzim restriksi menghasilkan empat haplogroup yaitu H, F, I dan L secara berturut-turut yang ditandai dengan adanya enzim AluI pada posisi c7028t, RsaI pada posisi t16304c, untuk haplogroup I dan L ditandai dengan enzim AvaII di posisi g16390a.
Penentuan haplogroup mtDNA manusia menggunakan empat belas enzim restriksi memberikan hasil berupa haplogroup yang sangat variatif untuk sejumlah individu. Sebanyak 584 individu yang dianalisis, individu yang memiliki satu haplogroup berjumlah 133 individu, terdiri atas haplogroup H dan F, haplogroup H sebanyak 120 individu dan haplogroup F, 13 individu. Ilustrasi salah satu hasil analisis urutan nukleotida lengkap mtDNA manusia dengan empat belas enzim restriksi pada individu yang memiliki satu haplogroup dapat dilihat pada Gambar IV.5, sebagian sampel hasil analisis dengan empat belas enzin restriksi terdapat pada lampiran, sedangkan sisanya terdapat di dalam Compact Disc (CD) dalam tesis ini.
Gambar IV.5 Contoh salah satu hasil analisis dengan enzim restriksi untuk satu haplogroup. Individu dengan kode sampel AY195768 memilki satu haplogroup yaitu haplogroup H yang ditandai dengan adanya enzim
Pada haplogroup satu, jumlah haplogroup yang sama dengan metode RFLP adalah 83 individu yaitu haplogroup H dan 12 individu untuk haplogroup F. Haplogroup yang tidak sesuai dengan metode RFLP berjumlah 38 individu, untuk haplogroup H 37 individu dan satu individu untuk haplogroup F. Contoh sebagian kode sampel dan haplogroup yang diperoleh dari hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang memiliki satu haplogroup dapat dilihat pada Tabel IV.2, sedangkan sisanya terdapat pada lampiran.
Tabel IV.2 Individu yang memiliki satu haplogroup. Terdapat delapan belas individu yang termasuk ke dalam haplogroup H dan tiga belas individu termasuk ke dalam haplogroup F
Haplogroup No Sampel A B C D E G F H I J K L U T V W X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 AY339513 H 2 AY339545 H 3 AY339547 H 4 AY339548 H 5 AY289083 H 6 AY289084 H 7 AY495306 H 8 AY495307 H 9 AY495308 H 10 AY495309 H 11 AY275531 H 12 AY275532 H 13 AY275533 H 14 AY275534 H 15 AY275535 H 16 AY275536 H 17 AY275537 H 18 AY289086 H 1 AY339430 F 2 AY339431 F 3 AY339432 F 4 AF346974 F 5 AF346975 F 6 AF346974 F 7 AF346975 F 8 AY495173 F 9 AY495175 F 10 AY495176 F 11 AY495171 F 12 AY495167 F 13 AY495168 F
Kelompok yang memiliki dua haplogroup berjumlah 129 individu. Individu yang termasuk ke dalam dua haplogroup yaitu EH, HL, HV, HI, HU, HX, FH, AH dan DE, masing-masing secara berturut-turut berjumlah 48, 46, 21, 5, 2, 2, 2, 2 dan 1. Untuk haplogroup EH yang sesuai dengan metode RFLP sebanyak 45 individu, 28 individu untuk haplogroup E dan 17 individu untuk haplogroup H, yang tidak sama dengan haplogroup RFLP berjumlah tiga individu. Untuk HL yang sesuai dengan metode RFLP berjumlah 33 individu, terdiri dari haplogroup L 11 individu dan 22 individu untuk H dan sisanya tidak sesuai dengan metode RFLP. Contoh salah satu hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang memiliki dua haplogroup dapat dilihat pada Gambar IV.6. Sebagian dapat dilihat di lampiran, sedangkan sisanya disimpan di Compact Disc (CD) di dalam tesis ini.
Gambar IV.6 Hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang memiliki dua haplogroup. Individu dengan kode AF347006 yang memiliki dua haplogroup yaitu haplogroup HV, yang ditandai dengan adanya enzim NIaIII di posisi G4580A dan enzim
AluI di posisi C7028T.
Individu yang memiliki haplogroup HV berjumlah 21 individu, sembilan belas individu sesuai dengan RFLP, hanya 2 individu yang tidak sesuai. Untuk haplogroup HI, HU, FH, DE semuanya sama dengan haplogroup RFLP, sedangkan AH hanya satu yang sama dengan RFLP dan HX tidak terdapat kesamaan dengan haplogroup
RFLP. Contoh untuk sejumlah individu yang memiliki dua haplogroup dapat dilihat pada Tabel IV.3, sedangkan sisanya dapat dilihat di lampiran.
Tabel IV.3 Contoh individu yang memiliki dua haplogroup. Terdapat dua puluh dua individu yang termasuk ke dalam haplogroup HV, enam individu termasuk ke dalam haplogroup HL dan lima individu termasuk ke haplogroup EH Haplogroup No Sampel A B C D E G F H I J K L U T V W X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 AY339433 H V 2 AY339434 H V 3 AY339436 H V 4 AY339437 H V 5 AY339439 H V 6 AY339440 H V 7 AY339441 H V 8 AY339442 H V 9 AY339443 H V 10 AY339444 H V 11 AY339448 H V 12 AY339449 H V 13 AY339450 H V 14 AY339452 H V 15 AY339455 H V 16 AY339457 H V 17 AY339458 H V 18 AY339459 H V 19 AF381990 H V 20 AF347006 H V 21 AY195750 H V 22 AY195781 H V 1 AF347000 H L 2 AF346976 H L/L 3 AY339544 H L 4 AY289095 H L 5 AY495251 H L 6 AY275527 H L 7 AY275528 H L 8 AY275529 H L 1 AF347012 E H 2 AF346966 E H 3 AF346972 E H 4 AY289097 E H 5 AY289098 E H 6 AY519491 E H 7 AY519493 E H
Individu yang termasuk kedalam tiga haplogroup berjumlah 119 individu yaitu HJT, HIL, EHL, DEH, CEH dan FHI, masing-masing berjumlah 80, 16, 15, 5, 2 dan 1. Untuk haplogroup HJT dari 80 individu, yang sama dengan haplogroup RFLP 78 individu, hanya 2 individu yang haplogroupnya tidak sama dengan RFLP. Untuk haplogroup HIL semuanya sama dengan metode RFLP, sebanyak 5 individu termasuk kedalam haplogroup L, dan enam individu tergolong ke haplogroup HI, serta 5 individu masuk ke dalam haplogroup IL. Terdapat 15 individu yang tergolong ke dalam haplogroup EHL, yang sama dengan metode RFLP sebanyak 14 individu, sedangkan sisanya tidak sama. Contoh salah satu hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang memiliki tiga haplogroup dapat dilihat pada Gambar IV.7 dan sebagian terdapat di lampiran serta sisanya di simpan di dalam Compact
Disc (CD) di dalam tesis ini.
Gambar IV.7 Contoh salah satu hasil analisis dengan enzim restriksi untuk tiga haplogroup. Individu dengan kode AF381987 yang memiliki tiga haplogroup yaitu haplogroup HJT, yang ditandai dengan adanya enzim NIaIII di posisi T4216C untuk haplogroup T, AluI di posisi C7028T untuk haplogroup H dan HinfI di posisi C16069T untuk haplogroup J
Untuk individu yang memiliki haplogroup DEH, yang sama dengan metode RFLP sebanyak 3 individu dan sisanya tidak sama. Haplogroup CEH berjumlah 2 individu, hanya satu individu yang sama dan sisanya tidak sama, untuk FHI haplogroupnya sesuai dengan metode RFLP. Sejumlah individu yang memiliki tiga haplogroup beserta kode sampelnya dapat dilihat pada Tabel IV.4 dan sisanya terdapat di lampiran.
Tabel IV.4 Contoh kode sampel untuk individu yang memiliki tiga haplogroup. Terdapat sebelas individu yang termasuk ke dalam haplogroup EHL, sebelas individu termasuk ke dalam haplogroup HIL, tiga individu termasuk ke haplogroup DEH dan dua individu termasuk ke dalam haplogroup CEH. Haplogroup No Sampel A B C D E G F H I J K L U T V W X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 AY289089 E H L 2 AY289090 E H L 3 AF347003 E H L 4 AY255151 E H L 5 AY255154 E H L 6 AY255160 E H L 7 AF347003 E H L 8 AF381984 E H L 9 AF381996 E H L 10 AY255176 E H L 11 AY289071 E H L 1 AY195766 H I L / L 2 AF346995 H I L/L 3 AY195785 H I L / L 4 AF346998 H I L/L/L 5 AF346999 H I L/L/L 6 AY339502 H I/I L 7 AY339503 H I/I L 8 AY339504 H I/I L 9 AY339505 H I/I L 10 AY339507 H I/I L 11 AY339508 H I/I L 1 AF346984 D E H 2 AF346989 D E H 3 AF346990 D E H 1 AF346970 C E H 2 AF347013 C E H
Kelompok individu yang memiliki empat haplogroup berjumlah 32 individu, terdiri atas haplogroup FHJT, HJLT, EHIL masing-masing berjumlah 21, 4, 3, sedangkan EHJT, AEHL, HIJT dan FHIL masing-masing berjumlah 1. Contoh salah satu hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang termasuk ke dalam empat haplogroup diperlihatkan pada Gambar IV.8. Sebagian terdapat di lampiran dan sisanya terdapat di Compact Disc (CD) di dalam tesis ini.
Gambar IV.8 Hasil analisis dengan enzim restriksi untuk individu yang memiliki empat haplogroup. Individu dengan kode AY255172, jumlah basa 16568 pb yang memiliki empat haplogroup yaitu haplogroup AHEL, yang ditandai dengan adanya enzim HaeIII di posisi a663g untuk haplogroup A, AluI di posisi C7028T untuk haplogroup H, AluI di posisi C10400T untuk haplogroup E dan
Untuk haplogroup FHJT, semuanya sesuai dengan haplogroup RFLP, kecuali F. Individu yang memiliki haplogroup HJLT juga sama dengan haplogroup RFLP, kecuali haplogroup L, sedangkan untuk haplogroup EHJT, yang sama dengan RFLP hanya E, haplogroup AEHL hanya AE yang sama dengan RFLP dan untuk FHIL yang sama dengan RFLP adalah F. Sejumlah individu yang memiliki empat haplogroup beserta kode sampelnya dapat dilihat pada Tabel IV.5 dan sisanya terdapat di lampiran.
Tabel IV.5 Individu yang memiliki empat haplogroup. Terdapat dua puluh satu individu yang termasuk ke dalam haplogroup FHJT, empat individu termasuk ke dalam haplogroup HJLT, tiga individu termasuk ke haplogroup EHIL. EHJT, HIJT, AEHL dan FHIL masing-masing satu individu Haplogroup No Sampel A B C D E G F H I J K L U T V W X 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 1 AY495267 F H J T/T 2 AY495268 F H J T/T 3 AY495269 F H J T/T 4 AY495270 F H J T/T 5 AY495271 F H J T/T 6 AY495272 F H J T/T 7 AY495273 F H J T/T 8 AY495274 F H J T/T 9 AY495275 F H J T/T 10 AY495276 F H J T/T 11 AY495277 F H J T/T 12 AY495278 F H J T/T 13 AY495279 F H J T/T 14 AY495280 F H J T/T 15 AY495281 F H J T/T 16 AY495282 F H J T/T 17 AY495283 F H J T/T 18 AY495284 F H J T/T 19 AY495287 F H J T/T 20 AY195745 F H J T 21 AY195767 F H J T 1 AY339587 H J/J L T 2 AY495256 H J L T 3 AY339589 H J/J L T 4 AY339590 H J/J L T 1 AF346965 E H I L/L 2 AY255150 E H I L/L 3 AY255178 E H I L/L
Terdapat 97 individu yang tidak termasuk ke dalam haplogroup manapun, sedangkan sisanya 74 individu belum diketahui suku bangsanya. Hasil analisis berdasarkan posisi mutasi urutan nukleotida lengkap secara in silico, ternyata metode RFLP hanya berlaku untuk 133 individu yaitu satu individu memiliki satu haplogroup, individu tersebut adalah yang termasuk ke haplogroup H, 95 individu dan F, 38 individu, sedangkan sisanya sebanyak 541 individu tidak mempunyai sesuatu yang spesifik untuk dapat digolongkan ke dalam group tertentu. Contoh 48 individu dapat digolongkan baik sebagai haplogroup E maupun haplogroup H. Jumlah haplogroup yang sesuai dan tidak sesuai dengan haplogroup RFLP dapat dilihat pada Table IV.6
Tabel IV.6 Jumlah haplogroup yang sesuai dan tidak sesuai dengan haplogroup RFLP. Jumlah Individu yang termasuk ke dalam satu halogroup 133 individu yang sesuai dengan haplogroup RFLP 95 individu, yang tidak sesuai 38 individu. Individu yang memiliki dua haplogroup berjumlah 129 individu, yang sesuai dengan Haplogroup RFLP 107 individu dan yang tidak sesuai 22 individu. Individu yang termasuk ke dalam 3 haplogroup berjumlah 119 individu, yang sesuai dengan haplogroup RFLP 113 individu, 6 individu tidak sesuai. Untuk individu yang memiliki empat haplogroup berjumlah 32 individu, semuanya sesuai dengan haplogroup RFLP Jumlah Haplogroup Jenis haplogroup Jumlah individu Sama dengan RFLP Tidak sama dengan RFLP
Satu haplogroup H dan F 133 95 38
Dua haplogroup
EH, HL, HV, HI, HU, HX, FH, DE
129 107 22
Tiga haplogroup EHL, DEH, HJT, HIL, CEH FHI, 119 113 6 Empat haplogroup FHJT, HJLT, EHIL 32 32 -
Ketidaksesuaian jumlah haplogroup RFLP dengan haplogroup yang ditentukan atas dasar urutan nukleotida lengkap dikarenakan metode RFLP tidak menggunakan urutan nukleotida lengkap dalam menentukan haplogroup suku-suku bangsa di dunia tetapi hanya menggunakan daerah-daerah tertentu saja dari mtDNA manusia. Metode RFLP juga menggunakan enzim restriksi endonuklease untuk menentukan haplogroup sehingga hanya bagian-bagian tertentu saja yang dapat dianalisis dari urutan nukleotida sesuai dengan sisi pengenalan (recognition site) dari enzim yang digunakan. Untuk individu yang tidak termasuk ke haplogroup manapun, kemungkinan dapat dibuat haplogroup baru berdasarkan sisi pemotongan dari enzim restriksi atau berdasarkan posisi mutasi yang spesifik dari urutan nukleotida tersebut. Untuk individu yang tidak termasuk ke haplogroup manapun, kemungkinan diperoleh sisi restriksi baru yaitu sisi restriksi dari enzim HaeIII, dengan sisi pemotongan 16517, setelah dibandingkan dengan CRS terdapat mutasi pada posisi T16519C, dan posisi ini terdapat pada kelompok individu yang tidak termasuk ke haplogroup manapun.
