4.Uji Sterilitas

Validasi dan kontrol

proses sterilisasi

1. KONTROL PROSES STERILISASI

2. UJI STERILITAS

 Alat – alat yang akan digunakan untuk proses

seteriolisasi harus divalidasi terlebih dahulu dengan menggunakan indikator yang telah distandardisasi sehingga alat layak dipakai.

 Dalam proses validasi dan monitoring harus

dapat menjamin bahwa alat berjalan dengan baik.

 Ada 3 macam indikator yang dipakai pada

proses sterilisasi yaitu :

1. Indikator Biologi ( Biological Indicator ) 2. Indikator Kimia ( Chemical Indicator ) 3. Indikator Fisik ( Physical Indicator )

INDIKATOR BIOLOGI

 Indikator biologi adalah sediaan berisi populasi miokroorganisme spesifik dalam bentuk spora.  Spora bersifat resisten terhadap beberapa

parameter yang terkontrol dan terukur dalam suatu proses tertentu.

 Prinsip kerja indikator biologi adalah mensterilkan spora hidup mikroorganisme yang non-patogenik dan sangat resisten dalam jumlah tertentu.

 Apabila dalam proses sterilisasi spora-spora terbunuh, diasumsikan bahwa mikroorganisme lainnya ikut terbunuh pula dan benda yang kita sterilkan bisa disebut steril.

 Indikator biologi tersedia untuk metode sterilisasi uap, panas kering, dan gas etilen oksida.

 Jenis yang digunakan adalah:

 Bacillus subtilis (sterilisasi gas ETO dan panas kering),

 Bacillus pumilus (radiasi ionisasi) dan

Beberapa jenis indikator biologi

1. Indikator biologi berupa strip kertas yang

mengandung spora kering dan di kemas dalam kantong bersegel.

 Setelah proses sterilisasi selasai, spora kering dipindahkan secara aseptik kedalam media

pertumbuhan untuk dilihat apakah terjadi pertumbuhan koloni.

2. Indikator biologi dikemas tersendiri , strip berisi spora dikemas dlm vial bersama dg media

pertumbuhan spora .

 Setelah sterilisasi selasai indikator biologi diaktifkan dengan memecah ampul yg berisi media dan kemudian diinkubasi untuk melihat adanya pertumbuhan koloni.

Beberapa jenis indikator biologi

3. Perkembangan selanjutnya dipakai Indikator biologi yang mengandung sistem deteksi cepat ( rapid ).

 Sistem ini bekerja berdasarkan adanya interaksi enzim dalam spora dengan bahan yg ada dlm media pertumbuhan .

 Hasil positif (terjadi peertumbuhan koloni ) jika memberikan fluoresensi dibawah sinar UV.

Beberapa jenis indikator biologi

4. Indikator biologi yang berbentuk vial tertutup yg mengandung strip spora dan ampul berisi media pertumbuhan yg mengandung zat warna.

 Sistem ini bekerja berdasarkan adanya interaksi enzim dalam spora dengan bahan yg ada dlm media pertumbuhan .

 Indikator diaktifkan dg cara memecah ampul kemudian diinkubasi pada 57oC selama 24 – 48 jam.

 Produk dikatakan steril jika tidak terjadi perubahan warna.

Interpretasi hasil indikator biologi

Hasil positif jika terjadi :



Kekeruhan dan pertumbuhan koloni (1

dan 2 )



Fluoresensi (3)



Perubahan warna (4)

Hasil positif  produk tidak steril atau proses sterilisasi gagal.

INDIKATOR KIMIA

 Indikator kimia adalah indikator yang menandai

terjadinya paparan sterilitas (uap panas atau gas ETO) pada objek yang disterilkan dengan adanya perubahan warna.

 Indikator kimia diproduksi dalam bentuk strip, kartu, dan vial.

 Indikator sensitif terhadap satu atau lebih parameter sterilisasi.

 Indikator memberikan informasi tercapainya kondisi steril pada tiap kemasan.

 Maka, selain digunakan di luar ada pula yang

digunakannya di dalam, sehingga dikenal dengan internal indikator dan eksternal indikator.

1. Browne’s sterilizer control tubes

- Tabung kecil tertutup yang mengandung

campuran zat dan indikator.

- Terjadi perubahan warna hijau, jika

suhu dan waktu sterilisasi telah tercapai.

2. Filter paper strip

3. Royce sachet (gas Et-O, etilen klorhidrin

yang terbentuk



_{kuning mjd ungu)}

4. Dosimeter radiasi ( terjadi perubahan

densitas optik karena radiasi, diukur

dengan spektro.UV)

Jenis Warna hijau setelah

Black Spot Otoklaf ad 126 ºC  25’, 115C

 16’, 120C

 11’, 125C

Yellow spot High vacuum otoclave

pada > 130 ºC _ 4’, 130 _{3’, 125}_C _C Green spot Oven pada 160 º C _{ 60’, 160C}

Blue Spot Oven infra red pada

INDIKATOR FISIK /MEKANIK



Indikator mekanik adalah bagian instrumen

mesin sterilisasi seperti tabel, dan

indikator suhu maupun tekanan yang

menunjukkan apakah alat sterilisasi

bekerja dengan baik.



Contohnya adalah indikator tes

Boudewick.

Indikator ini digunakan untuk menilai

efesiensi pompa vakum pada alat sterilisasi

serta untuk mengetahui adanya kebocoran

udara dalam ruang sterilisasi.

Kegunaan INDIKATOR FISIK / MEKANIK



Pengukuran temperatur dan tekanan

merupakan fungsi penting sistem

monitoring sterilisasi. Apabila indikator

mekanik berfungsi dengan baik, maka akan

memberikan informasi segera mengenai

temperatur, tekanan, waktu, dan fungsi

mekanik lainnya dari alat.



Memberikan indikasi adanya masalah

apabila alat rusak dan memerlukan

perbaikan.

Keterbatasannya



Indikator mekanik tidak menunjukkan

bahwa keadaan steril sudah tercapai,

melainkan hanya memberikan informasi

tentang fungsi alat sterilisasi.



Karena bersifat mekanis, maka bila tidak

dilakukan kaliberasi alat dengan tepat atau

pemakaian yang terlalu sering indikator

dapat memberikan informasi yang tidak

tepat.

UJI STERILITAS

Larutan Uji + Media Perbenihan Inkubasi 30 – 35 ºC

20 – 25 ºC

Kekeruhan / pertumbuhan-Tidak Steril Tidak keruh -- Steril

MEDIA JASAD

RENIK MIKROBA UJI INKUBASI SUHU

Tioglikolat Cair Aerob B. Subtilis C. Albicans

Bacteroides vulgatus

30 – 35 ºC Tioglikolat

alternatif Anaerob Bacteroides vulgatus 30 – 35 º C

Prosedur umum uji sterilitas

1. Inokulasi langsung ke dalam media uji

 Spesimen uji + media uji  inkubasi tidak kurang dari 14 hari  _{amati pertumbuhan pada media}

secara visual sesering mungkin sekurangnya pada hari ke-3 atau ke-4 atau ke-5, pada hari ke-7 atau ke-8 dan pada hari terakhir dari masa uji.

 Jika zat uji menyebabkan media menjadi keruh sehingga ada atau tidaknya pertumbuhan mikroba tidak dapat ditentukan secara visual  _pindahkan

sejumlah memadai media ke dalam tabung baru berisi media yang sama, sekurangnya 1 kali antara hari ke-3 dan ke-7 sejak pengujian dimulai 

lanjutkan inkubasi media awal dan media baru

selama total waktu tidak kurang dari 14 hari sejak inokulasi awal.



Cara ini dapat digunakan untuk uji

sterilitas

 Cairan

 Salep dan minyak yang tidak larut dalam isopropyl miristat

 Zat padat

 Kapas murni, perban, pembalut, benang bedah, dan bahan sejenisnya

 Alat kesehatan steril

2. Teknik penyaringan membran

Penyaringan dengan filter membran porositas 0,22 m, diameter  47 mm, kecepatan

aliran 55 – 75 ml/menit, tek.70 cmHg. Membran di potong menjadi 2 bagian (jika

hanya mungkin membran), lalu dimasukkan ke dalam:

• Media tioglikolat cair, inkubasi 30 - 35_{C, 7}

hari

• Media soybean digest, inkubasi 20 - 25_C,

Cara ini dapat digunakan untuk uji sterilitas

1. Cairan yang dapat bercampur dengan

pembawa air

2. Cairan yang tidak bercampur dengan

pembawa air (> 100 ml/wadah)

3. Zat padat yang dapat di saring

4. Salep dan minyak yang larut dalam

isopropyl miristat

5. Alat kesehatan

Keuntungan cara filtrasi

• Lebih sensitive dari pada cara

inokulasi

• Zat penghambat dapat dipisahkan

(antibiotik, pengawet, antioksidan)

• Volume besar tidak masalah

• Kesalahan sampling dengan derajat

kontaminasi rendah/dikurangi

Penafsiran hasil uji sterilitas

Tahap pertama

• Jika (-)



_steril

• Jika (+), tapi peninjauan dalam pemantauan

fasilitas pengujian sterilitas, bahan yang

digunakan, prosedur pengujian dan kontrol

negatif menunjukkan tidak memadai atau

teknik aseptic yang salah digunakan dalam

pengujian



_{tahap pertama di ulang}

• Jika (+), tetapi tidak terbukti uji tahap

pertama tidak absah



_{tahap ke dua.}

Tahap kedua

• Jumlah spesimen uji min.2 x jumlah

tahap pertama

• Jika (-)



_steril

• Jika (+)



_{tidak steril}

• Jika uji pada tahap kedua dibuktikan

ada kesalahan atau teknik aseptik

tidak memadai



_{tahap kedua di}

ulang.

Pengambilan sample untuk uji sterilitas

Pengertian batch menurut FI IV

• Sediaan yang disterilkan secara bersamaan

c/ dalam otoklav; isi seluruhnya = 1 batch

• Sediaan yang disterilkan secara

berkesinambungan (c/ radiasi berkas

electron) = 1 batch semua sediaan yang

disterilisasi menurut cara tersebut tidak

lebih dari 24 jam

Sampling menurut FI IV

• Sediaan dibuat secara aseptic, yang di isi

dalam waktu tidak kurang dari 24 jam

berurutan tanpa henti (berkesinambungan),

diambil pada waktu tertentu, minimum 20

wadah dan maksimum 100 wadah.

• Untuk batch kecil,

Jika jumlah wadah 20 – 200



_{di ambil}



10%

Jika jumlah wadah



₂₀



_{min. 2 wadah di}

1. Definisi

2. Uji pirogen

Definisi

 Pirogen adalah senyawa dengan berat molekul tinggi

yg dinyatakan sebagai senyawa lipopolisakarida-protein-lipoid-kompleks yg diproduksi kira-kira 5-10% dari masa total bakteri.

 Bahan pirogen yg berukuran antara 0.05µ – 1.0µ

dapat tersaring , bahan pirogen tahan terhadap

panas pengeringan hingga suhu 180o_{C. Oleh karena}

itu pembebasan pirogen bukan hal yg mudah karena progen dapat berada di air suling, bahan obat, bahan pembantu, wadah atau selang infus.

Definisi

 Adanya pirogen pada tubuh akan menyebabkan

hipertermi yaitu naiknya suhu tubuh shg kita akan menggigil kedinginan.

 Pada awalnya akan terjadi leukopenia, selanjutnya

leukositosis yg dapat mengakibatkan kematian.

 Pirogen merupakan endotoksin yaitu hasil

metabiolisme bakteri gram positif seperti Salmonela, pseudomonas dan lainnya yang melekat kuat pada

permukaan bakteri

 Sifat pirogen ini juga ditemui pada beberapa virus,

ragi dan jamur.

Definisi

 Hingga saat ini struktur kimia pirogen belum diketahui

secara pasti.

 Hampir semua farmakope mencantumkan syarat bebas

pirogen untuk semua sediaan parentral tetapi masih

belum seragam .beberapa mensyaratkan injeksi takaran tunggal 10 ml harus bebas pirogen, tetapi ada yg

mempersyaratkan 100 ml sekali pakai harus bebas pirogen.

 Air yg sudah bebas pirogen bila didiamkan di udara

terbuka selama 4 jan atau lebih pada temperatur 22o_C

akan dapat terkontaminasi pirogen.

 Selain pirogen hipertermi dapat pula disebabkan oleh :

Senyawa seng yang berasal dari tutup karet

 Logam berat seperti besi dan tembaga

 Beberapa senyawa organik

Yang dipersyaratkan bebas pirogen :

1. Air atau larutan air

a. Dengan filter penyaring.

Prosesnya terjadi melalui absorbsi pirogen pada material penyaring dengan menggunakan lapisan asbes-selulosa yg berbeda jenis dan lebar porinya.

b. Kolom aluminium oksida atau penyaring karbon 0.1% dari

Yang dipersyaratkan bebas pirogen :

c. Sinar γ (Cobalt 60)

d. Ditambahkan H₂O₂ 0.1% dan dimasak selama 1 jam.

e. Ditambahkan 10 ml larutan KMnO₄ 0.1 N dalam NaOH

1 N per liter larutan pada waktu aquades disuling 2. Bahan obat atau bahan pembantu.

a. Melalui pemanasan selama 30 menit pada suhu 250o_C

atau 1 jam pada 200o_C

b. Dilarutkan kemudian dibebas pirogenkan.

Yang dipersyaratkan bebas pirogen :

3. Wadah, bahan tutup dan lainnya.

a. Gelas piala, corong,ampul,botol infus dll dibebas pirogenkan dg disterilisasi

b. Metode kimia menggunakan asam kromsulfat atau asam nitrat dan dibilas kembali dengan air suling bebas pirogen.

c. Material karet silikon dipanaskan 30 menit pada suhu 90oC dalam fenil merkuriborat 0.002%

d. Autoclav suhu 121 – 124oC selama 120 menit

e. Disterilkan dg cara dingin yaitu dg penyinaran sinar terionisasi atau dg etilen oksida.

UJI PIROGEN DILAKUKAN UNTUK MEMBATASI RESIKO REAKSI DEMAM SAMPAI PADA TINGKAT YANG DAPAT DITERIMA OLEH PASIEN PADA PEMBERIAN SEDIAAN PARENTERAL.

1. Test terhadap Kelinci

Prinsip kerja bahan uji diinjeksikan kedalam vena telinga kelinci  kontrol kenaikan suhu diukur melalui rektal.

Hasil negatif pada kelinci (tidak terjadi kenaikan suhu)  aman pada manusia.

 Syarat hewan uji yg akan dipakai : sehat, lingkungan dan makanan terkontrol. Temperatur kelinci-kelinci yg digunakan tidak boleh berbeda lebih dari 1 derajat satu dg lainnya dan konstan.

 Ringkasan prosedur : bebaskan alat suntik,jarum dan alat gelas dg pemanasan 250o_{C selama 30 menit atau cara lain yg sesuai,}

1. Test terhadap Kelinci.

 Tes pirogen menurut FI Ed. III sebagai berikut :

Tes menggunakan sekelompok hewan percobaan, yaitu 3 ekor kelinci yg memenuhi syarat. Suhu bahan uji 38,5oC . Suntikkan bahan uji pada vena telinga setiap kelinci tidak kurang dari 0.5 ml dan tidak lebih dari 10 ml per kg berat badan . Catat temperatur badan pada 1,2,dan 3 jam sesudah penyuntikan.

Tabel hasil uji pirogen

UJI PIROGEN

Jumlah kelinci Bahan uji memenuhi syarat bila jumlah

respon tidak melebihi (o_{C) syarat bila jumlah respon tidak} Bahan uji tidak memenuhi

melebihi (o_C)

3 1.20 2.7

6 2.80 4.3

2. Test Limulus.

 Lisat yg diperoleh dari butir darah kepiting , Limulus polyphemus mengandung sistem enzim dan protein.

 Apabila ada liposakarida dalam jumlah kecil dari pirogen bakteri maka akan terjadi penggumpalan. Test hanya memerlukan waktu 90 menit . Hasil poitif menjadi bukti adanya pirogen..

 Adanya penggumpalan/koagulasi dikembangkan menjadi reaksi warna yg oleh FDA  metode LAL ( Limulus Amebocyte Lysate ).

PENGUJIAN OBAT SUNTIK

( In Process Control )

Menurut USA-FDA, ada 6 sistem kontrol

kualitas dalam pembuatan obat suntik untuk

mendapatkan kualitas obat suntik yang baik

sebagai berikut:

1. Sistem dan dokumen yang berkualitas serta

petugas yang pandai dan memiliki kemampuan

2. Fasilitas dan perlengkapan yang terkontrol baik

3. Material yang bermutu

4. Sistem packaging yang baik

5. Laboratorium QC yang baik

6. Sistem produksi yang baik

Jumlah sampel obat suntik yang di uji

atau di evaluasi dari total produksi dan

hasil yang diperbolehkan rusak

JUMLAH PRODUKSI JUMLAH

SAMPEL JML SAMPEL YANG DIPERBOLEHKAN RUSAK 151 – 280 32 1 281 – 500 50 2 501 – 1200 80 3 1201 – 3200 125 5 3201 – 10000 200 7 10001- 35000 315 10

OBAT SUNTIK YANG TELAH

DIPRODUKSI MEMERLUKAN

PENGUJIAN KUALITAS OBAT

SUNTIK MELIPUTI:

1. Kekedapan

Ampul dikumpulkan dalam bak 3 liter dan di

masukkan larutan metilen blue (0,08 – 0,09%), yang dicampur dengan 0,9% benzyl alkohol dan 3 ppm

sodium hypoclorite. Kemudian, bak ditutup dan divakumkan dengan tekanan 70 mmHg selama

beberapa menit (tidak lebih dari 15 menit). Kemudian bak dinormalkan kembali, lalu dibuka. Perhatikan

apakah ampul diwarnai oleh larutan bahan pewarna atau setelah pencucian ampul diwarnai oleh bahan pewarna.

2. Kejernihan

Wadah diputar secara vertikal

berulang-ulang di depan suatu latar belakang yang

gelap dan sisinya diberi cahaya (1000 lux

– 1500 lux, dengan jarak 25 cm).

3. Zat aktif

4. Sterilitas

5. Pirogenitas

6. Volume

6. Volume

Pemeriksaan keseragaman volume dapat dilakukan dengan cara sbb:

 Lakukan pemeriksaan bobot jenis/density dari larutan

produk.

 Berdasarkan hasil perhitungan density buat korelasi antara

bobot dan volume.

 Timbang ampul/vial kosong yg telah diberi tanda/no urut.  Lakukan pengisian produk.

 Timbang ampul/vial yg telah diisi dengan produk.  Catat hasil penimbangan , korelasikan ke volume.

7. Keseragaman bobot

Hilangkan etiket 10 wadah, cuci

wadah, keringkan



_{Kemudian timbang}

satu persatu dalam keadaan terbuka



keluarkan isi wadah



_{cuci dengan air}



cuci dengan etanol 95%



_keringkan

pada 105



_{C ad.bobot tetap}



_dinginkan



_{timbang satu persatu}

8.

pH

9. Homogenitas

10. Toksisitas