UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA
VITRO TERHADAP
(Garcinia parvifolia
Plasmodium falcifarum
SKRIPSI
UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA
TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS
Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR
Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN
Oleh :
SUCI FITRIYANI
NPM: 2005210210
Dibuat untuk memperoleh Gelar Sarjana Farmasi pada
Universitas Pancasila
UNIVERSITAS PANCASILA
FAKULTAS FARMASI
JAKARTA
2010
UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN
DAUN ASAM KANDIS
PADA KULTUR
STRAIN W2
PERNYATAAN SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI
Saya yang bertandatangan di bawah ini menyatakan skripsi dengan judul ’UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2’ adalah karya saya sendiri dan belum diajukan untuk publikasi dalam bentuk apapun kepada pihak manapun. Informasi yang berasal atau dikutip adalah karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah dicantumkan dalam daftar rujukan di bagian akhir skripsi ini.
Jakarta, Juli 2010
Suci Fitriyani NPM : 2005210210
UNIVERSITAS PANCASILA FAKULTAS FARMASI JAKARTA
PERSETUJUAN SKRIPSI
NAMA : Suci Fitriyani NPM : 2005210210
PEMINATAN : FARMASI KLINIK DAN KOMUNITAS
JUDUL : UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parfivolia(Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2
Disetujui oleh :
Pembimbing
UNIVERSITAS PANCASILA FAKULTAS FARMASI JAKARTA
PENGESAHAN SKRIPSI
Judul
UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO
TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia
parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum
STRAIN D6 DAN STRAIN W2
OLEH: SUCI FITRIYANI NPM : 2005210210
Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Pancasila
Pada tanggal 02 Agustus 2010 Universitas Pancasila
Fakultas Farmasi Dekan
(Drs. I Wayan Redja, M.Chem., Apt.) Pembimbing :
1. Dr. Syamsudin, M.Biomed, Apt 1... Penguji:
1. Dra. Syarmalina., M.Si., Apt 1...
2. Dr. Ros Sumarny, M.S., Apt 2... 3. Prof. ris. Drh. Darmono, M.Sc. 3...
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan taufik, serta hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi dengan judul “UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO
TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2” diajukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi di Fakultas Universitas
Pancasila, Jakarta.
Dalam penulisan dan penyusunan skripsi ini, penulis telah banyak menerima bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena itu penulis menyampaikan rasa hormat dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Syamsudin, M. BIOMED, Apt, selaku dosen pembimbing skripsi yang dengan sabar, tulus dan ikhlas telah memberikan waktu, tenaga serta pikirannya dalam mengarahkan dan membimbing penulis dalam penyusunan skripsi.
Ucapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga disampaikan kepada:
1. Bapak Drs. I Wayan Redja, M.Chem, Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi Universitas Pancasila
2. Ibu Dr. Shirly Kumala, M.Biomed., Apt., selaku Pembantu Dekan I Fakultas Farmasi Universitas Pancasila,
3. Ibu Dra. Erlindha gangga, Msi., Apt., selaku Dosen Pembimbing Akademik. 4. Ayah, ibu dan adikku tersayang, yang telah memberikan dukungan moral, doa,
kasih dan sayangnya selama penulis melakukan penelitian.
5. Seluruh pihak yang telah membantu, yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu.
Akhir kata, penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi penelitian dan pengembangan ilmu pengetahuan.
Jakarta, Juli 2010 Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR ... iv
DAFTAR ISI ... v
DAFTAR TABEL... viii
DAFTAR GAMBAR ... ix
DAFTAR SINGKATAN... xi
DAFTAR LAMPIRAN ... xii
ABSTRAK ... xiii BAB I PENDAHULUAN A. Latar Belakang ... 1 B. Perumusan Masalah ... 2 C. Tujuan Penelitian ... 2 D. Manfaat Penelitian ... 3
BAB II TINJAUAN PUSTAKA A. Asam Kandis ... 4 1. Klasifikasi Tanaman... 4 2. Sinonim ... 4 3. Nama Daerah ... 4 4. Deskripsi ... 4 B. Xanton ... 5 C. Kromatografi... 6 D. Ekstraksi ... 7 E. Malaria ... 8 1. Epidemiologi malaria... 8
2. Spesies parasit malaria... 9
F. Landasan teori ... 14
BAB III RANCANGAN PENELITIAN A. Prinsip Penelitian ... 16
B. Bahan penelitian ... 16
C. Tempat penelitian ... 16
D. Prosedur penelitian ... 16
E. Analisis data ... 17
BAB IV BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN A. Bahan... 18
B. Alat ... 19
C. Metode Penelitian... 19
1.Identifikasi ekstrak... 19
2.Pembuatan kultur P. falcifarum... 22
3. Preparasi bahan uji ... 23
4. Sinkronisasi ... 23
5. Uji aktivitas plasmodium ... 24
BAB V HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN 1. Identifikasi ekstrak ... 26
a. Penapisan fitokimia ... 26
b. Analisis dengan KLT ... 26
2. Pengujian aktivitas antiplasmodium ... 36
a. Metode Mikroskopik ... 36
b. Metode SYBR Green I ... 45
BAB VI SIMPULAN DAN SARAN A. Simpulan ... 50
DAFTAR RUJUKAN ... 51 LAMPIRAN... 53
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel V.1 Senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kloroform
dan ekstrak metanol daun asam kandis ... 26 Tabel V.2 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 (%) dari
ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis
pada berbagai konsentrasi ... 36 Tabel V.3 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain W2 (%) dari
ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis
pada berbagai konsentrasi ... 40 Tabel V.4 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 dan strain
W2 (%) dari klorokuin pada berbagai konsentrasi ... 44 Tabel V.5 Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak
kloroform daun asam kandis pada berbagai konsentrasi ... 45 Tabel V.6 Nilai linearitas fluoresensi pada P. falcifarum dari ekstrak
metanol daun asam kandis pada berbagai konsentrasi ... 45 Tabel V.7 Nilai linieritas fluoresensi pada P. falcifarum dari klorokuin
pada berbagai konsentrasi ... 46 Tabel V.8 Nilai IC50 dari tiap ekstrak daun asam kandis ... 46
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar II.1 Garcinia parvifolia (Miq)Miq ... ... 5
Gambar II.2 Rumus umum xanton ... ... 5
Gambar II.3 Daerah geografi penyebaran malaria didunia ... ... 9
Gambar II.4 Stadium-stadium perkembangan P. falcifarum ... ... 10
Gambar II.5 Siklus perkembangan P. falcifarum ... ... 14
Gambar IV.1 Gambaran lempeng sumur mikro uji aktivitas antiplasmodium... 25
Gambar V.1 Profil bercak KLT ekstrak kloroform………... 27
Gambar V.2 Profil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniak. 28 Gambar V.3 Profil bercak KLT ekstrak kloroform disemprot denganpereaksi Liebermann Burchard………... 29
Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfat.30 Gambar V.5 Profil bercak KLT ekstrak metanol………...………... 32
Gambar V.6 Profil bercak KLT ekstrak metanol diuapi dengan uap amoniak…. 33 Gambar V.7 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi Liebermann- Burchard………... 34
Gambar V.8 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi serium sulfat... 35
Gambar V.9 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan probit... 37
Gambar V.10 P. falcifarum strain D6 ekstrak kloroform daun asam kandis dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi……….... 38
Gambar V.11 P. falcifarum strain D6 ekstrak metanol daun asam kandis dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi……….. 39
Gambar V.12 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan probit... 41
Gambar V.13 P. falcifarum strain W2 ekstrak kloroform daun asam kandis dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi……….. 42
Gambar V.14 P. falcifarum strain W2 ekstrak metanol daun asam kandis dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi……….. 43 Gambar V.15 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan
DAFTAR SINGKATAN
1. CCM : Complete Culture Medium 2. DNA : Deoxyribonucleatid Acid
3. HEPES : N-(2-hydoroxyethyl) piperazine-N’-(2-ethaneculfonic acid) 4. IC50 : 50 % inhibitory Concentration
5. LAF : Laminary Air Flow
6. RPMI : Roswell Park Memorial Institute 7. WHO : World Health Organization
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Hasil determinasi daun asam kandis... 53 Lampiran 2. Skema pembuatan ekstrak daun asam kandis…………...………… 54 Lampiran 3. Skema kerja pembuatan kultur P. falcifarum……… 55 Lampiran 4. Skema pengujian aktivitas antiplamodium (metode mikroskopi)….. 56 Lampiran 5. Skema pengujian aktivitas antiplamodium (metode SYBR Green I) 57 Lampiran 6. Foto bahan uji antiplasmodium……….. 58 Lampiran 7. Foto alat uji antiplasmodium……….. 59 Lampiran 8. Gambar grafik dari metode SYBR Green I... 61 Lampiran 9. Jumlah skizon hidup dalam seluruh jumlah sel dalam area pandang Mikroskop……… 63 Lampiran 10. Tabel probit………. 65
ABSTRAK
(A) SUCI FITRIYANI (2005210210)
(B) UJI AKTIVITAS ANTIPLASMODIUM SECARA IN VITRO TERHADAP EKSTRAK DAUN ASAM KANDIS (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) PADA KULTUR Plasmodium falcifarum STRAIN D6 DAN STRAIN W2
(C) xiv + 65 Halaman; 8 tabel; 21 gambar; 7 singkatan; 10 lampiran (D) Kata Kunci : Antiplasmodium, daun asam kandis, kultur P. falcifarum
Resistensi antiplasmodium terhadap obat malaria mendorong untuk dilakukan pengembangan terhadap obat baru. Salah satunya adalah daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) yang digunakan sebagai obat alternatif karena mengandung senyawa xanton. Tujuan penelitian ini untuk mengetahui aktivitas antiplasmodium dari ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan menggunakan metode mikroskopik dan SYBR Green I yang ditunjukkan dengan nilai IC50. Daun asam kandis diekstraksi secara
berkesinambungan kemudian di uji aktivitas antiplasmodium secara in vitro dengan metode mikroskopik dan SYBR Green I. Pada metode mikroskopik, diperoleh nilai IC50 dari ekstrak kloroform 33,17 µg/mL pada strain D6 dan
0,55 µg/mL pada strain W2. Nilai IC50 dari ekstrak metanol 32,44 µg/mL pada
strain D6 dan 41,23 µ g/mL. Pada metode SYBR Green I diperoleh nilai IC50
dari ekstrak kloroform 14,29 µg/mL pada strain D6 dan 0,214 µg/mL pada strain W2. Nilai IC50 dari ekstrak metanol 48,00 µg/mL pada strain D6 dan
56,37 µg/mL pada strain W2. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) mempunyai aktivitas antiplasmodium terhadap kultur P. falcifarum strain D6 dan strain W2 pada metode mikroskopik dan metode SYBR Green I. Ekstrak kloroform mempunyai aktivitas antiplasmodium lebih kuat dari ekstrak metanol.
(E) Daftar Rujukan : 22 buah (1983-2009) (F) Dr. Syamsudin, M.Biomed.,Apt. (G) 2010
ABSTRACT
(A) SUCI FITRIYANI (2005210210)
(B) IN VITRO ANTI-PLASMODIUM ACTIVITY TEST ON LEAVES OF Garcinia parvifolia Miq ON CULTURE OF Plasmodium falcifarum strain D6 AND strain W2.
(C) xiv + 65 Pages; 13 tables; 12 figures; 6 abbreviations; 10 appendices
(D) Key words: Anti-plasmodium, leaves of Garcinia parvifolia Miq, culture of P.falcifarum
Malaria is the issue of world health either for developing or developed countries. Much P. falcifarum resistant to malaria medicine encourages people to improve new medicines. One of the medicines is leaves of G. parvifolio Miq that are used as alternative medicine because of containing xanton compound. The objective of this research is to know anti-plasmodium activity of G. parvifolio Miq leaves by means of microscopic and SYBR Green I methods shown by the value of IC50. Leaves of G. parvifolio Miq are
extracted by means of chloroform and methanol solvent then the anti-plasmodium activity is tested in in vitro by means of microscopic and SYBY Green I method. In microscopic method, the value of IC50 from chloroform
extract 33,17 µg/mL in strain D6 and 0,55 µg/mL in strain W2 is obtained. In SYBR Green I, the value of IC50 from methanol extract 48,00 µg/mL in strain
D6 and 56,37 in strain W2 is obtained. From this research, it can be inferred that chloroform and methanol extracts of G. parvifolia Miq leaves have anti-plasmodium activity on culture of P. falcifarum strain D6 and strain W2 on microscopic and SYBR Green I methods in which chloroform extract has stronger anti-plasmodium than methanol extract does.
(E) List of references: 22 references (1983-2009) (F) Dr. Syamsudin, M.Biomed.,Apt.
BAB I
PENDAHULUAN
A. Latar belakang
Malaria merupakan masalah kesehatan di dunia, baik pada negara berkembang maupun negara yang sudah maju. Penyakit malaria terjadi pada 105 negara dengan 300- 500 juta kasus malaria dan lebih dari satu juta jiwa kematian pada tiap tahunnya, sehingga kebutuhan obat malaria sangat diharapkan. Spesies yang banyak di jumpai di daerah tropis adalah P. falcifarum dan P. vivax yang mengakibatkan terdiagnosisnya infeksi malaria sampai 95 persen, P. vivax terdistribusi lebih luas dari pada P. falcifarum tetapi lebih sedikit kemungkinan terjadi kematian. Sedangkan P. malariae ditemukan di beberapa daerah namun prevalensinya sangat rendah. Di Indonesia, P. ovale hanya ditemukan didaerah Papua (1).
Malaria merupakan penyakit yang disebabkan oleh parasit yang ditularkan kepada manusia dan hewan. Vektor yang berperan pada penyakit ini adalah nyamuk Anopheles. Salah satu faktor utama penyebab kegagalan pemberantasan malaria adalah adanya nyamuk Anopheles yang resisten terhadap parasit malaria yakni Plasmodium yang resisten terhadap antimalaria yang tersedia. Masalah resistensi terhadap Plasmodium terutama pada Plasmodium falcifarum telah menjadi masalah serius. Hal ini telah mendorong para peneliti untuk berusaha menemukan antimalaria baru untuk menggantikan antimalaria yang sudah tidak sensitif lagi . Salah satu usaha untuk menemukan antimalaria baru tersebut adalah melalui eksplorasi senyawa aktif dari bahan obat alam utamanya tanaman obat yang secara tradisional digunakan masyarakat untuk mengobati malaria di berbagai daerah endemik di dunia (2).
Senyawa xanton diketahui memiliki aktivitas farmakologi yang luas antara lain : antimikroba, anti kanker, antioksidan, dan antimalaria. Beberapa penelitian senyawa turunan xanton dari tanaman genus Garcinia telah berhasil di uji
aktivitasnya antara lain : garciniaxanton dan cowaxanton dari tanaman G. dulcis dan G. cowa yang mempunyai aktivitas antiplasmodium paling kuat dengan IC50
berturut-turut sekitar 0,96 µg/ml dan 1,5µg/ml (3).
Pada penelitian sebelumnya menunjukkan ekstrak kulit batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) mempunyai aktivitas antiplasmodium yang kuat (4). Ektraksi bertingkat dari serbuk kulit batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan menggunakan pelarut dengan tingkat kepolaran yang berbeda yaitu n-heksana, etil asetat, dan ekstrak n-butanol. Pada uji anti plasmodium baik secara in vitro pada kultur P. falcifarum strain FCR-3 dan 3D7 maupun uji in vivo yang diinfeksi dengan P. berghei menggunakan ekstrak n-heksana kulit batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) pada mencit menggunakan ekstrak n-heksana kulit batang asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) lebih efektif dibanding ekstrak etil asetat dan ekstrak n-butanol (5). Pada penelitian ini dilakukan uji antiplasmodium secara invitro terhadap daun asam kandis pada kultur P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan W2 (resisten klorokuin), diharapkan dapat diketahui aktivitas antiplasmodium ekstrak tersebut terhadap P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan W2 ( resisten klorokuin).
B. Perumusan masalah
Apakah pada ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) memiliki efek antiplasmodium terhadap kultur P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin) dengan menggunakan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I?
C. Tujuan Penelitian
Untuk mengetahui aktivitas antiplasmodium dari ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dengan menggunakan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I yang ditunjukkan dengan nilai IC50.
D. Manfaat Penelitian
Diharapkan dapat mendorong penemuan anti malaria yang berasal dari tumbuhan, khususnya dari tumbuhan keluarga Guttiferae.
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
A. Asam Kandis (Garcinia parvifolia (Miq)Miq) (6)
1. Klasifikasi Tanaman
Divisi : Spermatophyta Sub Divisi : Angiospermae Kelas : Dicotyledoneae Bangsa : Parietales Suku : Guttiferae Marga : Garcinia
Jenis : Garcinia Parvifolia (Miq)Miq Nama Umum : Asam Kandis
2. Sinonim
Garcinia dioica blume Garcinia globulosa ridley Garcinia motletana pierre
3. Nama Daerah
Kandis, Kandis Burung, Sempat Tebu 4. Deskripsi
Habitus : Pohon tinggi, tinggi 12-15 m dan besar batangnya 45 cm, tumbuh di dataran Sumatra.
Kayu : Kayu berwarna kekuning-kuningan, agak keras dan awet, tetapi mudah rapuh dan hanya dapat diperoleh dalam ukuran kecil-kecil jika ditoreh akan keluar eksudat yang berwarna kuning buram.
Getah Buah Daun Bunga B. Xanton
Xanton adalah pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya dan hasil kromatografinya sama dengan flavonoid (8). Golongan xanton mempunyai rumus umum dibenzogamapiron.
: Getah kayunya mengandung getah kuning yang sangat banyak, yang mengeras menjadi gumpalan
pada batang.
: Buahnya yang berwarna kuning jingga sebesar buah tempuyung, agak bulat atau panjang.
: Permukaan daun kasar dan dari dasar daun daun meruncing.
: Bunga jantan, panjang tangkai 4-10 mm, luas lingkar tangkai 7-10 mm.
Gambar II.1 Garcinia parvifolia (Miq)Miq (7)
Xanton adalah pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya dan hasil kromatografinya sama dengan flavonoid (8). Golongan xanton mempunyai rumus umum dibenzogamapiron.
Gambar II.2 Rumus Umum Xanton ( 9)
Getah kayunya mengandung getah kuning yang sangat banyak, yang mengeras menjadi gumpalan-gumpalan kecil : Buahnya yang berwarna kuning jingga sebesar buah : Permukaan daun kasar dan dari dasar daun hingga ujung 10 mm, luas lingkar
Xanton adalah pigmen fenol kuning yang reaksi warnanya dan hasil kromatografinya sama dengan flavonoid (8). Golongan xanton mempunyai rumus
Beberapa senyawa turunan xanton telah berhasil diisolasi dari tanaman genus Garcinia dan dibuktikan aktivitas antiplasmodiumnya. Likhitwitayawuid et al. berhasil menguji aktivitas beberapa turunan xanton dari tanaman G. dulcis dan G. cowa. Diantara turunan xanton yang diuji, garciniaxanton dan cowaxanton mempunyai aktivitas antiplasmodium paling kuat dengan nilai IC50 (konsentrasi
hambatan maksimal yang dapat menghambat pertumbuhan 50% dari plasmodium) berturut-turut sekitar 0,96µg/ml dan 1,5 µg/ml (3).
C. Kromatografi
Kromatografi lapis tipis (KLT) adalah cara pemisahan campuran zat menggunakan sebuah lapisan tipis bahan penyerap, karena menggunakan lapisan tipis maka prosedurnya disebut Kromatografi Lapis Tipis. Campuran zat ditempatkan pada satu ujung lapisan bahan penyerap, kemudian dengan bantuan cairan rambat digerakkan ke ujung lainnya sampai batas tertentu, batas ini disebut batas rambat. Selama perjalanan dari satu ujung ke ujung yang lain terjadi pemisahan dari campuran zat, yang disebabkan oleh perbedaan sifat antara zat-zat tersebut. Ada zat-zat yang tetap tinggal dititik permulaan, ada zat-zat yang merambat sampai setengah perjalanan dan ada pula yang bergerak terus sampai mencapai batas rambat. Pemisahan dianggap berhasil bila zat-zat dapat terpisah satu sama lain sepanjang lapisan bahan penyerap.
Bahan penyerap disebut juga fase diam, fase stasioner atau fase tidak bergerak, sebab bahan ini memang tetap tinggal diam selama proses kromatografi. Sebaliknya cairan rambat disebut sebagai fase bergerak karena merambat perlahan-lahan dari ujung lempeng ke ujung yang lain. Dan pada umumnya silika gel biasa digunakan sebagai bahan penyerap.
Fase gerak (cairan rambat, cairan eluasi atau cairan pengembang) ialah medium angkut dan terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Fase gerak bergerak di dalam fase diam, yaitu suatu lapisan berpori, karena ada gaya kapiler. Fase gerak biasanya berupa zat organik mudah menguap, komposisinya sangat beragam, ada yang terdiri dari satu zat organik, ada yang berupa campuran dua zat organik atau lebih, semuanya tergantung pada keperluan sifat dari campuran zat yang akan
dipisahkan. Cairan pengembang yang banyak digunakan: n-heksana, heptana, sikloheksana, karbontertraklorida, benzena kloroform, eter, etil asetat, piridina, aseton, etanol, metanol, air (10).
D. Ekstraksi
Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan pelarut cair. Simplisia yang diekstrak mengandung senyawa aktif yang dapat larut dan senyawa yang tidak dapat larut seperti serat, karbohidrat, protein, dan lain-lain. Senyawa aktif yag terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan ke dalam golongan flavonoid, minyak atsiri, dan lain-lain. Dengan diketahuinya senyawa aktif yang dikandung simplisia akan mempermudah pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat. Simplisia yang lunak seperti daun dan rimpang mudah diserap oleh pelarut, karena itu pada proses ekstraksi tidak perlu diserbuk sampai halus (8). Metode Ekstraksi, antara lain :
1) Cara Dingin a. Maserasi
Maserasi adalah proses pengekstraksian simplisia dengan menggunakan pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan (kamar). Secara teknologi termasuk ekstraksi dengan prinsip metode pencapaian konsentrasi pada keseimbangan. Maserasi kinetik berarti dilakukan pengadukan yang kontinu (terus menerus). Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya.
b. Perkolasi
Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna (exhaustive extraction) yang umumnnya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan / penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahannya.
2) Cara Panas a. Refluks
Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah terbatas yang relatif konstan dengan adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna
b. Soxhletasi
Soxhletasi adalah ekstraksi menggunakan pelarut yang selalu baru yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga terjadi ekstraksi kontinu dengan jumah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik.
c. Digesti
Digest adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu) pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum dilakukan pada temperatur 40-50o C.
d. Infus
Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air (bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96-98o C) selama waktu tertentu (15-20 menit)
e. Dekok
Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≥30 menit) dan temperatur sampai titik didih air (8,11).
E. Malaria
1. Epidemiologi Malaria
Di negara tropis maupun subtropis, hingga saat ini malaria masih menjadi masalah kesehatan lebih dari 40 % atau 2,1 miliyar penduduk dunia di perkirakan tinggal di daerah yang mempunyai resiko tinggi terkena malaria. Tercatat 273 juta kasus penderita malaria di diagnosis secara klinis setiap tahunnya. Kematian yang ditimbulkan akibat malaria mencapai 2 juta
pertahun yang terjadi terutama pada anak-anak dan ibu hamil (12). Di Indonesia, di perkirakan sebanyak 2 orang dari 100.000 populasi mengalami kematian akibat penyakit malaria. Hampir semua propinsi di Indonesia mempunyai daerah endemis malaria, walaupun tingkat endemisitinya berbeda-beda (13).
Gambar II.3 Daerah geografi penyebaran malaria di dunia (14)
2. Spesies Parasit Malaria
Penyebab malaria di indonesia sampai saat ini ada empat macam plasmodium, yaitu : P. falciparum, P. vivax, P. malariae dan P. ovale. Seorang penderita dapat ditulari oleh lebih dari satu jenis plasmodium yang disebut infeksi campuran (mixed infection) misalnya infeksi oleh P. falcifarum dengan P. vivax atau P. malariae. Infeksi campuran tiga jenis parasit jarang terjadi. Dari keempat parasit tersebut, P. falciparum yang sering menyebabkan malaria dengan gejala klinis berat sampai dapat menimbulkan kematian (15).
Pada P. falciparum ukuran eritrosit terinfeksi normal, dan sering terdapat lebih dari satu bentuk cincin didalam eritrosit. Bentuk tropozoit awal sering terlihat di darah tepi, sedang skizon banyak terdapat di organ-organ dan otot,
jarang atau hanya sedikit dapat di temukan di darah tepi dan bentuknya seperti topi dengan ukuran lebih kecil dari skizon P. vivax, dan mengandung banyak merozoit. Didalam eritrosit kadang ada endapan sitoplasma yang dinamakan titik-titik maurers merupakan bercak-bercak merah dengan distribusi ireguler atau berbentuk celah-celah, ciri khas lain adalah pada sitoplasma terdapat pseudopodia yang tampak pada lapisan darah. Parasit malaria P. falciparum mengalami tiga perubahan morfologik yang berbeda selama siklus 24 dan 72 jam dalam eritrosit manusia. Setelah invasi kedalam eritrosit, parasit menjadi matur kedalam stadium cincin. Pertumbuhan berikutnya kedalam stadium tropozoit yang di tandai oleh perubahan morfologi dan biokimia pada membran plasma inang. Selanjutnya terjadi maturasi parasit tropozoit kestadium skizon.
Daur hidup Plasmodium terdiri dari fase seksual eksogen (sporogoni) dalam badan nyamuk Anopheles dan fase aseksual (skizogoni) dalam badan hospes vertebrata.
a. Parasit dalam hospes vertebrata 1) Fase jaringan
Bila nyamuk Anopheles betina yang mengandung parasit malaria dalam kelenjar liurnya menusuk hospes, sporozoit yang berada dalam air liurnya masuk melalui probosis yang ditusukkan kedalam kulit. Sporozoit segera masuk dalam peredaran darah dan setelah ½ jam sampai 1 jam masuk kedalam sel hati. Sebagian sporozoid masuk ke sel hati dan berkembang biak proses ini disebut skizogoni pra-eritrosit. Inti parasit membelah diri berulang-ulang disertai oleh pembelahan sitoplasma yang mengelilingi setiap inti sehingga terbentuk beribu-ribu merozoit berinti satu. Pada akhir fase pra-eritrosit, skizon pecah, merozoit keluar dan masuk di peredaran darah, sebagian besar menyerang eritrosit yang berada di sinusoid hati tetapi beberapa difagositosit. Pada P. vivax dan P. ovale sebagian sporozoit yang menjadi hipnozoit setelah beberapa waktu (beberapa bulan sampai 5 tahun) menjadi aktif kembali dan mulai dengan skizogoni eksoeritrositik sekunder.
2) Fase aseksual dalam darah
Waktu antara permulaan infeksi sampai parasit malaria ditemukan dalam darah pertama kalinya karena jumlah parasit telah melewati ambang mikroskopik disebut masa pra-paten, masa ini dapat dibedakan dengan masa tunas atau masa inkubasi yang berhubungan dengan timbulnya gejala klinis penyakit malaria. Masa tunas terbagi menjadi dua yaitu masa tunas intrinsik dan masa tunas ekstrinsik. Masa tunas intrinsik pada malaria adalah waktu antara sporozoit masuk dalam tubuh hospes sampai timbul gejala demam biasanya berlangsung 8-37 hari. Masa tunas ekstrinsik adalah waktu antara nyamuk menghisap
darah yang mengandung gametosit sampai mengandung sporozoit dalam kelenjar liurnya. Merozoid yang dilepaskan oleh skizon jaringan mulai menyerang eritrosit. Stadium termuda dalam darah berbentuk bulat, kecil; beberapa diantaranya mengandung vakuola. Stadium muda ini disebut tropozoid. Kemudian parasit berkembang biak secara aseksual melalui proses pembelahan yang disebut skizogoni. Inti parasit membelah diri menjadi sejumlah inti yang lebih kecil, kemudian dilanjutkan dengan pembelahan sitoplasma untuk membentuk skizon skizon matang mengandung bentuk-bentuk bulat kecil, terdiri dari inti dan sitoplasma yang disebut merozoid. Setelah skizogoni selesai, eritrosit dan merozoid dilepaskan dalam aliran darah (sporulasi), kemudian merozoid memasuki eritrosit baru dan generasi lain dibentuk dengan cara yang sama. Pada daur eritrosit, skizogoni berlangsung secara berulang-ulang selama infeksi dan menimbulkan parasitemia yang meningkat dengan cepat sampai proses dihambat oleh imun hospes.
3) Fase seksual dalam darah
Setelah 2 atau 3 generasi (3-15 hari) merozoid dibentuk, sebagian merozoit tumbuh menjadi bentuk seksual. Proses ini disebut gametogoni (gametogenesis). Bentuk seksual tumbuh tetapi intinya tidak membelah. Gametosit mempunyai bentuk yang berbeda pada berbagai spesies: pada P. falcifarum bentuknya seperti sabit atau pisang, pada spesies lain bentuknya bulat.
b. Parasit dalam hospes invertebrata 1) Eksflagetasi
Bila nyamuk Anopheles betina menghisap darah hospes manusia yang mengandung parasit malaria, parasit aseksual dicerna bersama dengan eritrosit, tetapi gametosit dapat tumbuh terus. Inti pada mikrogametosit membelah menjadi 4 sampai 8 yang masing-masing menjadi bentuk panjang seperti benang (flagel) dengan ukuran 20-25 mikron, menonjol
keluar dari sel induk, bergerak-gerak sebentar dan kemudian melepaskan diri. Flagel atau gamet jantan disebut mikrogamet; makrogametosit mengalami proses pematangan (maturasi) dan menjadi gamet betina atau makrogamet. Dalam lambung nyamuk mikrogamet tertarik oleh makrogamet yang membentuk tonjolan kecil tempat masuk mikrogamet sehingga pembuahan dapat berlangsung. Hasil pembuahan disebut zigot.
2) Sporogoni
Pada permulaan, zigot merupakan bentuk bulat tidak bergerak, tetapi dalam waktu 18-24 jam menjadi bentuk panjang dan dapat bergerak; stadium seperti cacing ini berukuran panjang 8-24 mikron dan disebut ookinet. Ookinet kemudian menembus dinding lambung melalui sel epitel ke permukaan luar lambung dan menjadi bentuk bulat, disebut ookista. Ookista makin lama makin besar dan kemudian pecah, ribuan sporozoit dilepaskan dan bergerak dalam rongga badan nyamuk untuk mencapai kelenjar liur, nyamuk betina sekarang menjadi infektif. Bila nyamuk ini menghisap darah setelah menusuk kulit manusia, sporozoit dimasukkan ke luka tusuk dan mencapai aliran darah hospes perantara. Sporogoni yang dimulai dari pematangan gametoist sampai menjadi sporozoit infektif, berlangsung selama 8 sampai 35 hari, bergantung pada suhu luar dan spesies parasit (19).
Gambar II.5 siklus perkembangang P. falcifarum (18)
3. Strain D6 dan strain W2
Berdasarkan prosedur standar protokol dari WHO untuk menguji obat antimalaria tehadap parasit malaria secara in vitro digunakan klon Sierra Leone/D6 yang merupakan strain dari parasit malaria yang sensitif terhadap klorokuin dan klon Indochina/W2 yang merupakan strain dari parasit malaria yang resisten terhadap klorokuin. Selanjutnya kedua klon ini dikultur dalam medium kultur jaringan dan digunakan secara teratur pada pengujian di laboratorium malaria untuk penelitian antimalaria dengan menggunakan berbagai metode (19).
F. Landasan Teori
1. Serbuk daun asam kandis diekstraksi secara berkesinambungan dengan pelarut yang berbeda kepolarannya yaitu kloroform dan metanol dengan tujuan untuk prefraksinasi awal.
2. Pada penelitian sebelumnya, ekstrak n-heksana, etil asetat dan n-butanol dari kulit batang asam kandis mempunyai aktivitas antiplasmodium terhadap strain FCR-3 dan 3D7.
3. Untuk menguji aktivitas antiplasmodium secara in vitro digunakan P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin) dengan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I.
4. Ekstrak daun asam kandis mengandung senyawa xanton yang dapat berfungsi sebagai anti malaria.
BAB III
RENCANA PENELITIAN
A. Prinsip Penelitian
Penelitian merupakan penelitian eksperimental secara in vitro, efek dari ekstrak daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dilihat berdasarkan aktivitas hambatan pertumbuhan dari P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin) pada kultur.
B. Bahan Penelitian
Bahan Penelitian adalah daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) yang diperoleh dari Desa Nangkalis Kab. Kapuas Hulu, Kalimantan Barat di determinasi di Herbarium Bogoriensis Botani, LIPI Bogor.
C. Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan di Laboratorium Penelitian Skripsi Fakultas Farmasi Universitas Pancasila dan di Laboratorium NAMRU-2 bagian Parasitic Diseases, Program, Badan Litbang Kesehatan, Jakarta.
D. Prosedur Penelitian 1. Pengumpulan bahan 2. Pembuatan simplisa 3. Pembuatan ekstrak 4. Identifikasi ekstrak 5. Pembuatan kultur 6. Preparasi bahan uji
7. Uji aktivitas antiplasmodium
E. Analisis Data
Hasil yang diperoleh dalam penelitian dianalisis sebagai berikut : 1. Metode mikroskopik
Data ditampilkan dalam bentuk tabel % hambat pertumbuhan. Konsentrasi penghambatan 50 % (IC50) ditetapkan dengan analisa probit berdasarkan
hubungan log konsentrasi dan nilai probit.
Angka parasitemia = Jumlah eritrosit yang terinfeksi parasit x 100% Jumlah eritrosit yang diamati
% Hambat = Kontrol – Angka parasitemia x 100% Kontrol
2. Metode SYBR Green I
Data ditampilkan dalam bentuk tabel log konsentrasi dan linieritas fluoresensi. Konsentrasi penghambatan 50 % (IC50) didapatkan dengan
memasukkan data antara log konsentrasi dan linieritas fluoresensi ke dalam program Microsoft Excel. Selanjutnya data dianalisis dengan regresi non linier menggunakan Software Graphad Prism (San Diego, CA)
BAB IV
BAHAN, ALAT DAN METODE PENELITIAN
A. Bahan
1. Bahan utama penelitian
Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol dari daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq, biakan parasit P. falcifarum strain D6 (sensitif klorokuin) dan strain W2 (resisten klorokuin).
2. Bahan pereaksi a. CCM
RPMI 1640 (Gibco BRL, Cat.No:31800-014), HEPES (Sigma, Cat. No:H-3375), Natrium bicarbonat, Gentamicin Sulphate Solution 50 mg/mL (Sigma, G-1522).
b. Uji aktivitas antiplasmodium
CCM, Natrium klorida 3,5 %, sorbitol 500 g (Sigma, Cat.No:5-3889), Giemsa 10 % (merk, Cat.No:1.09204.0500), Methanol pro analysis (Merk,Cat.No:1.06009.2500),Microscopy immersion oil (Merk, Cat.No:1.04699.0500), Hypoxanthine (Sigma, Cat.No:H9377), Lysis buffer, SYBR Green I stock solution (Molecular Probes Inc, Cat.No:S-7563), sel darah manusia golongan O+, serum darah manusia golongan O+. c. Identifikasi ekstrak
Ammoniak 30 %, kloroform, asam klorida pekat, serbuk magnesium, amil alkohol, natrium hidroksida 1 N, besi (III) klorida 1%, natrium asetat, eter, asam asetat anhidrat, asam sulfat pekat, petroleum eter, pereaksi Dragendorff, pereaksi Mayer, pereaksi stiassny, pereaksi Liebermann-Burchard, pereaksi semprot serium sulfat.
B. Alat
Saringan milipore 0,2µm (Nalgene disposable filterware, Cat.No:120-0020), Water-bath (Fisher scientific, Cat.No:15-458-106), Candle jar (Pyrex), Inkubator (NAPCO, Cat.No:G101FC1), Laminary Air Flow (Biogard Hood The Baker Company, model:315, Type:A2,Class:II, Cat.No:BM18502) Cultur Flask / Lempeng kultur (Corning Flask. Cat.No:430168), 96 Well cell Cultur Cluster / mikroplate dengan 96 sumuran (Costar, Cat.No:3596), Screw capped conical tubes 15 mL (Labcon, Cat.No:3131-345008), Mikro pipet (P20, P50,P100 µ L) (Gilson), yellow tip dan blue tip 20 µ L, 50 µ L, 100 µ L (Hydrologix pipet tips, Cat.No:3920), mikroskop (NICON Eclipse E400 dan NICON Eclipse E600), gelas obyek (Diagger 4591, Cat.No:615978A), fluorescence plate reader (infinite 200), tissue culture disk, ukuran:60x15mm polystrene 20/slave (Corning, Cat.No:steril 25010), disposable serological pipet 1mL, 2mL, 5mL, 10mL non pyrogenic polystrene individually wrapped steril (Costar, Cat.No:4051), pipet tetes (Brand, Cat.No:747720), tabung sterilisasi pipet tetes (Bellco, Cat.No:B38), tabung effendorf, Lab count denominator, bejana kromatografi, lempeng KLT.
C. Metode penelitian
1. Identifikasi Ekstrak
a. Penapisan fitokimia terhadap ekstrak 1) Identifikasi golongan alkaloid
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dilembabkan dengan 5 mL ammonia 30 % dan digerus dalam mortir. Setelah itu ditambahkan 20 mL kloroform, gerus kembali dengan kuat, campuran tersebut disaring dengan kertas saring. Filtrat berupa larutan organik diambil (sebagai Larutan A). Sebagian larutan A (10 mL) diekstraksi dengan asam klorida (1:10) dengan pengocokan dalam tabung reaksi, kemudian ambil fase asam (larutan B). sebagian larutan A diteteskan beberapa tetes pada kertas saring atau diteteskan dengan pereaksi Dragendorff, terbentuk warna merah atau jingga menunjukkan adanya alkaloid. Ke dalam dua tabung reaksi yang berisi 5 mL larutan B
ditambahkan beberapa tetes pereaksi Dragendorff terbentuk warna jingga atau endapan putih dengan pereaksi Mayer, membuktikan adanya alkaloid.
2) Identifikasi golongan flavonoid
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ditambahkan dengan 100 mL air panas, didihkan selama 5 menit, kemudian saring dengan kertas saring, filtrat yang diperoleh akan digunakan sebagai larutan percobaan. Sebanyak 5 mL larutan percobaan dimasukkan kedalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan serbuk atau lempeng magnesium secukupnya dan 1 mL amil alkohol dikocok dengan kuat, dibiarkan hingga memisah, akan terbentuk warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan adanya senyawa golongan flavonoid.
3) Identifikasi golongan saponin
Sejumlah lebih kurang 10 mL yang diperoleh dari percobaan (b) diatas, dimasukkan kedalam tabung reaksi dan dikocok secara vertikal selama 10 detik, jika dibiarkan selama 10 menit terbentuk busa yang stabil dalam tabung reaksi menunjukkan adanya golongan saponin, bila diteteskan 1 tetes asam klorida 1 % (encer) busa tetap stabil. 4) Identifikasi golongan tanin
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ditmabahkan dengan 100 mL air panas, di didihkan selama 1 menit, didinginkan dan disaring dengan kertas saring dan filtrat dibagi menjadi dua bagian. Ke dalam filtrat yang pertama ditambahkan larutan besi (III) klorida 1 %, terbentuk warna biru tua atau hijau kehitaman menunjukkan adanya senyawa golongan tannin. Ke dalam filtrat yang kedua jika ditambahkan 15 mL peraksi stiassny (formaldehid 30 % - asam klorida pekat = 2 : 1), dipanaskan diatas penangas air, terbentuk endapan warna merah muda menunjukkan adanya tannin katekuat. Selanjutnya endapan disaring, filtrate dijenuhkan dengan natrium asetat, ditambahkan beberapa tetes
larutan besi (III) klorida 1 % terbentuk warna biru tinta menunjukkan adanya tannin galat.
5) Identifikasi golongan kuinon
Sejumlah lebih kurang 10 mL larutan percobaan yang diperoleh dari percobaan (b), dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Ditambahkan beberapa tetes larutan natrium hidroksida 1 N, terbentuk warna merah menunjukkan adanya senyawa golongan kuinon.
6) Identifikasi golongan steroid dan triterpenoid
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dimaserasi dengan 20 mL eter selama 2 jam (dalam wadah tertutup rapat), disaring dan diambil filtratnya, 5 mL dari filtrat tersebut diuapkan dalam cawan penguap hingga diperoleh residu atau sisa, ke dalam residu ditambahkan 2 tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat (pereaksi Liebermann-Burchard), terbentuk warna hijau menunjukkan adanya senyawa steroid dan warna merah menunjukkan adanya triterpenoid. 7) Identifikasi golongan minyak atsiri
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 mL pelarut petroleum eter dan dipasangkan corong gelas (yang diberi lapisan kapas yang telah dibasahi dengan air) pada mulut tabung, dipanaskan selama 20 menit diatas penangas air didinginkan, disaring dengan kertas saring, filtrat diuapkan pada cawan penguap, residu berbau aromatis atau menyenangkan, menunjukkan adanya senyawa golongan minyak atsiri.
8) Identifikasi golongan kumarin
Sejumlah lebih kurang 40 mg ekstrak dimasukkan ke dalam tabung reaksi dengan 10 mL pelarut kloroform yang dipasang corong (diberi lapisan kapas yang tekah dibasahi air) pada mulut tabung, selanjutnya dilakukan pemanasan selama 10 menit diatas penangas air dan didinginkan disaring dengan kertas saring, filtrat diuapkan pada cawan penguap sampai kering, sisa ditambah air panas. Sebanyak 10 mL filtrat didinginkan,larutan dimasukkan ke dalam tabung reaksi,
ditambahkan 0,5 mL larutan ammonia 10 %, diamati di bawah sinar lampu ultraviolet pada panjang gelombang 366 nm, maka tejadi fluoresensi warna biru atau hijau menunjukkan adanya golongan kumarin.
b. Analisa dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Ekstrak yang diperoleh dianalisa menggunakan kromatografi lapis tipis, dengan menotolkan 10 µ L sampel pada lempeng silika gel GF254 kemudian dieluasi. Cairan eluasi untuk ekstrak kloroform adalah n-heksana : etil asetat = 3 : 2 dan untuk ekstrak metanol adalah kloroform : etil asetat = 2 : 3. Bercak yang didapat diamati pada sinar biasa, UV 254 nm, dan 366 nm. Kemudian disemprot dengan pereaksi semprot serium sulfat, Liebermann-Burchardatt, dan uap amoniak. Bercak diamati pada sinar biasa, UV 254 nm, dan 366 nm.
2. Pembuatan kultur P. falcifarum
Prosedur penelitian berdasarkan Standard Operating Procedure Cultivation Of Plasmodium falciparum In Vitro (22) dan Malaria SYBR Green I-Based Fluorescence (MSF) Assay Protocol dari U.S. NAMRU-2 (23).
a. Thawing P. falcifarum
Ampul yang mengandung strain P. falcifarum diambil dari tabung nitrogen, dicairkan pada water bath 37o C selama beberapa menit. Isi ampul dipindahkan ke conical tube, ditambahkan larutan natrium klorida 3,5 %. Larutan dipindahkan ke dalam tabung sentrifugasi dan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rotasi per menit selama 7 menit. Supernatan di buang. Ditambahkan 0,15 mL CCM dan disentrifugasi dengan kecepatan 1500 rotasi per menit selama 7 menit, dihilangkan supernatan. Kemudian tambahkan CCM dan sel darah merah yang tidak terinfeksi. Tiap 1 mL suspensi di tambah 5 mL CCM dan dipindahkan 2 mL larutan suspensi kedalam lempeng kultur.
b. Pembuatan kultur P. falcifarum
P. falcifarum dibiakan dengan metode candle jar (Trager dan Jensen, 1976). Sel darah merah yang terinfeksi parasit dibiakan dalam lempeng kultur yang mengandung 4 mL CCM. Kultur tersebut dilakukan di dalam LAF dalam kondisi steril, kemudian di inkubasi di dalam inkubatorpada temperatur 37o C.
c. Mempertahankan kultur
Pergantian medium untuk mempertahankan kultur dilakukan tiap 24 jam dan dilakukan di dalam LAF dalam kondisi steril. Lempeng kultur di ambil dari dalam inkubator dan dimasukkan kedalam LAF. Medium lama dibuang dengan menggunakan pipet tetes steril tanpa mengambil sel darah merah yang terinfeksi. Kemudian dengan menggunakan pipet steril tambahkan 3,5 mL – 4 mL medium baru kedalam tiap-tiap lempeng kultur, kemudian homogenkan. Lempeng kultur dimasukkan ke dalam candle jar kemudian dimasukkan ke dalam inkubator suhu 37o C. Apabila angka parasitemia mencapai 6 - 8% maka kultur siap untuk di panen, selanjutnya mengikuti prosedur 4.
3. Preparasi bahan uji
Bahan uji (ekstrak daun asam kandis) sebanyak 5 mg dilarutkan dengan etanol sebanyak 3 mL sebagai larutan stock. Larutan stock ini kemudian di encerkan dengan RPMI 1640 sehingga didapatkan satu seri konsentrasi larutan uji 4, 20, 100, 200, dan 400 µg/mL.
4. Sinkronisasi
Untuk uji aktivitas antiplasmodium, parasit yang dipakai adalah stadium ring. Untuk proses sikronisasi, dipindahkan sel darah merah yang terinfeksi kedalam tabung sentrifugasi dan di sentrifugasi dengan kecepatan 1500-2000 putaran per menit selama 10 menit, supernatant dibuang. Larutan sorbitol 5 % ditambahkan ke dalam endapan parasit, dihomogenkan dan didiamkan selama 5 menit. Kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 1500-2000 putaran per menit selama 10 menit, supernatan dibuang. Kemudian CCM ditambahkan untuk membuat suspensi parasit sehingga endapan parasit yang hanya terdiri
dari stadium ring akan di peroleh. Parasit dikembalikan kedalam lempeng kultur dan di inkubasi pada suhu 37o C selama 48 jam.
5. Uji aktivitas antiplasmodium
Mikrokultur yang digunakan mempunyai 96 sumuran. Pada kolom pertama dimasukkan RPMI 1640 sebanyak 12,5 µ L, pada kolom dua sampai enam dimasukkan 12,5 µ L ekstrak kloroform dan kolom tujuh sampai sebelas dimasukkan 12,5 µ L ekstrak metanol dari konsentrasi rendah ke konsentrasi tinggi. Masing- masing sumuran diisi dengan 100 µ L kultur. Mikrokultur kemudian diletakkan candle jar. Agar terdapat konsentrasi gas optimal, candle jar ditutup rapat pada sewaktu nyala lilin di dalamnya akan mati, kemudian diinkubasi dalam inkubator pada temperatur 37o C selama 48 jam. Lempeng sumur mikro dikeluarkan, untuk metode mikroskop, suspensi bagian atas dibuang. Suspensi yang pekat dibuat sediaan apusan darah tebal dengan cara suspensi pekat dipipet kemudian diteteskan pada objek glass, apusan yang terbentuk dikeringkan selama 5-10 menit. Setelah kering ditambahkan pewarna giemsa 10 % pada apusan darah dan dibiarkan 15 - 20 menit, selanjutnya giemsa dicuci dengan air mengalir dan dikeringkan. Apusan yang terbentuk dapat dilihat pada mikroskop (perbesaran 100 kali) dengan menambahkan minyak emersi kemudian dihitung sel darah merah yang terinfeksi P. falcifarum setiap 200 sel darah merah dan dihitung angka % parasitemia. Untuk metode SYBR Green I, 100 µ L lisis buffer yang berisi SYBR Green I dimasukkan pada tiap-tiap sumuran. Lempeng sumur mikro diinkubasi dalam kondisi gelap selama 1 jam dan dibaca pada alat fluoresence plate reader.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H
Gambar IV.1. gambaran lempeng sumur mikro uji aktivitas antiplasmodium Keterangan :
= RPMI 1640
= diisi dengan berbagai konsentrasi (fase kloroform) = diisi dengan berbagai konsentrasi (fase metanol) A-B = Strain D6
BAB V
HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN
1. Identifikasi Ekstrak a. Penapisan fitokimia
Tabel V.1 senyawa-senyawa yang terkandung dalam ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis.
Senyawa kimia Ekstrak klorofom Ekstrak metanol
Alkaloid - - Flavonoid + + Saponin - + Tanin - - Kuinon - + Steroid/triterpenoid + + Minyak atsiri - - Kumarin + +
Keterangan : + : terdapat senyawa dalam ekstrak - : tidak terdapat senyawa dalam ekstrak
Tabel V.1 menunjukkan hasil penapisan fitokimia. Pada ekstrak kloroform diperoleh senyawa flavonoid, steroid/triterpenoid, dan kumarin. Sedangkan pada ekstrak metanol diperoleh senyawa flavonoid, saponin, kuinon, steroid/triterpenoid dan kumarin.
b. Analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Hasil analisis dengan KLT pada ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq)
1) Ekstrak kloroform
Gambar V.1 Profil bercak KLT pada ekstrak kloroform Keterangan : fase diam :
Pada Gambar V.1 dapat dilihat terdapat
kloroform jika dilihat dari sinar biasa. Pada sinar UV 245 nm terdapat 6 bercak, sedangkan pada UV 366 nm terdapat
Ekstrak kloroform
(A) (B)
(D) (E) (F) Gambar V.1 Profil bercak KLT pada ekstrak kloroform
Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Pada Gambar V.1 dapat dilihat terdapat 5 bercak pada ekstrak kloroform jika dilihat dari sinar biasa. Pada sinar UV 245 nm terdapat 6 bercak, sedangkan pada UV 366 nm terdapat
(B) (C)
(D) (E) (F)
: Pola bercak KLT pada sinar biasa : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm
Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
bercak pada ekstrak kloroform jika dilihat dari sinar biasa. Pada sinar UV 245 nm terdapat 6 bercak, sedangkan pada UV 366 nm terdapat 6 bercak.
Gambar V.2 P
Keterangan : fase diam
Pada gambar V.2 dapat dilihat terdapat 5
kecokelatan dilihat dari sinar biasa, pada sinar UV 254 terdapat bercak berwarna kuning sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat
(A) (B)
(D) (E) (F)
Gambar V.2 Profil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniak Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) :Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Pada gambar V.2 dapat dilihat terdapat 5 bercak
kecokelatan dilihat dari sinar biasa, pada sinar UV 254 terdapat bercak berwarna kuning sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat
(C)
(D) (E) (F)
rofil bercak KLT ekstrak kloroform diuapi dengan uap amoniak
: Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) :Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
bercak berwarna kuning kecokelatan dilihat dari sinar biasa, pada sinar UV 254 terdapat 6 bercak berwarna kuning sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat
6 bercak
panah) yang merupakan senyawa flavonoid.
Gambar V.3. Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi Keterangan : fase diam : silika gel
Pada Liebermann
bercak, dimana bercak kuning kehijauan ( ditunjukkan oleh panah) yang merupakan senyawa flavonoid.
(A) (B)
(D) (E) (F)
Gambar V.3. Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi Liebermann-Burchard.
Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 36
Pada gambar V.3 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi Liebermann-burchard dan dipanaskan di oven suhu 100
( ditunjukkan oleh
(C)
(D) (E) (F)
Gambar V.3. Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
gambar V.3 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi burchard dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama
10 menit membuat
pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat dengan jelas dimana titik
semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm
adanya bercak warna biru muda (ditunjukkan oleh panah) merupakan senyawa ste
Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfat Keterangan : fase diam : silika gel
10 menit membuat 4 bercak menjadi warna coklat
pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat dengan jelas dimana titik-titik ungu merupakan warna dari pereaksi semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm
adanya bercak warna biru muda (ditunjukkan oleh panah) merupakan senyawa steroid-triterpenoid.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfat Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : n-heksana : etil asetat = 3 : 2 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm
(C) : KLT pada sinar UV 366 nm (D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
bercak menjadi warna coklat pada sinar biasa, pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat dengan jelas titik ungu merupakan warna dari pereaksi semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat 5 bercak, adanya bercak warna biru muda (ditunjukkan oleh panah)
(B) (C)
(D) (E) (F)
Gambar V.4 Profil bercak KLT ekstrak kloroform dengan pereaksi serium sulfat
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Pada gambar V.4 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi serium sulfat dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama 10 menit terlihat 4 bercak berwarna abu-abu pada sinar biasa(ditunjukkan oleh panah), pada sinar UV 254 nm bercak tidak dapat terlihat dengan jelas dimana titik-titik ungu merupakan warna dari pereaksi semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm terdapat 1 bercak yang berwarna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) merupakan senyawa flavonoid.
2) Ekstrak metanol
(A) (B) (C)
(D) (E) (F) Gambar V.5 profil bercak KLT ekstrak metanol
Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Dari gambar V.5 tidak terlihatnya bercak pada sinar biasa dan sinar UV 254 nm, sedangkan terdapat 1 bercak tipis berwarna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) terlihat pada sinar UV 366 nm.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F) Gambar V.6 profil bercak KLT ekstrak metanol diuapi dengan uap amoniak Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Dari gambar V.6 tidak didapatkan bercak jika dilihat dari sinar biasa dan sinar UV 254 nm, sedangkan terlihat 1 bercak tipis berwarna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) yang merupakan senyawa flavonoid.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
Gambar V.7 Profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi Liebermann-Burchard.
Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT sinar UV 366 nm
Dari gambar V.7 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi Liebermann-burchard dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama 10 menit tidak terdapat bercak pada sinar biasa. Pada sinar UV 254 nm tidak terlihatnya bercak dan titik-titik ungu merupakan warna
dari pereaksi semprotnya. Pada sinar UV 366 nm terdapat 1 bercak tipis berwarna biru (ditunjukkan oleh panah) yang merupakan senyawa steroid/triterpenoid.
(A) (B) (C)
(D) (E) (F)
Gambar V.8 profil bercak KLT ekstrak metanol dengan pereaksi serium sulfat Keterangan : fase diam : silika gel
fase gerak : kloroform : etil asetat = 2 : 3 (A) : KLT pada sinar biasa (B) : KLT pada sinar UV 254 nm (C) : KLT pada sinar UV 366 nm
(D) : Pola bercak KLT pada sinar biasa (E) : Pola bercak KLT pada sinar UV 254 nm (F) : Pola bercak KLT pada sinar UV 366 nm
Dari gambar V.8 lempeng KLT setelah disemprot dengan pereaksi serium sulfat dan dipanaskan di oven suhu 100oC selama 10 menit
tidak terdapat bercak pada sinar biasa. Pada sinar UV 254 nm tidak terlihatnya bercak dan titik-titik ungu merupakan warna dari pereaksi semprotnya, sedangkan pada sinar UV 366 nm adanya 1 bercak tipis warna kuning kehijauan (ditunjukkan oleh panah) merupakan senyawa flavonoid.
2. Pengujian aktivitas antiplasmodium
Hasil pengamatan terhadap aktivitas penghambatan pertumbuhan parasit P. falcifarum strain D6 dan strain W2 secara in vitro dari berbagai ekstrak daun asam kandis dengan metode mikroskopik dan metode SYBR Green I.
a. Metode Mikroskopik
1) Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol strain D6 ( Sensitif Klorokuin)
Tabel V.2 Hambatan pertumbuhan P. falcifarum strain D6 (%) dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq pada berbagai konsentrasi.
Konsentrasi ekstrak (µg/mL)
% hambat pertumbuhan
Ekstrak kloroform Ekstrak metanol
4 -42,93 14,04
20 36,48 10,49
100 73,55 85,45
200 88,95 93,37
400 96,50 97,88
Pada tabel V.2 dihitung % hambat pertumbuhan P. falcifarum strain D6 dari berbagai konsentrasi ekstrak kloroform dan ekstrak metanol, terlihat pada ekstrak kloroform semakin tinggi konsentrasi maka semakin tinggi nilai % hambat pertumbuhan P. falcifarum. Sedangkan pada ekstrak metanol terlihat terjadi penurunan % hambat pertumbuhan pada konsentrasi 20 µg/mL dan kemudian pada konsentrasi berikutnya akan mengalami peningkatan. Nilai negatif pada ekstrak kloroform pada konsentrasi 4 µg/mL menunjukkan bahwa tidak terjadi hambatan pertumbuhan P. falcifarum.
Gambar V.9 Kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan probit
Untuk memperoleh nilai IC50 dibuat terlebih dahulu kurva
persamaan garis regresi linier (Gambar V.9). Berdasarkan persamaan garis linier tersebut didapat nilai IC50 dari ekstrak
kloroform daun asam kandis sebesar 33,17 µ g/mL dan dari ekstrak metanol sebesar 32,44 µg/mL.
y = 2,2119 + 1,8333 x -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 0 1 2 3 p ro b it log konsentrasi ekstrak kloroform ekstrak metanol
(RPMI 1640) (konsentrasi 4 µg/mL) (konsentrasi 20 µg/mL) (konsentrasi 100 µg/mL) (konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL) Gambar V.10 P. falcifarum Strain D6 (sensitif) ekstrak kloroform daun asam
kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi
Pada gambar V.10. menunjukkan perkembangan P. falcifarum strain D6 dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak kloroform maka perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah yang ditunjukkan oleh tanda panah merupakan sel darah merah yang terinfeksi oleh P. falcifarum.
(RPMI 1640) (konsentrasi 4 µg/mL) (konsentrasi 20µg/mL) (konsentrasi 100 µg/mL) (konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL) Gambar V.11 P. falcifarum strain D6 (sensitif) ekstrak metanol daun asam
kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi
Dari gambar V.11 menunjukkan perkembangan P. falcifarum strain D6 dan dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak metanol maka perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah yang ditunjukan oleh panah merupakan sel darah merah yang terinfeksi P.falcifarum.
2) Ekstrak kloroform dan ekstrak metanol Strain W2 ( Resistensi Klorokuin)
Tabel V.3 Hambatan pertumbuhan P. falciparum strain W2 (%) dari ekstrak kloroform dan ekstrak metanol daun asam kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) pada berbagai konsentrasi.
Konsentrasi ekstrak (µg/mL)
% hambat pertumbuhan
Ekstrak kloroform Ekstrak metanol
4 -27,98 7,97
20 69,32 -8,84
100 82,87 60,66
200 83,50 90,34
400 92,66 91,28
Pada tabel V.3 dihitung % hambat pertumbuhan P. falcifarum strain W2 dari berbagai konsentrasi ekstrak kloroform dan ekstrak metanol, terlihat pada ekstrak kloroform semakin tinggi konsentrasi maka semakin tinggi nilai % hambat pertumbuhan P. falcifarum. Sedangkan pada ekstrak metanol terlihat terjadi penurunan % hambat pertumbuhan pada konsentrasi 20 µg/mL dan kemudian pada konsentrasi berikutnya akan mengalami peningkatan. Nilai negatif pada ekstrak kloroform pada konsentrasi 4 µg/mL dan ekstrak metanol pada konsentrasi 20 µg/mL menunjukkan bahwa tidak terjadi hambatan pertumbuhan P. falcifarum.
Gambar V.12 kurva persamaan garis regresi linier antara log konsentrasi dan probit
Untuk dapat memperoleh nilai IC50 dibuat terlebih dahulu kurva
persamaan garis regresi linier (gambar V.12). Berdasarkan persamaan garis linier tersebut didapat nilai IC50 dari ekstrak
kloroform daun asam kandis sebesar 0,55 µ g/mL dan dari ekstrak metanol sebesar 41,23 µ g/mL. -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 0 1 2 3 p ro b it log konsentrasi ekstrak kloroform ekstrak metanol
(RPMI 1640) (konsentrasi 4 µg/mL) (konsentrasi 20 µg/mL) (konsentrasi 100 µg/mL) (konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL)
Gambar V.13 P. falcifarum Strain W2 (resisten) ekstrak kloroform daun asam kandis (G. parvifolia (Miq)Miq) dalam sel daram merah pada berbagai konsentrasi
Dari gambar V.13 menunjukkan perkembangan P. falcifarum strain W2 pada berbagai konsentrasi dan dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak kloroform maka perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah yang ditunjukan oleh panah merupakan sel darah merah yang terinfeksi P. falcifarum.
(RPMI 1640) (konsentrasi 4 µg/mL) (konsentrasi 20 µg/mL) (konsentrasi 100 µg/mL) (konsentrasi 200 µg/mL) (konsentrasi 400 µg/mL) Gambar V.14 .P. falcifarum strain W2 (resisten) ekstrak metanol daun asam
kandis (G. parvifolia. (Miq)Miq) dalam sel darah merah pada berbagai konsentrasi
Dari gambar V.14 menunjukkan perkembangan P. falcifarum strain W2 pada berbagai konsentrasi dan dibandingan dengan kontrol negatif (RPMI 1640), terlihat semakin tinggi konsentrasi dari ekstrak metanol maka perkembangan hidup P. falcifarum semakin berkurang. Daerah yang ditunjukan oleh panah merupakan sel darah merah yang terinfeksi P.falcifarum.
