konsentrasinya. Untuk isolasi kulit buah kakao (outer pod wall dan inner pod wall) metode sama seperti isolasi RNA dari biji kakao.
Uji Kualitatif dan Kuantitatif Hasil Isolasi RNA
Larutan RNA hasil isolasi dianalisis kualitatif dan kuantitatif untuk mengetahui konsentrasi dan kemurniannya. Uji kualitatif dilakukan melalui teknik elektroforesis RNA dalam gel agarosa 1% untuk melihat pita hasil elektroforesis, selain itu diukur dengan melihat perbandingan serapan pada panjang gelombang 260 nm dengan 280 nm. Kemurnian RNA yang tinggi dapat dilihat dari perbandingan A260/280 yang berkisar antara 1,8-2,0 ( Sambrook et al 1989). Uji kuantitatif dilakukan dengan cara mengukur absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 nm. Konsentrasi RNA dihitung dengan perbandingan bahwa nilai 1 pada serapan 260 nm sama dengan serapan RNA dengan konsentrasi 40 ng/µl.
Isolasi Gen Proteinase Inhibitor (PIN) dan Uji Ekspresi dengan RT-PCR
Isolasi dan uji ekspresi dilakukan dengan teknik RT-PCR menggunakan primer spesifik yang dirancang berdasarkan urutan basa gen PIN pada kakao yang telah dipublikasikan (bank data gen www.ncbi.nlm.nih.gov;X56509.1). Primer kemudian digunakan dalam RT-PCR untuk amplifikasi daerah gen PIN.
RNA yang didapat dijadikan cDNA terlebih dahulu agar dapat digunakan sebagai template dalam reaksi PCR. cDNA disintesis dengan menggunakan kit dengan merk dagang Fermentas yang berisi enzim reverse transcriptase (reverd Aid). Sintesis cDNA dilakukan dengan cara, yaitu RNA yang didapat diambil sebanyak 1µg, kemudian ditambah 1µl dNTPs 10 µM, 1µl oligo-dT, ddH2O sampai volume akhir 12 µl. Setelah itu diinkubasi 65ºC selama 5 menit. Kemudian ditambah mix (buffer RT 4µl, 1µl DTT 0,1M, 1µl RNase inhibitor) kemudian inkubasi 42ºC selama 2 menit, lalu ditambah enzim reverse transcriptase (reverd Aid), inkubasi dilanjutkan pada suhu 42ºC selama 50 menit dan dilanjutkan dengan 70ºC
selama 15 menit. Reaksi PCR dilakukan dengan total volum 25µl yang di dalamnya terdapat 1 µl cDNA sebagai template, dNTPs 1 µl, ddH2O 16,75 µl, bufer 10X 2,5 µl, MgCl2 0,25 µl, pasangan primer spesifik gen PIN , yaitu F21 (forward) dan R11 (reverse) masing-masing sebanyak 1 µl dan enzim taq polimerase 2 µl. Program terdiri dari pre-denaturasi pada suhu 95°C selama 5 menit dilanjutkan dengan 35 siklus yang terdiri dari denaturasi pada suhu 95°C selama 45 detik, annealing pada suhu 58ºC selama 45 detik dan extension 72ºC selama 5 menit. Selanjutnya untuk melihat hasilnya, produk PCR dipisahkan dengan teknik elektroforesis pada gel agarosa 1%.
Sekuensing Fragmen Gen PIN
Sebelum dilakukan sekuensing, fragmen hasil RT-PCR dimurnikan terlebih dahulu. Pemurnian dilakukan dengan menggunakan kit QIAGEN. Pemurnian dilakukan dengan cara, pita DNA dipotong dari gel agarosa lalu ditambah 3 volum buffer QX1 dan QIAEX II sebanyak 10µl dan diinkubasi 50ºC selama 10 menit untuk melarutkan agarosa dan mengikat DNA. Campuran disentrifus untuk didapatkan pelletnya. Pellet dicuci dengan 500 µl buffer QX1 kemudian disentrifus dan supernatannya dibuang, lalu pellet dikeringkan. Untuk melarutkan DNA ditambahkan 18µl Tris-HCl 10mM pH 8,5 atau ddH2O. Campuran disentrifus 4000 g selama 30 detik dan supernatan diambil untuk dilakukan sekuensing.
Fragmen gen PIN yang telah dimurnikan kemudian disekuen di Lembaga Biologi Molekuler Eijkman Jakarta. Hasil sekuensing kemudian dianalisis BLASTN (www.ncbi.nih.gov)
HASIL DAN PEMBAHASAN
Isolasi RNA Total Biji KakaoRNA diperlukan untuk mengisolasi gen spesifik pada jaringan tertentu. Pada penelitian ini diperlukan RNA total dari biji kakao dengan tujuan untuk mendapatkan gen PIN dari jaringan tersebut. Secara umum isolasi RNA lebih sulit dibanding isolasi DNA karena RNA sangat mudah terdegradasi oleh RNase (ribonuklease) sehingga membutuhkan penanganan khusus
dalam mengisolasinya, dalam hal ini digunakan denaturan kuat seperti dietil pirokarbonat (DEPC) untuk mencegah degradasi RNA oleh RNase.
Isolasi RNA total biji kakao dilakukan dengan metode Chaidamsari (2005).Prinsip dasar isolasi RNA adalah yang pertama, menghancurkan dinding sel untuk membebaskan sitoplasma dan RNA dalam sel. Penggunaan nitrogen cair merupakan cara yang efektif untuk membekukan jaringan sehingga mudah untuk dihancurkan dan kondisi suhu yang dingin dapat menjaga RNAse berada dalam keadaan tidak aktif. Selain itu penggunaan EDTA dimaksudkan untuk mengikat Mg2+ sehingga mempermudah pemecahan dinding sel dan secara tidak langsung meng- inaktivasi ribonuklease karena EDTA mengkelat ion tersebut yang fungsinya sebagai kofaktor. Kedua, Penggunaan β-merkaptoetanol dan senyawa pengekstrak seperti kloroform: isoamilalkohol (CI) 24:1 dan fenol: kloroform:isoamilalkohol (PCI) 25:24:1, dapat menyebabkan denaturasi senyawa nukleoprotein, dan selanjutnya membuang kontaminan DNA serta protein (Promega 1996). DNase diperlukan untuk mendegradasi DNA sehingga RNA yang diperoleh terbebas dari kontaminan DNA.
Isolasi RNA total dari biji kakao berhasil dilakukan dengan baik, dilihat dari hasil analisis elektroforesis gel agarosa 1,2% dalam 0,5X larutan penyangga TBE dengan voltase 25 volt selama 1,5 jam. Pada Gambar 2, terlihat bahwa RNA yang dihasilkan mempunyai integritas yang baik. Pita yang terbentuk dalam gel agarosa merupakan rRNA yang berukuran 28S dan 18S, sesuai dengan literatur yang menyebutkan bahwa hasil isolasi RNA dikatakan baik apabila dalam elektroforesis gel agarosa menghasilkan 2 pita RNA ribosom (rRNA), yaitu 28S dan 18S yang merupakan rRNA sitoplasma utama pada tanaman (Farrel 1993).
28 S 18 S
Gambar 2 Hasil elektroforesis RNA total biji kakao
Hasil pengukuran secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer UV pada panjang gelombang 260 dan 280 nm diperoleh absorban masing-masing sebesar 0,490 dan 0,239. Berdasarkan hasil tersebut maka dengan menggunakan 2 gram sampel biji kakao didapatkan konsentrasi RNA total sebesar 2940 ng/µl dan nisbah absorban (A) 260/280 sebesar 2,050. dapat dikatakan hasil isolasi RNA total biji kakao mempunyai konsentrasi dan kemurnian yang tinggi, seperti yang dijelaskan Sambrook et al (1989) bahwa hasil isolasi RNA dikatakan murni jika mempunyai nilai A260/280 sebesar 1,8-2,0. Tingginya nilai rasio A260/280 menunjukkan bahwa RNA tersebut terbebas dari kontaminan protein. Sehingga RNA yang dihasilkan dapat digunakan untuk percobaan berikutnya.
Isolasi Gen PIN dari Biji Kakao
RNA total biji kakao yang sudah didapatkan selanjutnya digunakan untuk mengisolasi gen PIN. Biji kakao digunakan pada penelitian ini karena berdasarkan laporan Thai et al (1991) bahwa gen PIN ada pada biji kakao, gen ini mengkode protein yang berukuran 21 kDa dengan homologi yang cocok dengan inhibitor tripsin pada kedelai (kumitz) dari proteinase inhibitor. Protein tersebut diakumulasi selama perkembangan biji dan tidak didegradasi selama perkecambahan benih pada kakao.
Gen PIN diisolasi menggunakan teknik RT-PCR karena untuk mengisolasi gen-gen yang spesifik dari kromosom eukariot diperlukan cDNA (Watson et al 1987). cDNA merupakan DNA yang berkomplemen dengan mRNA (Dale 1994), sedangkan mRNA adalah transkrip dari gen-gen yang terekspresi yang membawa pesan berupa informasi genetik dari DNA ke dalam bentuk protein (Darnell et al 1990). Sehingga cDNA berbeda dengan DNA genom karena cDNA mewakili bagian dari suatu gen yang terekspresi (Davis et al 1986). Selanjutnya cDNA digunakan sebagai template untuk mengamplifikasi gen PIN dari biji kako.
Utas cDNA disintesis dari mRNA yang besarnya hanya sekitar 1-2% dari RNA total ( rRNA, tRNA, mRNA). Hal ini disebabkan oleh mRNA tidak berada secara permanen dalam sel hanya diperlukan selama protein yang disandikan masih diproduksi (Watson et al 1987). Dalam penelitian digunakan kit
dengan merk dagang Fermentas untuk mensintesis cDNA. Kit ini berisi enzim reverse transkriptase dan primer oligo-dT. mRNA mempunyai ekor poly-A pada ujung 3’ maka primer oligo(dT) akan berpasangan dengan ujung poly(A) mRNA sehingga cDNA dapat disintesis dari mRNA (template) dengan menggunakan enzim reverse transkriptase. Selanjutnya cDNA digunakan sebagai template dalam reaksi PCR.
Reaksi PCR dibutuhkan sepasang primer. Primer yang digunakan pada penelitian ini merupakan primer spesifik yang dibuat untuk mengamplifikasi gen PIN pada biji kakao. Primer ini dibuat berdasarkan sekuen gen PIN yang didapat dari bank data gen (www.ncbi.nih.gov), seperti yang terlihat pada Gambar 3.
Berdasarkan sekuen gen PIN yang didapat maka primer dirancang dengan melihat cds (coding segmen) yang dimilki dari gen tesebut. Urutan gen yang akan disandikan menjadi protein disebut juga sebagai cds. Urutan basa gen PIN yang didapat dari bank data gen mempunyai cds yang diawali dari basa ke-31 sampai ke-696. Sehingga dibuat primer F21 sebagai forward
dengan urutan basa (5’ATGAAGACCGCAACAGCCGTA’3)
yang dimulai dari kodon awal dan primer R11 sebagai reverse dengan urutan basa (5’ATGCTTCGGTTAACAACTTG3’) yang berada pada kodon akhir. Dengan menggunakan teknik RT-PCR yang dilakukan dengan suhu annealing 58°C dan 35 siklus maka diharapkan dengan pasangan primer tesebut akan didapatkan amplifikasi fragmen gen PIN dengan ukuran sebesar 662 bp.
Hasil RT-PCR dielektroforesis dengan gel agarosa 1% kemudian diperoleh pita sesuai dengan prediksi, yaitu menghasilkan pita yang berukuran 662 bp (Gambar 4). Hasil ini menunjukkan bahwa fragmen gen PIN pada biji kakao dapat diisolasi dengan pasangan primer F21 dan R11. Hal ini juga secara tidak langsung menggambarkan adanya ekspresi gen PIN pada biji kakao, namun perlu pembuktian lebih lanjut dengan analisis BLASTN.
Analisis Sekuen Fragmen Gen PIN dari Biji Kakao
Sekuensing diperlukan untuk menganalisis fragmen gen PIN yang berhasil diisolasi. Sekuensing dapat
dilakukan dengan menggunakan produk PCR langsung atau melalui hasil kloning. Pada penelitian ini dilakukan sekuensing menggunakan produk PCR langsung dengan total volume reaksi 100µl. Analisis sekuen meliputi analisis homologi dengan program BLASTN dari bank data gen (www.ncbi.nih.gov/BLAST). Analisis ini diperlukan untuk mengetahui apakah gen yang berhasil diisolasi sesuai dengan yang diharapkan.
Sekuensing dilakukan di Lembaga Biologi Molekuler Eijkman. Data hasil sekuensing berupa electrophoregraph yang menggambarkan urutan basa fragmen gen PIN berukuran 580 bp (Lampiran 2). Ukuran yang dihasilkan dari sekuensing berbeda dengan yang diprediksikan, hal ini disebabkan oleh sekuensing dilakukan langsung dari produk PCR sehingga primer sekuensing sama dengan primer amplifikasi akibatnya terdapat pengurangan ukuran basa. Hasil electrophoregraph memperlihatkan bahwa tidak semua basa dapat disekuen hal ini mungkin disebabkan oleh proses pemurnian yang kurang sempurna atau ada kesalahan pada sekuensing.
Urutan basa yang didapatkan dari hasil sekuensing kemudian dianalisis BLASTN. BLAST merupakan alat pembanding suatu sekuen yang dicari dengan sekuen yang telah diketahui dengan cepat yang dapat menjelaskan apakah sekuen tersebut memiliki similaritas cukup signifikan. Analisis BLASTN yang dilakukan terhadap urutan basa gen PIN dapat dilihat pada Tabel 1.
Berdasarkan analisis BLASTN ,dengan melihat parameter skor lebih dari 150 dan e-value yang kurang dari 10-4 maka tingkat homologi yang dihasilkan cukup baik (Claveri dan Notredam 2003). Semakin tinggi skor (bits) maka tingkat homologinya semakin baik, semakin rendah e-value maka semakin baik pula tingkat homologinya. Selain nilai skor dan e-value, tingkat homologi juga dapat dilihat dari garis berwarna merah pada grafik hasil BLASTN.
Garis warna merah menunjukkan tingkat homologi sangat tinggi, diikuti dengan garis merah muda, hijau, biru, dan hitam. Berdasarkan Tabel 1 dapat diketahui bahwa urutan basa fragmen gen PIN bersesuaian dengan gen penyandi protein 21 kDa pada biji kakao yang merupakan proteinase inhibitor (PIN). Sehingga
CCCACTTATCCAGCAACATTTCACTTAACCATGAAGACCGCAACAGCCGTAGTTTTACTCCTCTT Met CGCCTTCACATCAAAATCATATTTCTTTGGGGTAGCCAACGCTGCAAACTCTCCTGTGCTTGACA CTGATGGTGATGAGCTCCAAACTGGGGTTCAATATTACGTCTTGTCATCGATATCGGGTGCTGGG GGTGGAGGGCTAGCCCTAGGAAGGGCTACAGGTCAAAGCTGCCCAGAAATTGTTGTCCAAAGA CGATCCGACCTTGACAATGGTACTCCTGTAATCTTTTCAAATGCGGATAGCAAAGATGATGTTGT CCGCGTATCTACTGATGTAAACATAGAGTTCGTTCCCATCAGAGACAGACTCTGCTCAACGTCA ACTGTGTGGAGGCTTGACAATTATGACAACTCGGCAGGCAAATGGTGGGTGACAACTGATGGG GTTAAAGGTGAACCTGGTCCTAACACTTTGTGCAGTTGGTTTAAGATTGAGAAGGCCGGAGTAC TCGGTTACAAATTCAGGTTCTGTCCTTCTGTCTGTGATTCGTGCACAACTTTATGCAGCGATATT GGAAGACATTCAGATGATGATGGACAAATACGTTTGGCTCTCAGTGACAATGAATGGGCATGGA
TGTTTAAGAAAGCAAGTAAGACAATAAAACAAGTTGTTAACGCGAAGCATTAATTTTAAGTTTA Kodon akhir
ATGTACGAAGTGTACGTCCAAAGCAGCAATACTAGCCGGTCGTTACTTTCCACTAAATAAAAGT TAAGTATGTGGTTCCCAGCCCAGTGTTGTAATGCTATGCCTATGTAGTCAGTGTCTTGTTTGAGG GTGGAGATGCTTAAAGGGTGTGTCTTCACAGCCCAGCTTCGTAGTCTTTCNNNNNNTTTATGAA TAAATGACCCTCTTGCCTCTTTTATTACCA
Gambar 3 Urutan basa gen PIN , posisi primer F21 (forward) dan primer R11 (reverse) ditandai dengan panah hijau
600 bp
Bj M
Gambar 4 Hasil RT-PCR cDNA biji kakao; (Bj) merupakan fragmen gen PIN yang berukuran 662bp dan (M) marker 100bp.
dapat dikatakan hasil isolasi fargmen gen PIN dari biji kakao telah berhasil dilakukan dengan baik karena fragmen hasil amplifikasi merupakan gen PIN penyandi protein berukuran 21 kDa pada biji kakao. Selain itu fragmen ini juga mempunyai homologi dengan T. cacao putative 21 kDa trypsin, T. cacao clone 34-4 trypsin inhibitor gene partial cds, dan T. bicolor clone 5-2 trypsin inhibitor gene partial cds.
Tabel 1 Hasil analisis BLASTN urutan basa fragmen gen PIN
Gen yang bersesuaian skor (bit)
e-value T.cacao mRNA for 21
kDa seed protein homolog to soybean trypsin
377 2e-101
T. cacao putative 21 kDa trypsin
inhibitor gene, complete cds 340 3e-90 T. cacao clone 34-4 trypsin inhibitor gene partial cds 309 8e-81 T. bicolor clone 5-2 trypsin inhibitor gene partial cds 248 2e-62
Ekspresi Gen PIN pada Jaringan Kulit Kakao Klon Ary dan Bal
Metode RT-PCR dapat digunakan untuk melihat tingkat ekspresi suatu gen dalam jaringan tertentu (Yuwono 2006). Pada penelitian ini dilakukan uji ekspresi pada
jaringan kulit dari dua klon yang berbeda, yaitu klon yang tahan (Ary 2) dan tidak tahan terhadap hama PBK (Bal 209). Hal ini dilakukan untuk melihat tingkat ekspresi gen PIN dari jaringan kulit pada kedua klon.
Reaksi RT-PCR memerlukan RNA sebagai template untuk mendapatkan cDNA kemudian cDNA digunakan sebagai template dalam reaksi PCR. Sebagai langkah awal dilakukan isolasi RNA dari jaringan kulit klon Ary 2 dan Bal 209. Uji ekspresi memerlukan RNA dengan konsentrasi dan kualitas tinggi, namun isolasi RNA dari jaringan kulit lebih sulit dibandingkan dari biji, karena di kulit banyak mengandung senyawa polifenol dan polisakarida sehingga sangat sulit untuk mendapatkan konsentrasi dan kemurnian RNA yang tinggi. Menurut Couch dan Fritz (1990), tanaman berkayu banyak mengandung senyawa polifenol dan polisakarida.
Isolasi RNA dari kulit dilakukan pada kedua klon dengan panjang buah 9 dan 12 cm. Pemilihan panjang buah disesuaikan dengan literatur yang menyatakan bahwa buah kakao dengan panjang 5-7cm dan yang sangat muda tidak pernah terserang PBK (Wardoyo 1994 dalam Depparaba F 2002 ), buah kakao mulai terserang PBK pada panjang 9 cm dan PBK lebih menyukai buah kakao yang panjangnya lebih dari 9 cm (Sulistyowati et al 2003). Oleh karena itu akan dilihat bagaimana ekspresi gen PIN pada buah yang panjangnya 9 cm dan 12 cm. Selain itu digunakan biji sebagai kontrol karena telah dipastikan bahwa gen PIN terekspresi pada biji kakao. Hasil pengukuran absorban RNA jaringan kulit kakao pada kedua klon dapat dilihat di Tabel 2.
Berdasarkan masing-masing RNA yang berhasil diisolasi dapat dikatakan bahwa RNA tersebut mempunyai kemurnian Tabel 2 Data hasil pengukuran absorban
RNA dengan spektrofotometer UV
Sampel
A260 A280 A260 280 [RNA] (ng/µl) Ary 9cm 0,103 0,051 2,019 618 Ary 12cm 0,083 0,042 1,970 498 Bal 9cm 0,028 0,017 1,647 168 Bal 12cm 0,044 0,021 2,095 264 Biji 0,490 0,239 2,050 2940
yang tinggi, dilihat dari nisbah A260/280 yang mempunyai nilai 1,647-2,050. Namun pada penelitian ini sulit untuk mendapatkan konsentrasi RNA yang besar pada jaringan kulit. Seperti yang dikatakan sebelumnya bahwa jaringan kulit banyak mengandung senyawa polifenol dan polisakarida sehingga menyulitkan dalam isolasi RNA. Konsentrasi RNA yang besar mudah didapatkan dari biji, selain kandungan polifenol dan polisakarida yang lebih sedikit, biji merupakan protein storage sehingga kandungan RNAnya juga besar.
RNA dipisahkan dengan elektroforesis gel agarosa guna melihat kualitasnya, selain itu hasil elektroforesis digunakan sebagai kontrol untuk uji ekspresi. Masing-masing RNA di elektroforesis sebanyak 250 ng, untuk mengetahui apakah RNA dari masing-masing sampel mempunyai kualitas dan kuantitas yang sama ketika dielektroforesis. Hal yang perlu diperhatikan dalam uji ekspresi, yaitu pada reaksi RT-PCR, sintesis cDNA harus menggunakan konsentrasi RNA yang sama, jika terdapat perbedaan maka bisa mempengaruhi intensitas pita yang terbentuk. Penggunaan konsentrasi RNA yang lebih besar maka dimungkinkan ekspresinya juga akan besar.
Hasil elektroforesis dapat di lihat pada Gambar 5. Gambar 5 menunjukkan bahwa RNA dari masing-masing sampel mempunyai intensitas pita yang sama, tetapi hanya RNA kulit klon Ary dengan panjang buah 12 cm yang mempunyai perbedaan intensitas pita. Terlihat bahwa intensitas pita klon tersebut separuh lebih sedikit, sehingga RNA yang diperlukan untuk mensitesis cDNA 2 kali lebih besar dibanding dengan yang lainnya.
Teknik untuk melihat ekspresi gen dari suatu sel atau jaringan selain dengan RT-PCR dapat dilakukan dengan berbagai macam cara, diantaranya dengan menggunakan teknik Real-Time PCR dan DNA microarray, dengan Real-Time PCR, tingkat ekspresi dapat dilihat secara kuantitatif sedangkan dengan DNA microarray, dalam satu sel dapat terlihat tingkat ekspresi dari berbagai macam gen. Pada penelitian ini tingkat ekspresi gen PIN dapat dilihat dari intensitas pita dalam gel agarosa. Semakin kuat intensitas pita maka semakin kuat pula ekspresi gen tersebut dalam suatu jaringan, jika intensitas pita lemah maka lemah pula ekspresi gen tersebut. Intensitas pita yang terbentuk dapat dikuantifikasi dalam satuan konsentrasi (ng)
menggunakan program UN-SCAN-IT Gel 6.1. Program ini merupakan alat untuk mengkuantifikasi pita yang terbentuk pada gel agarosa, sehingga dapat diketahui konsentrasinya dengan membandingkan marker sebagai standar yang sudah diketahui konsentrasinya.. Prinsip program ini adalah membandingkan pixel sampel yang terdeteksi dengan pixel standar (marker) lalu dikonversi menjadi satuan konsentrasi dengan persamaan kurva standar.
Hasil RT-PCR yang dilakukan dengan menggunakan primer spesifik gen PIN dapat dilihat pada Gambar 5. Pita yang terbentuk kemudian dianalisis dengan program UN-SCAN-IT Gel 6.1. Analisis dengan program ini menghasilkan kurva standar (Lampiran 4) dari marker dengan persamaan y = 9,3357. 10-3 X + 7,383, dimana y dan X merupakan konsentrasi dan pixel. Selanjutnya Pixel yang dihasilkan dari masing-masing pita sampel dikonversi menjadi konsentrasi dengan menggunakan kurva standar. Konsentrasi yang dihasilkan dari pita hasil elektroforesis berbeda-beda pada tiap sampel. Hasil ini dapat dilihat dalam Tabel 3.
Terlihat bahwa jaringan kulit kakao baik dari klon Ary maupun klon Bal keduanya mengekspresikan gen PIN (Gambar 6), namun dilihat dari intensitas pita dan konsentrasi yang berbeda-beda dapat dikatakan bahwa tingkat ekspresi dari kedua klon tidak sama. Ditinjau dari ukuran buah, panjang buah 12 cm mempunyai konsentrasi dan intensitas pita yang lebih kuat dibanding panjang buah 9 cm. Hal ini dapat dikatakan bahwa semakin panjang ukuran buah, ekspresi gen PIN semakin meningkat.
1 2 3 4 5
Gambar 5 Hasil elektroforesis RNA total dari jaringan kulit kakao; Lini 1,3=klon Ary dengan panjang buah 9 dan 12 cm; 2,4=klon Bal dengan panjang buah 9, 12 cm; 5=biji kakao.
Tabel 3 Data pixel dan konsentrasi hasil RT-PCR jaringan kulit klon kakao yang dielektroforesis gel agarosa Sampel Pixel Konsentrasi
(ng) Ary 9cm 27873,21 267,6002 Bal 12cm 90,00 8,2236 Ary 9cm 47076,49 446,8768 Bal 12cm 11957,86 119,0188 Biji 136735,30 1283,9070 600bp 1 2 3 4 5 M
Gambar 6 Hasil elektroforesis RT-PCR jaringan kulit kakao Lini 1,3=klon Ary dengan panjang buah 9 dan 12 cm; 2,4=klon Bal dengan panjang buah 9, 12 cm; 5=biji kakao, M= marker 100bp.
Berdasarkan penelitian ini, ekspresi gen PIN pada klon Ary lebih kuat dibanding klon Bal, dengan kata lain klon kakao yang tahan terhadap PBK mengekspresikan gen PIN yang lebih kuat dibanding klon yang tidak tahan terhadap PBK. Berdasarkan perbedaan ekspresi dari kedua klon, diduga gen PIN mempunyai pengaruh terhadap ketahanan buah kakao yang tahan PBK.
SIMPULAN DAN SARAN
Gen PIN dari biji kakao telah berhasil diisolasi dibuktikan dengan hasil sekuensing bahwa fragmen gen PIN berukuran 580 bp dan analisis dengan program BLAST (www.ncbi.nih.gov/BLAST) menandakan bahwa fragmen gen PIN mempunyai homologi yang tinggi dengan gen PIN penyandi protein berukuran 21 kDa pada biji kakao. Uji ekspresi gen PIN dari kulit klon kakao tahan dan tidak tahan terhadap PBK dapat disimpulkan bahwa semakin panjang ukuran buah, ekspresi gen PIN semakin meningkat dan secara umum klon kakao
