Pengujian antibakteri dan antioksidan ekstrak
kulit
batang
siuri
(Koordersiodendron
pinnatum
(Blanco) Merr.)
Antibacterial and antioxidative activity tests on extract of
siuri
(Koordersiodendron pinnatum
(Blanco) Merr.) cortex
Praptiwi dan Mindarti Harapini Bidang Botani, Puslit Biologi-LIPI
Abstrak
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antibakteri dan antioksidan secara in-vitro ekstrak kulit batang siuri (Koordersiodendron
pinnatum). Uji antibakteri dilakukan pada ekstrak alkohol, heksana,
kloroform dan etil asetat pada 7 isolat bakteri yaitu 4 isolat Gram Positif
(Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Streptococcus agalactiae,
Corynebacterium sp.) dan 3 isolat Gram Negatif (Salmonella enteritidis, Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa). Masing-masing ekstrak dilarutkan
dengan DMSO pada konsentrasi 50, 25, 12,5 dan 6,75% dengan 3 kali ulangan. Media yang digunakan adalah Mueller Hinton Agar (MHA). Uji antioksidan secara in-vitro dilakukan pada konsentrasi : 1% (E1), 5% (E2), dan 10% (E3) dengan kontrol negatif aquadest (K-) dan kontrol positif -tokoferol (K+). Hasil uji antibakteri menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat mempunyai daya hambat terhadap pertumbuhan 7 isolat bakteri yang diuji. Daya hambat ekstrak etil asetat pada 3 isolat bakteri Gram Negatif (Corynebacterium sp., S. enteritidis dan E.coli) lebih besar dari daya hambat 10 unit penisilin. Nilai peroksida (POV) ekstrak etanol (140,66) lebih kecil dari -tokoferol dan meningkatnya konsentrasi ekstrak menurunkan nilai absorbansi.
Kata kunci : Koordersiodendron pinnatum, antibakteri, antioksidan.
Abstract
The aim of the study was to determine the in-vitro antibacterial and antioxidative activities of siuri (Koordersiodendron pinnatum) bark extract. Ethanolic, hexane, chloroform and ethyl acetate extracts were tested for antibacterial activity against 7 bacteria isolates which were 4 Gram Positive bacteria (Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Streptococcus agalactiae,
Corynebacterium sp.) and 3 Gram Negative bacteria (Salmonella enteritidis, Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa). Extract concentrations used were :
50, 25, 12.5 and 6.75%. The experiments were conducted in triplicate in Mueller Hinton Agar (MHA). Antioxidative test was performed at the concentration of 1, 5 and 10% with aquadest as a negative control and -tocopherol as positive control. The results showed that the ethyl acetate extract inhibited the growth of 7 bacteria tested, and the growth inhibition area on Gram negative bacteria was wider than that of 10 units of penicillin.
Peroxide value of ethanol extract (111.29) was lower than that of -tocopherol. Increasing extract concentration reduced the absorbance value.
Pendahuluan
Siuri (Koordersiodendron pinnatum) meru-pakan pohon dengan tinggi mencapai 50 m, diameter batang 2 m dan umumnya terdapat pada ketinggian 450 m dpl (Heyne, 1987), dan merupakan salah satu tumbuhan dari suku Anacardiaceae yang tersebar di Filipina, Kalimantan bagian utara, Sulawesi, Maluku dan Papua bagian utara (Boer.et.al.,.1995).
Pemanfaatan siuri yang telah dikenal masyarakat adalah sebagai bahan bangunan (kayunya), sedangkan kulit batang yang di tumbuk digunakan untuk memberi warna gelap pada gula aren (Heyne, 1987). Boer et al. (1995) menyatakan bahwa kayu siuri dapat digunakan sebagai bahan lantai rumah karena memiliki warna merah tua yang rata. Pemanfaatan siuri sebagai bahan obat belum banyak dikenal meskipun siuri merupakan salah satu tumbuhan dari suku Anacardiaceae. Selanjutnya Boer et al (1995) melaporkan bahwa getah dari kulit batang siuri digunakan sebagai bahan obat lokal, tanpa ada informasi tentang senyawa-senyawa kimia yang terdapat pada kulit batang siuri. Kandungan kimia tersebut penting diketahui karena hal ini akan berkaitan dengan senyawa yang kemungkinan dapat bersifat bioaktif. Bioesai dapat juga digunakan untuk mengetahui sifat bioaktif dari ekstrak tanaman antara lain uji antibakteri. Berdasarkan hal tersebut maka dilakukan penapisan fitokimia untuk mengetahui kandungan senyawa pada kulit batang siuri sedang uji antibakteri dilakukan pada bakteri Gram Positif dan Gram Negatif, selain itu dilakukan pula penentuan nilai peroksida dan uji antioksidan secara in-vitro ekstrak kulit batang siuri.
Metodologi
Bahan
Kulit batang siuri (Koordersiodendron pinnatum) diperoleh dari desa Pakuli, Kab. Donggala, Sulawesi Tengah. Kulit batang tersebut dicacah kemudian dikeringkan, dan selanjutnya digiling menjadi serbuk. Penapisan Fitokimia (Cuilei, 1984)
Dua puluh lima gram serbuk kulit batang siuri diekstraksi dengan dietil eter, dikocok sampai hasil ekstraksi berwarna jernih. Sari eter yang ada dikumpulkan dan dipekatkan dengan rotavapor. Ekstrak eter yang telah dipekatkan dianalisis untuk identifikasi minyak atsiri, lemak dan asam lemak,
sterol dan triterpena, alkaloida basa, aglikon flavon dan aglikon antrasenosida. Ampasnya dikeringkan untuk diekstraksi dengan alkohol. Sari alkohol yang diperoleh dikumpulkan kemudian dipekatkan. Ekstrak alkohol yang telah pekat dianalisis untuk identifikasi tanin, gula pereduksi, dan garam alkaloida. Sedangkan terhadap sari alkohol yang dihidrolisis dilakukan analisis untuk identifikasi antrasenosida, glikosida steroida dan flavonoida. Selanjutnya, ampas dikeringkan. Ampas yang telah kering dilarutkan dengan air kemudian dilakukan ekstraksi dengan pelarut air. Ekstrak air yang telah dipekatkan digunakan untuk analisis identifikasi poliuronida, gula pereduksi, glukosida, tanin dan saponin. Identifikasi tanin dilakukan pada ekstrak alkohol dengan menambahkan 1-2 ml besi (III) klorida. Perubahan warna yang terjadi diamati. Warna biru kehitaman menunjukkan adanya tanin galat sedang warna hijau kehitaman menunjukkan adanya tanin katekol. Kandungan flavonoida diidentifikasi dari ekstrak eter. Ekstrak eter diuapkan, residu yang ada ditambah 1-2 ml metanol kemudian dipanaskan pada suhu 50oC kemudian
ditambahkan logam Mg dan 4-5 ml HCl. Warna merah menunjukkan adanya flavonol. Uji saponin dilakukan terhadap ekstrak air yang telah diencerkan kemudian dikocok selama 15 menit. Apabila terbentuk busa lebih besar atau sama dengan 1 cm dan tetap stabil setelah didiamkan 15 menit menun-jukkan adanya saponin.
Ekstraksi
Satu kg serbuk kulit batang siuri diekstraksi dengan alkohol 80% sampai jernih. Ekstrak yang ada dikeringkan dengan rotavapor (Etanol L). Sebagian dari ekstrak alkohol tersebut dilarutkan dalam alkohol 50% dan pelarut heksana sebanyak 3-5 kali. Sehingga diperoleh ekstrak heksana. Bagian yang terlarut dalam alkohol selanjutnya ditambahkan pelarut kloroform sebanyak 3-5 kali dan dan dipisahkan dengan corong pemisah. Ekstrak kloroform ditampung dan dipekatkan. Bagian yang terlarut pada alkohol diekstrak kembali dengan etil asetat, dipisahkan dengan menggunakan corong pemisah. Ekstrak etil asetat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan rotavapor. Berdasarkan hal tersebut maka diperoleh ekstrak alkohol (Etanol), ekstrak heksana, ekstrak kloroform dan ekstrak etil asetat yang akan digunakan untuk uji antibakteri.
Uji antibakteri
Uji antibakteri dilakukan pada ekstrak alkohol, ekstrak heksana, ekstrak kloroform dan ekstrak etil asetat dengan menggunakan bakteri Gram Negatif ( Salmonella enteritidis, Eschericia coli,
(Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium sp.). Isolat bakteri diperoleh dari koleksi biakan Balai Penelitian Veteriner, Bogor. Masing-masing ekstrak dilarutkan dengan DMSO pada konsentrasi 50%, 25%, 12.5% dan 6.75%. Masing-masing perlakuan mempunyai tiga ulangan. Lima belas mikroliter ekstrak diteteskan pada kertas cakram steril dan selanjutnya diletakkan pada permukaan media Mueller Hinton Agar (MHA) yang telah diinokulasi dengan bakteri uji. Media tersebut selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24
jam (Simmons dan Craver, 1980). Pengamatan ter-hadap aktivitas penghambatan terter-hadap pertum-buhan bakteri dilakukan dengan mengukur diameter daerah hambat yang terbentuk disekitar kertas cakram. Kontrol negatif menggunakan DMSO tanpa ekstrak, sedangkan kontrol positif menggunakan antibiotika penisilin 10 unit.
Pengujian dan perhitungan nilai peroksida Ekstrak etanol kulit batang siuri yang diekstrak langsung serta pembanding positif (-tokoferol) ditimbang masing-masing sebanyak 500 mg, dimasukkan dalam labu erlenmeyer 250 ml kemudian tambahkan 30 ml campuran asam asetat dan kloroform dengan perbandingan 3 : 2, kocok sampai homogen. Tambahkan 0,5 ml KI dan 30 ml air, kocok sampai homogen, lalu dititrasi dengan perlahan menggunakan natrium tiosulfat 0,1.N sambil dikocok hingga berwarna kuning dan tambahkan 0,5 ml larutan kanji 1%. Titrasi dilan-jutkan dengan pengocokan hingga warna biru yang terjadi tepat hilang (Williams, 1984). Dari hasil titrasi tersebut dicatat jumlah (dalam ml) natrium tiosulfat yang terpakai, dihitung normalitasnya. Nilai peroksida dihitung dengan menggunakan rumus : POV = S x N x 1000 / gram sampel.
S : ml natrium tiosulfat; N: normalitas dari natrium tiosulfat
Pengujian antioksidan secara in-vitro Ekstrak ditimbang dan dilarutkan dalam etanol 75%. Konsentrasi larutan yang diuji adalah 1, 5 dan 10%. Empat ml larutan sampel dari masing-masing konsentrasi dimasukkan dalam vial 25 ml ditambah 4.1 ml asam linoleat 2.51% dalam etanol 96 %, 8 ml buffer fosfat 0.05 ml, dan 3.9 ml air suling. Botol vial ditutup rapat dan dimasukkan dalam oven pada suhu 40oC dan didiamkan selama
24 jam. Selanjutnya dari masing-masing vial diambil 0,1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan ditambah 9.7 ml etanol 75%, 0.1 ml amonium tiosianida 30%. Larutan dikocok sampai homogen dan didiamkan selama 3 menit. Kemudian tambah-kan 0.1 ml ferro klorida 0.02 ml M dalam HCl 3.5%
dan dikocok kembali sampai homogen. Daya serap warna merah yang terjadi diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 500 nm. Pengamatan dilakukan selama 14 hari secara triplo (Kikuzaki et al., 1999 dan Kikuzaki et al., 2000).
Pembuatan kontrol positif dan negatif -tokoferol digunakan sebagai kontrol positif dengan konsentrasi 10%. Satu gram -tokoferol dilarutkan dalam 10 ml etanol 75% kemudian diambil 4 ml dengan menggunakan jarum suntik volume 5 ml. Masukkan dalam botol vial yang volumenya 25 ml, setelah itu ditambahkan 4,1 ml asam linoleat 2,51% dalam etanol 96%, 8 ml buffer fosfat 0,05 M dan 3,9 ml air suling. Botol vial ditutup dan dimasukkan dalam oven pada suhu 40C, didiamkan selama 24 jam. Pembuatan kontrol negatif sama dengan pembuatan kontrol positif tetapi tanpa penambahan -tokoferol (Kikuzaki et al., 1999).
Hasil Dan Pembahasan
Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia kulit batang siuri dengan menggunakan ekstrak eter, alkohol, alkohol terhidrolisis dan air bertujuan untuk mengetahui senyawa yang terdapat pada kulit batang siuri (tabel I.). Pelarut yang digunakan mempunyai tingkat kepolaran yang berbeda karena suatu senyawa hanya dapat larut pada pelarut yang mempunyai kepolaran yang sama (Kochhar dan Russel, 1990).
Berdasarkan hasil tersebut diketahui bahwa kulit batang siuri mengandung senyawa-senyawa seperti tanin, garam alkaloida dan flavonoida yang kemungkinan bersifat bioaktif. Menurut Tyler et al. (1988) tanin yang bersifat 'astringent' dapat digunakan sebagai obat hemoroid sedangkan senyawa antrasenosida yang bersifat sebagai pencahar dapat digunakan untuk memperbaiki gejala konstipasi. Senyawa-senyawa lain yang terdapat pada kulit batang siuri tersebut masih perlu diuji secara bioesai untuk mengetahui apabila terdapat senyawa yang bersifat bioaktif.
Uji Antibakteri
Ekstrak alkohol, heksana, kloroform dan etil asetat kulit batang siuri diuji antibakterinya secara in-vitro dengan menggunakan bakteri Gram negatif ( Salmonella enteritidis, Eschericia coli, Pseudomonas aeruginosa) dan Gram positif
(Staphylococcua aureus, S. epidermidis, Streptococcus agalactiae, Corynebacterium sp.) dengan konsentrasi 50%, 25%, 12.5% dan 6.25%. Hasil uji antibakteri ekstrak kulit batang siuri terdapat pada tabel II.
Uji antibakteri menunjukkan bahwa bakteri yang paling sensitif terhadap ekstrak kulit batang siuri adalah S. epidermidis meskipun daya antibakterinya masih lebih kecil dari daya antibakteri 10 unit penisilin. Hasil pada tabel II juga menunjukkan bahwa meningkatnya konsentrasi ekstrak juga meningkatkan daya hambat pertumbuhan bakteri. Hal ini berkaitan dengan konsentrasi senyawa yang terlarut pada ekstrak, meningkatnya konsentrasi ekstrak berarti konsentrasi senyawa kimia yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri juga meningkat. tabel II. juga menunjukkan bahwa senyawa-senyawa semipolar yang terlarut pada ekstrak kloroform dan etil asetat mempunyai daya hambat terhadap 7 isolat bakteri yang diuji, sedangkan ekstrak heksana yang mengandung senyawa non-polar hanya dapat menghambat 2 isolat bakteri. Sifat antibakteri ekstrak etil asetat berkaitan pula dengan jenis senyawa yang terlarut. Menurut Cuilei (1984) ekstrak etil asetat mengandung senyawa flavonoida, lignan dan triterpenoida. Flavonoida telah dipakai dalam pengobatan tradisional (Robinson, 1991). Selanjutnya Robinson (1991) menyatakan bahwa flavonoida dapat menghambat fosfodiesterase, protein kinase dan DNA polimerase. Selain flavonoida
yang kemungkinan bersifat bioaktif maka triterpenoida pada ekstrak etil setat telah diketahui sebagai komponen aktif pada tumbuhan obat. Menurut Robinson (1991) beberapa triterpenoida telah digunakan untuk penyakit diabetes, gangguan menstruasi dan kerusakan hati. Daya kerja antibakteri pada ekstrak etil asetat kemungkinan melalui penghambatan sintesis asam nukleat karena flavonoida dapat menghambat DNA polimerase (Robinson, 1991). Berdasarkan hasil tersebut maka terdapat kemungkinan bahwa senyawa yang bersifat antibakteri bersifat semipolar.
Aktivitas antibakteri ekstrak kulit batang siuri pada bakteri Gram Positif pada umumnya lebih besar daripada aktivitas antibakteri Gram Negatif. Hal ini kemungkinan disebabkan dinding sel pada bakteri Gram Negatif lebih kompleks daripada dinding sel Gram Positif (Jawetz et al., 1996) sehingga senyawa yang bersifat antibakteri lebih sukar untuk menembus dinding sel bakteri Gram Negatif.
Nilai peroksida (POV) dan uji antioksidan
Hasil POV menunjukkan bahwa ekstrak etanol kulit batang siuri mempunyai nilai POV lebih kecil (111,29) dibandingkan -tokoferol (212,52) (tabel.III.). Menurunnya nilai peroksida berarti meningkatnya aktivitas antioksidan. Berdasarkan hasil uji tersebut dapat disimpulkan bahwa kulit batang siuri mempunyai aktivitas sebagai antioksidan lebih Tabel I. Senyawa kimia pada kulit batang siuri (Koordersiodendron pinnatum) berdasarkan
penapisan fitokimia
Uji Ada Tidak ada
Minyak atsiri -
Lemak dan asam lemak tinggi -
Sterol dan triterpenoida -
Alkaloida basa - Aglikon flavonoida - Aglikon antrasenosida + Tanin + Gula pereduksi + Garam alkaloida + Antrasenosida + Glikosida steroida + Flavonoida + Poliuronida + Saponin +
besar dari kontrol positif. Hal ini berkaitan dengan kandungan zat yang bersifat antioksidan pada kulit batang siuri, misalnya terdapatnya senyawa fenolik (tannin, flavonoida) (Boer et al., 1995).
Pada penelitian ini, bahan diekstraksi secara bertingkat menggunakan pelarut organik dengan tingkat polaritas berbeda diawali dari pelarut non polar (heksana), semi polar (kloroform, etil asetat) dan pelarut polar (etanol). Hal ini disebabkan karena kandungan kimia dari suatu tanaman hanya dapat terlarut pada pelarut yang sama sifat kepolarannya, sehingga suatu golongan zat dapat dipisahkan dari zat yang lainnya (Kochhar dan Russel, 1990). Berdasarkan nilai rata-rata absorbansi ekstrak kulit batang siuri pada pelarut etanol
diperoleh nilai absorbansi yang terkecil adalah pada konsentrasi 10.%. Ekstrak etanol mem-perlihatkan absorbansi berturut – turut sebesar 0,128, 0,104 dan 0,047 pada masing– masing konsentrasi 1, 5 dan 10 %. Jadi, aktivitas antioksidan lebih baik pada konsentrasi 10% dibandingkan dengan konsentrasi 1 dan 5%. Menurut Kochhar dan Russel (1990) aktivitas antioksidan dipengaruhi oleh jenis senyawa dan banyaknya zat antioksidan yang terlarut dalam masing-masing pelarut. Berdasarkan nilai rata-rata absorbansi ekstrak pada konsentrasi 10% ternyata aktivitas antioksidan yang lebih baik adalah pada ekstrak etanol dibandingkan dengan ekstrak yang lain karena nilai absorbansi pada ekstrak etanol lebih kecil daripada ekstrak lainnya (Gambar 1.). Hal ini dimungkinkan Tabel II. Uji antibakteri ekstrak kulit batang siuri terhadap 7 isolat bakteri
Diameter Daerah Hambat (DDH) (mm) Bakteri/ Kons. ekstrak Alkohol
80% Heksan Khloro- form E asetat Kontrol + Kontrol - S. aureus -50% -25% -12.5% -6.25% 19.0 17.0 15.0 13.5 9.0 - - - 8.0 8.0 8.0 - 19.0 18.0 15.0 12,0 35.0 - S. epidermidis -50% -25% -12.5% -6.25% 20,0 20.0 17.0 15.0 14.0 12.0 10.0 0 12.5 10.0 8.0 0 24.0 22.5 20.5 19.5 35.0 - S. agalactiae -50% -25% -12.5% -6.25% - - - - 8.0 - - - 14.5 14.5 10.0 0 15.0 14.0 13.0 - 20.0 - Corynebacterium sp. -50% -25% -12.5% -6.25% - - - - - - - - 20.0 18.0 13.5 0 17.5 17.0 17.0 0 10.0 - S. enteritidis -50% -25% -12.5% -6.25% 16.0 16.0 12.0 12.0 15.0 13.0 13.0 12.5 20.0 13.0 11.5 0 13.0 12.0 10.0 9.0 10.0 - E.coli -50% -25% -12.5% -6.25% - - - - - - - - 13.0 12.0 10.0 0 13.0 12.0 10.0 9.0 - - P.aeruginosa -50% -25% -12.5% -6.25% 17.5 17.0 17.0 15.0 0 0 0 0 8.0 8.0 0 0 19.0 15.0 14.5 14.0 - -
karena senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai antioksidan banyak yang bersifat polar seperti senyawa fenol, vitamin C dan karoten, sehingga lebih banyak larut dalam pelarut polar (etanol) .
Kesimpulan
S. epidermidis merupakan bakteri yang pertumbuhannya dapat dihambat oleh 4 jenis ekstrak (ekstrak alkohol, heksana, khloroform dan etil asetat) dan merupakan bakteri yang sensitif dibandingkan isolat bakteri uji lain yang
digunakan pada penelitian meskipun belum diketahui perbedaannya secara nyata. Ekstrak etil asetat merupakan ekstrak yang mempunyai daya hambat terhadap 7 isolat bakteri yang diuji. Daya hambat ekstrak etil asetat pada 3..isolat bakteri Gram Negatif (Corynebacterium sp., S. enteritidis dan E.coli) lebih besar dari daya hambat 10 unit penisilin. Nilai peroksida (POV) ekstrak etanol (140,66) lebih kecil dari -tokoferol dan meningkatnya konsentrasi ekstrak.menurunkan.nilai.absorbansi.
Daftar Pustaka
Boer, E., J.W. Hidebrand, D.S. Alonzo and J.M. Fundter. 1995. Koordersiodendron Engl. In. : Timber Trees : Minor Commercial Timbers. Ed. : R.H.M.J. Lemmens, Soerianegara and W.C. Wong.
Cuilei, J. 1984. Methodology for Analysis of Vegetables and Drugs. Fac, of Pharmacy. Bucharest, Rumania 14 12 10 8 6 4 2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Hari A b s o r b a n t Kontrol (-) Kontrol (+) Heksan Khloroform Etyl asetat Etanol Etanol L
Gambar 1. Aktivitas antioksidan ekstrak kulit batang siuri dengan pelarut heksan, khloroform, etil asetat , etanol, etanol L (langsung pada konsentrasi 10%).
Tabel III. Nilai rata-rata POV ekstrak etanol kulit batang siuri dan Vit. E (kontrol )
Na2S2O3 (ml) N (Na2S2O3) Ekstrak (g) POV
1.20 0.0998 0.537 223.02 1.30 0.0998 0.608 213.39 -tokoferol (Vit. E) 500 mg 1.10 0.0998 0.545 201.43 Rata-rata 212.61 0.64 0.0998 0.568 112.45 0.60 0.0998 0.539 111.09 Ekstrak etanol 500 mg 0.65 0.0998 0.588 110.32 Rata-rata 111.29
Heyne, K. 1987. Tumbuhan Berguna Indonesia. Balitbang Kehutanan, Departemen Kehutanan. Jakarta.
Jawetz, E., J. Melnick and E. Adelberg. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Penerbit Buku Kedokteran EGC. Jakarta.
Kikuzaki H, Sanae H., Yayoi K., and Nobuji N. 1999. Antioxidative phenylpropanoids from berries of Pimenta dioica. J. of Phytochemistry 52: 1307-1312.
Kikuzaki H., Akemi s., Yoko M., and Nobuji N. 2000. Galloylglucosides from berries of Pimenta dioica. J. of Natural Products 63: 749-752.
Kochhar, S.P. and J.B. Russel. 1990. Detection, Estimation and Evaluation of Antioxidants in Food System. In : Food Antioxidant. Elsevier Applied Science. London.
Robinson, T. 1991. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Penerbit ITB. Bandung.
Simmons, C.G. and J. Craver. 1980. Antibiotic sensitivity test using the disk method. Australian Beaureau Animal Health. Brisbane.
Tyler, V.E., L.R. Brady and J.E. Robbers. 1988. Pharmacognosy 9th ed. Lea & Febiger. Philadelphia. Williams S. 1984. Official Methods of Analysis 14th ed. Association of Official Analytical Chemist
