655
Tema 3: Pangan, Gizi dan Kesehatan
TERAPI INFLAMASI NON INFEKSI
BERBASIS HERBAL DAUN JARAK PAGAR
DENGAN PENDEKATAN BIOMOLEKULER
Oleh
Warsinah, Hanif Nasiatul Baroroh, dan Sunarto
Jurusan Farmasi Fakultas Ilmu
–
Ilmu Kesehatan
Universitas Jenderal Soedirman
Email [email protected]
ABSTRAK
Ekstrak daun jarak pagar (Jatropa curcas) dilaporkan memiliki efek analgetik dan antiinflamasi pada mencit yang diinduksi albumin, serta antiarthritis pada tikus yang diinduksi Complete
Freud’s Adjuvant. Skrining fitokimia membuktikan bahwa jarak pagar mengandung senyawaflavonoid, steroid, triterpenoid, alkaloid, saponin, dan tanin. Dengan pendekatan biomolekuler seperti uji invitro dapat diketahui mekanisme antiinflamasi dari senyawa aktif daun jarak pagar yang berefek antiinflamasi, kemudian melalui uji in vitro dapat diketahui pula aktivitas gen sitokin IL-1 dan TNFα Target spesifik dari penelitian ini adalah menghasilkan senyawa aktif antiinflamasi dengan mekanisme antiinflamasi melalui aktifitas sitokin. Penelitian pada tahun pertama menghasilkan aktifitas isolat aktif terhadap aktivitas TNF-α sebesar 176.967 µg/ml dan aktivitas IL-1 sebesar 1024.077 µg/ml. hasil isolasi ternyata semakin murni senyawa semakin tinggi aktivitasnya terhadap TNF-α dan IL-1. Korelasi positif antara studi in vivo dan in vitro diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah yang jelas tentang farmakodinamik dari senyawa aktif.
Kata kunci: Jatropa curcas,isolat, sitokin, TNF-α dan IL-1.
ABSTRACT
Jatropa curcas extract was reported to have analgesic and anti-inflammatory effects on albumin-induced mice, as well as antiarthritis in Complete Freud's Adjuvant-albumin-induced mice. Phytochemical screening proves that J. curcas was contains of flavonoid, steroids, triterpenoids, alkaloids, saponins, and tannins compounds. Biomolecular approach to the invitro test can be known anti-inflammatory mechanism of J. curcas leaves of active compound of anti-inflammatory effect, in vitro test through can be known to gene activity of cytokine IL-1 and TNFα The specific target of this research was to produce anti-inflammatory of active compound
of mechanism cytokine activity.
The resulted of the activity of active isolates on TNF-α activity at 176,967 μg / ml and IL-1 activity at 1024.077 μg / ml. the result of the isolation was the more pure the higher the compound activity on TNF-α and IL-1.The positive correlation between in vivo and in vitro studies was expected to provide clear scientific information about the pharmacodynamics of the active compound
657
PENDAHULUAN
Inflamasi merupakan respon peradangan yang perlu diperhatikan secara serius.
pemanfaatan obat herbal yang berasal dari tanaman obat merupakan cara yang baik untuk
pencegahannya, tanaman yang secara empiris telah digunakan adalah daun jarak pagar dan
secara ilmiah juga telah terbukti memiliki daya antiinflamasi. Tanaman jarak pagar (Jatropha
curcas) telah diketahui memiliki aktivitas antiinflamasi dan antioksidan (Saxena et al.,2005).
James et al. (2011) membuktikan bahwa ekstrak metanol daun J. curcas mempunyai efek
antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 90,83 µg/ml. Selain itu, ekstrak metanol J. curcas juga
memilki aktivitas antiinflamasi yang signifikan (Mujumdar dan Misar, 2004). Baroroh dan
Warsinah (2010)melaporkan bahwa ekstrak etanol daun jarak pagar dosis 300 mg/kgBB dapat
menghambat peradangan sebesar 23,25% dan dosis 500 mg/kgBB mampu mengurangi
rekruitmen neutrofil pada kaki tikus. Warsinah et al (2015) juga melaporkan bahwa fraksi etil
asetat sebagai fraksi aktif dari ekstrak etanol pada dosis 150 mg/kg BB mampu menurunkan
volume oedem pada kaki tikus yang diinduksi karagenin
Skrining fitokimia yang dilaporkan oleh James et al. (2011) menunjukkan bahwa daun
J. curcas mengandung flavonoid, polifenol, dan saponin. Senyawa flavonoid, polifenol,
dansaponin dalam jarak pagarberpotensi sebagai antioksidan, antikanker dan antiinflamasi
(Thomas et al., 2008; Rathee et al., 2009). Oskoueian et al. (2011a) membuktikan bahwa getah
dan akar tanaman J. curcas berpotensi sebagai antiinflamasi melalui inhibisi enzim
inducibleNitric Oxide Synthase (iNOS) pada sel makrofag. Sementara Baroroh et al. (2014)
melaporkan ekstrak etanol daun J. curcas juga memiliki aktivitas antiartritis. Warsinah et al
(2015) juga melaporkan bahwa pada fraksi etil asetat mengandung senyawa flavonoid yang
mampu menurunkan volume oedem kaki tikus. Aktivitas antiinflamasi dan antioksidan yang
ditunjukkan tanaman J. curcas mengindikasikan bahwa tanaman ini berpotensi sebagai
alternatif terapi pada kondisi inflamasi baik akut maupun kronis.
Pada penelitian ini akan dilakukan pengujian efek antiinflamasi secara in vitro
sehingga dapat diketahui mekanisme aksinya sebagai inhibitor sitokin melalui pengamatan
ekspresi gen Tumor necrosis factor (TNFα) dan sitokin interleukin 1 (IL-1), Target utama dari
penelitian ini adalah untuk mendapat informasi mekanisme penghambatan inflamasi melalui
ekspresi gen dari isolat senyawa aktif hasil isolasi daun jarak pagar.
METODE PENELITIAN
A. Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi Farmasi, Laboratorium Farmasi
B. Alat dan Bahan
1. Alat Penelitian
Peralatan yang digunakan antara lain), ELISA reader (SLT 340 ATC), mikropipet
(Pipetman), neraca analitik (Sartorius), sentrifus (Sorval, MC 12 V 9700869), Vortex (Maxi
Mix H, Termolyne Type 3760),
2 Bahan Penelitian
a. Daun tanaman Jarak pagar (J. curcas) yang dikoleksi dari Kecamatan Kedungbanteng,
Banyumas.
b. Bahan uji mekanisme antiinflamasi: reagen kit IL-1, kit TNFα, kit EGF, Kit VEGF, NaCl
0,9%, dan aquadest.
C. CARA KERJA
Prosedur pemeriksaan TNF-α/IL-1 dengan teknik ELISA indirect (Sandwich) dengan
reagen Quantikine HS kit.
Microplate di-coated dengan murine monoclonal antibody yang spesifik untuk TNF-α
pada sumurannya, lalu ditambahkan 50 μL assay diluent HD1-11 ke dalam setiap sumuran, dan
200 μL standar (TNF-α/IL-1 standard) atau sampel ke dalam sumuran tersebut. TNF-α/IL-1
yang ada akan diikat oleh antibody yang di-coated dalam sumuran tadi. Sumuran ditutup
dengan penutup perekat, dan diinkubasi selama 14-20 jam pada suhu 2-8oC. Sumuran dicuci 4
kali dan ditambahkan 200 μL larutan conjugate yang mengandung polyclonal antibody berlabel
enzim spesifik untuk TNF-α/IL-1, kemudian ditutup dengan penutup perekat, diinkubasi selama
3 jam dalam suhu kamar. Selanjutnya sumuran dicuci 4 kali lagi, ditambahkan 50 μL larutan
substrat ke dalam setiap sumuran; ditutup dengan penutup perekat baru, kemudian diinkubasi
selama 60 menit dalam suhu kamar. Sumuran ini tidak dicuci, tetapi langsung ditambah dengan
50 μL larutan amplifier; ditutup dengan penutup perekat baru, kemudian diinkubasi selama
30menit dalam suhu kamar. Penambahan larutan amplifier ini mengawali munculnya perubahan
warna. Selanjutnya ditambahkan 50 μL stop solution (2N asam sulfat) ke dalam setiap sumuran.
Kemudian dibaca pada microplate reader dengan anjang gelombang 490 nm (dalam 30 menit),
pembacaan dikoreksi pada panjanggelombang 650 nm atau 690 nm. Penambahan stop solution
ini tidak berpengaruh terhadap warna dalam sumuran.
HASIL DAN PEMBAHASAN
1. Fraksinasi
Fraksinasi dilakukan dengan mengguakan pelarut n-heksan, kloroform dan etil asetat
dengan metode partisi cair-cair dengan pemilihan pelarut yang berbeda dan masing-masing
659 mempunyai polaritas yang berbeda sehingga apabila diuji aktivitasnya akan diketahui senyawa
pada masing-masing pelarut berdasarkan polaritas.
Fraksinasi tersebut menghasilkan 4 fraksi yaitu fraksi n-heksan, fraksi kloroform,
fraksi etilasetat dan fraksi residu (Tabel 1) dengan warna dan rendemen yang berbeda.
Rendemen tertinggi diperoleh pada residu dengan warna coklat merah dan rendemen terkecil
pada etil asetat dengan warna kuning.
Tabel 1. Hasil partisi ekstrak etanol dengan pelarut n-heksan, kloroform dan etil asetat
Fraksi Warna Berat fraksi (g) % rendemen
n-heksan Kuning 7,69 1,44
Kloroform hijau 3,35 0,67
etilasetat Hijau kekuningan 1,98 0,42
Residu Coklat 31,24 61,24
Fraksinasi dilakukan untuk memisahkan senyawa berdasarkan sifat kepolarannya.
Penarikan senyawa non polar seperti lemak dilakukan dengan penambahan pelarut n-heksan
berulang kali sampai semua senyawa non polar tertarik dalam n-heksan, yang terindikasi dari
warna pelarut. Setelah itu dilakukan penarikan senyawa yang lebih polar berturut-turut dengan
kloroform, dan etil asetat dengan cara yang sama (table 2), masing-masing fraksi tersebut diuji
aktivitas antiinflamasinya untuk menentukan fraksi yang aktif. fraksi aktif di fraksinasi lagi
dengan kromatografi kolom menghasilkan 4 isolat. Kemudian masing – masimh isolat di uji
aktivitasnya terhadap TNF- α dan IL-1.
Table 2. hasil pemisahan fraksi aktif
isolat bentuk Warna Berat fraksi (mg) % rendemen
1 Kristal lengket Kuning 17,69 1,44
2 Kristal lengket oange 13,35 1,67
3 kristal putih 11,98 1,42
4 Kristal putih 11,24 1,24
Hasil pengamatan berdasarkan aktivitas TNF-α dari isolat yang diperoleh dari Fraksi
gabungan yang paling aktif kemudian di fraksinasi lagi untuk memperoleh isolat yang murni.
Fraksi yang paling aktif adalah fraksi Fg3 dengan nilai TNF-α sebesar 244 µ/ml dilakukan
pemurnian dengan jalan dipisahkan dengan metode kromatografi kolom dan didapat 4 isolat
kemudian diuji aktifitas TNF-α pada masing-masing isolat. Keempat isolat memberikan
aktivitas yang berbeda yaitu isolat 1 memberikan akfititas sebesar 176, 967 µ/ml, isolat 2
sebesar 353.655 µ/ml, isolat 3 sebesar 314.799 µ/ml dan isolat 4 sebesar 197.019 µ/ml. pada
pengukuran aktifitas TNF-α diperoleh isolat yang paling aktif adalah isolat 1 dan diikuti isolat 4
kemudian isolat 3 dan isolat 2. Isolat yang mempunyai aktifitas paling rendah adalah isolat 2.
Kontrol (-) Control (+) perlakuan std
TNF-α Sampel TNF-α TNF-α Rerata TNF-α
sampel TNF-α TNF-α Rerata TNF-α 1 40 A2,C3=SNI 207.115 76.639 141.877 D5,F6=I1 161.921 192.052 176.967 2 80 B2,D3=SN2 57.852 62.438 60.145 E5,G6=I2 348.033 359.277 353.655 3 160 C2,E3=SN3 214.078 85.307 149.693 G5,A7=I3 357.885 271.713 314.799 4 320 D2,F3=SN4 61.487 74.731 68.109 H5,B7=I4 233.380 160.658 197.019 5 640 E2,G3=SN5 194.772 241.699 218.236
Tumor necrosis factor alpha (TNF-α) merupakan sitokin utama pada respon inflamasi
akut terhadap bakteri Gram -negatif dan mikroba lainnya. Infeksi yang berat dapat memicu
produksi TNF dalam jumlah besar yang menimbulkan reaksi sistemik. TNF disebut TNF-α atas
dasar historis dan untuk membedakannya dari TNF -β atau limfotoksin. Sumber utama TNF-α
ialah fagosit mononuklear dan sel T yang diaktifkan antigen, sel NK, dan sel mast.
Lipopolisakarida merupakan rangsangan poten terhadap makrofag untuk menyekresi TNF. IFN-γ yang diproduksi sel T dan sel NK juga merangsang makrofag antara lain meningkatkan sintesis TNF (Soeroso, 2007).
TNF-α mempunyai beberapa fungsi dalam proses inflamasi, yaitu dapat meningkatkan
peran pro trombotik dan merangsang molekul adhesi dari sel leukosit serta menginduksi sel
endotel, berperan dalam mengatur aktivitas makrofag dan respon imun dalam jaringan dengan
merangsang faktor pertumbuhan dan sitokin lain, berfungsi sebagai regulator dari hematopoetik
serta komitogen untuk sel T dan sel B serta aktivitas sel neutrofil dan makrofag.TNF-α juga
memiliki fungsi tambahan yang menguntungkan termasuk peranannya dalam respon imun
terhadap bakteri, virus, jamur, dan invasi parasit. (Soeroso, 2007 dan Yani et al, 2011).
Hampir semua proses inflamasi mengakibatkan aktivasi makrofag jaringan dan
infiltrasi monosit darah. Aktivasi ini menyebabkan banyak perubahan dalam sel, di antaranya
ialah produksi TNF, IL-1, dan IL-6, yaitu sitokin-sitokin yang meyebabkan efek multipel pada
hospes. Efek-efek ini meliputi: 1) induksi demam; 2) respon fase akut hepatic yang disertai
lekositosis dan produksi protein fase akut seperti C - Reactive Protein (CRP); dan 3) diferensiasi
atau aktivasi dari sel T, sel B dan makrofag (Ishartadiati K. 2009) Interleukin-1 juga dikenal
sebagai leukocyte activating factor, B cell activating factor, mononuclear cell factor, leukocyte
endogenous mediator, hemopoeitin-1 dan sejumlah nama lain.
Interleukin-1 adalah sebutan bagi beberapa polipeptidasitokinaIL-1α, 1ß dan
IL-1Ra, yang memainkan peran penting dalam regulasi sistem kekebalan dan respon
peradangan.IL-1α dan IL-1ß masing-masing memiliki berkas genetik IL1A dan IL1B, pada
kromosom 2 deret yang sama yaitu 2q14, dan merupakan sitokina pleiotropik hasil
661 Induksi COX-2 pada sitokina ini di dalam sistem saraf pusat ditemukan sebagai penyebab
hipersensitivitas yang memberikan rasa sakit.
Pada pengamatan aktivitas interleukin -1 (IL-1) ternyata hasilnya mirip dengan pada
pengamatan TNF-α, semakin murni senyawa semakin menunjukkan aktivitas yang tinggi
terbukti dengan kadar interleukin yang diperolehnya semakin murni senyawa semakin kecil
kadar interleukinnya. Interleukin adalah salah satu dari beberapa limfokin yang
mempromosikan makrofag dan sel T pembunuh dan sel B dan komponen lain dari sistem
kekebalantubuh. Interleukin merupakan kelompok sitokin ( disekresi hormon ) yangpertama kali
diekspresikan oleh sel darah putih (leukosit).
Interleukin adalah salah satu dari beberapa limfokin yang mempromosikan makrofag
dan sel T pembunuh dan sel B dan komponen lain dari sistem kekebalan tubuh. Interleukin
merupakan kelompok sitokin (disekresi hormon) yangpertama kali diekspresikan oleh sel darah
putih (leukosit). Fungsi dari sistem kekebalan tubuh tergantung di bagian besar pada interleukin,
dan jarang kekurangan dari sejumlah yang telah dijelaskan dengan lengkap penyakitautoimun
atau defisiensi imun. Isolat hasil pemurnian juga diuji aktifitas terhadap IL-1. Keempat isolat
memberikan aktivitas yang berbeda yaitu isolat 1 memberikan akfititas sebesar 1024.077 µ/ml,
isolat 2 sebesar 2252.002 µ/ml, isolat 3 sebesar 2243.906 µ/ml dan isolat 4 sebesar 1585.164
µ/ml. Hasil pengukuran aktifitas IL-1 yang paling aktif terjadi pada isolat 1 dan diikuti isolat 4
kemudian isolat 3 dan isolat 2. Isolat yang mempunyai aktifitas paling rendah adalah isolat 2
dan 3, mempunyai aktivitas yang hampir sama dan yang paling tinggi pada isolat 1(tabel 3).
Sejalan dengan pengamatan TNF-α yang memberikan model aktivitas yang sama dengan
aktivitas IL-1.
Tabel 4. Hasil pengamatan IL-1 pada isolat daun jarak pagar
Kontrol (-) Control (+) perlakuan
917.837 917.837 917.837 E5,G6=I2 2312.95 0
Interleukin-1 adalah sebutan bagi beberapa polipeptida sitokina IL-1α, IL-1ß dan
IL-1Ra, yang memainkan peran penting dalam regulasi sistem kekebalan dan respon peradangan.
deret yang sama yaitu 2q14, dan merupakan sitokina pleiotropik hasil sekresi monosit dan
makrofaga berupa prohormon, sebagai respon saat sel mengalami cedera, oleh karena itu
menginduksi apoptosis. Induksi COX-2 pada sitokina ini di dalam sistem saraf pusat ditemukan
sebagai penyebab hipersensitivitas yang memberikan rasa sakit.
Meskipun IL 1 dan TNF berbeda secara biokimia dan terikat pada reseptor membran
sel yang berbeda, namun masing-masing hanya menunjukkan beberapa sifat biologis yang
berbeda, dan memiliki banyak aktivitas yang sama. Dengan demikian, IL 1 dan TNF bersifat
radioprotektif, memiliki efek sitosidal untuk beberapa sel tumor, merombak tulang dan tulang
rawan, menyebabkan demam, pembengkakan, fibroplasia, dan angiogenesis. Efek tumpang
tindih IL 1 dan TNF sebagian disebabkan oleh induksi spektrum sitokin dan reseptornya yang
sama. Baik IL 1 dan TNF menginduksi reseptor IL 2, IL 6, faktor stimulasi koloni dan protein
fase akut yang dapat berkontribusi pada efek immunoenhancing, inflammatory dan
radioprotective mereka. IL 1 dan TNF sering juga dilepaskan secara kooperatif oleh sel dan
memiliki efek kooperatif. Sebagai contoh, IL 1 bersama TNF memiliki efek radioprotektif
sinergisin dan efek diferensiasi terminal in vitro pada sel tumor. Secara keseluruhan, data ini
menunjukkan adanya jalur transduksi sinyal post-reseptor yang umum dan berbeda untuk IL 1
dan TNF. IL 1 dan TNF masing-masing dapat menginduksi sejumlah jenis sel untuk
menghasilkan IL 6, yang tampaknya bertindak sebagai sitokin "spektrum luas" lainnya. Selain
itu, IL 1 dan TNF menginduksi produksi NAP-1 oleh monosit manusia dan fibroblas. Sitokin
baru yang telah dimurnikan, diurutkan, diklon, diekspresikan dan disintesis, dapat menjelaskan
beberapa efek peradangan akut dari sitokin ini. Aktifitas inflamasi dari IL1 dan TNF Meskipun
itu dilakukan secara in vitro, ternyata hasilnya bahwa IL-1 dan TNF-α psda inflamasi
menunjukkan efek dengan jumlah yang hamper sama dan mem[punyai kesamaan, efek ini juga
ditunjukkan pada penelitian in vivo.
KESIMPULAN
Hasil penelitian tentang Terapi Inflamasi Non Infeksi Berbasis Herbal Daun Jarak
Pagar Dengan Pendekatan Biomolekuler Melalui aktivitas Gen Sitokin r dapat disimpulkan:
1. Hasil aktivitas terhadap TNF-α pada isolat aktif sebesar 176.967 µg/ml dan aktivitas IL-1
sebesar 1024.077 µg/ml
2. Semakin murni senyawa semakin besar aktivitasnya terhadap TNF-α dan IL-1
UCAPAN TERIMA KASIH
Kepada rector dan ketua Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat
663
DAFTAR PUSTAKA
Anne, B.E.S and Garret, A., 2006, Analgesic-antipyretic agents;in pharmacotherapy of gout, in pharmacological basis of therapeutics. 7th Ed. Good man & Gilmans.
Balaji, R, Suba V, rekha N, Deecaraman M, 2009, Hepatoprotective Activity Of Methanolic Fraction of Jatropha curcas on Aflatoxin B1 Induced Hepatic Carcinoma, Int. J. Ph. Sci , 1 (2): 287-296.
Baroroh H.N. dan Warsinah, 2010, Antiinflammatory Activity of Ethanolic Extract of Leaves of Jarak Pagar (Jatropa curcas L.) and Neutrophils Profile in Rats Foot Induced Carrageenan, Proceedings of International Conference On Medicinal Plants, 22-23 July 2010.
Baroroh, H.N. dan Rachmani, E.P.N., 2011, Acute Toxicity of Etanolic Extract of Jarak Pagar (Jatropa curcas L.) on Balb/c Male Mice, International Seminar Natural Product for Cancer Chemoprevention, Faculty of Pharmacy UMP, 5 Juli 2011.
Baroroh, H.N., Warsinah, Harwoko, 2011, The Cleaving Activity Assay on Supercoiled DNA by protein fraction from Jatropa curcas leaves, Proceeding The First International Conferenc on Medicine and Health Sciences; Interprofessional Education: Walking Through Collaborative Learning to Collaborative Practice, 29 December 2011.
Baroroh, H.N., Warsinah, dan Harwoko, 2012, Aktivitas Fraksi Protein Jatropa curcas sebagai Antikanker terhadap Ekspresi p53 pada Kulit Mencit Pasca Pemaparan DMBA dan UVB,
Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia, Vol. 10 No.2: 138-143.
Baroroh, H.N., Sobri, I., Rachmani, E.P., Hertiani, T., Ikawati, Z., 2014, Jatropha curcas leaves for relieve of adjuvant-induced arthritis in rats, Universa Medicina, 33(1): 10-17.
Ikawati, 2014, Farmakologi Molekuler : Target aksi obat dan mekanisme molekulernya, Gadjah Mada university Press, Yogyakarta.
Ishartadiati K. 2009, Peranan TNF, IL-1, dan IL-6 pada respon imun terhadap protozoa. Surabaya: FK Universitas Wijaya Kusuma.
James, O., Unekwojo, E.G., Ojochenemi, A.A., 2011, Assesment of Biological Activities: A Comparison of Pergularia daemia and Jatropha curcas Leaf Extracts, British Biotechnology Journal, 1(3): 85-100.
Mujumdar, A.M. dan Misar, A.V., 2004, Anti-Inflammatory Activity of Jatropha curcas Roots in Mice and Rats, J. Ethnopharmacol., 90: 11-15.
Oskoueian, E., Abdullah, N., Saad, W.H., Omar, A.R., Ahmad, S., Kuan, W.B., Zolkifli, N.A., Hendra, R., Ho, Y.W., 2011a, Antioxidant, Anti-Inflammatory, and Anticancer Activities of Methanolic Extracts from Jatropha curcas Linn., J. Med. Plant. Res, 5(1): 49-57.
Rathee, P., Chaudhary, H., Rathee, S., Rathee, D., Kumar, V., Kohli, K., 2009, Mechanism of action of flavonoids as anti-inflammatory agents: a review., Inflamm. Allergy Drug Targets, 8(3): 229-235.
Soeroso A. Sitokin. Oftalmologi Indonesia. 2007;5:171-80
Thomas, R., Sah, N., Sharma, P., 2008, Therapeutic Biology of Jatropha curcas: A Mini Review. Curr. Pharm. Biotechnol., 9(4): 315-324.
Uche, F.I. and Aprioku, J.S., 2008, The Phytochemical Constituents, Analgesic and Anti-Inflammatory Effects of Methanol Extract of Jatropha curcas Leaves in Mice and ister Albino Rats, J. Appl. Sci. Environ. Manage., 12(4): 99-102.
