54
Pemanfaatan Limbah Kulit Nanas sebagai Substrat oleh
Lactobacillus lactis untuk Produksi Asam Laktat
(Utilization of Pineapple Skin Waste As Substrates to Produce Lactic Acid by
Lactobacillus lactis)
Mira Andam Dewi*, Muharam Marzuki, R. Dellique Dieratu
Fakultas Farmasi, Universitas Jenderal Achmad Yani, Cimahi
*Corresponding email: [email protected]
ABSTRAK
Kulit nanas merupakan limbah yang mengandung karbohidrat cukup tinggi. Karbohidrat pada kulit nanas dapat dimanfaatkan sebagai substrat oleh Lactobacillus lactis untuk menghasilkan asam laktat melalui jalur metabolisme glikolisis. Penelitian dilakukan beberapa tahap, dimulai dari identifikasi bakteri Lactobacillus lactis, kemudian penentuan kurva pertumbuhan Lactobacillus lactis pada media MRS Broth. Dilanjutkan dengan pembuatan substrat yaitu menghidrolisis karbohidrat menjadi glukosa. Kondisi fermentasi untuk produksi asam laktat dilakukan pada suhu 400C, pH awal 5 dan kecepatan pengocokan 150 rpm. Asam laktat yang dihasilkan selama fermentasi di analisis secara kualitatif dan kuantitatif yaitu dengan cara titrasi asam basa. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kadar asam laktat tertinggi dihasilkan pada komposisi substrat 500 g/L kulit nanas yaitu sebesar 1,834% b/v setelah 24 jam fermentasi.
Kata Kunci: Kulit nanas, Lactobacillus lactis, asam laktat, glikolisis PENDAHULUAN
Kulit nanas merupakan limbah berbagai pengolahan produk agroindustri yang masih jarang dimanfaatkan. Berdasarkan kandungan nutriennya, ternyata kulit nanas mengandung karbohidrat dan gula yang cukup tinggi. Maka kulit nanas memungkinkan untuk dimanfaatkan sebagai bahan baku pembuatan bahan kimia, salah satunya adalah asam laktat melalui proses fermentasi. Kulit nanas mengandung 81,72% air, 20,87% serat kasar, 17,53% karbohidrat, 4,41% protein dan 13,65% gula reduksi (Rahman, N. A.dan Harimbi S., 2012). Dalam penelitian ini digunakan limbah kulit nanas sebagai substrat fermentasi. Glukosa pada kulit nanas dapat
dimanfaatkan sebagai sumber karbon pada media pertumbuhan Lactobacillus lactis untuk menghasilkan asam laktat. Asam laktat merupakan salah satu solusi masalah pencemaran alam karena karakteristiknya sangat ramah lingkungan sehingga dikenal sebagai the green solvent compound and biodegradable plastic raw material. Senyawa asam laktat juga dibutuhkan dalam industri lainnya, mulai dari industri makanan sampai dengan industri kosmetika (Febriningrum, P. N., 2013). Sebanyak 70% dari total asam laktat yang diperdagangkan digunakan dalam makanan dan pengolahan makanan sebagai pengatur pH, bahan pengawet dan agent buffer. Asam laktat
55 digunakan sebagai bahan pengawet makanan
dan merupakan bahan baku (feedstock) industri polimer biodegradable, oxygenated chemicals, pengatur pertumbuhan tanaman, dan pelarut yang ramah lingkungan. Salah satu terapan yang paling menjanjikan dari asam laktat adalah sebagai bahan baku pembuatan PLA (poly lactic
acid) yang bersifat biodegradable dan
biocompatible sebagai alternatif pengganti
plastik non-biodegradable yang dihasilkan dari minyak bumi, batu bara atau gas alam (Wignyanto, Suharjono, dan Novita, 2001). METODE PENELITIAN
Alat
Alat-alat yang digunakan antara lain: erlenmeyer, pipet tetes, pipet volume, tabung reaksi, termometer, blender, pH meter, rotary shaker, pembakar spiritus, kaki tiga dan kasa, timbangan analitik (Sartorius BL 2105), penangas air, batang pengaduk, spektrofotometer sinar tampak (Shimadzu-1601), autoklaf, inkubator, cawan petri.
Bahan
Bahan yang digunakan limbah kulit nanas dari Pasar Kosambi Bandung, kultur bakteri Lactobacillus lactis koleksi Laboratorium Mikrobiologi SITH Institut Teknologi Bandung, MRSA (Mann Rogose and Sharpe Agar), MRSB (Mann Rogose and Sharpe Broth), asam sulfat 4%, amonium klorida, aquadest, natrium hidroksida pro analisis, asam oksalat pro analisis, kalsium karbonat, indikator fenolftalein, TSIA (Triple Sugar Iron Agar), kalium permanganat, besi (III) klorida.
Peremajaan Bakteri Starter
Peremajaan bakteri Lactobacillus lactis dilakukan pada media MRSA. Media MRSA dibuat
dari 26 g MRSA yang ditambahkan 500 mL aquadest, lalu disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit.Biakan bakteri
Lactobacillus lactis diinokulasi sebanyak 1 ose
dan digoreskan pada permukaan media MRSA secara aseptis, kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam.
Identifikasi Bakteri Starter
a. Identifikasi Lactobacillus lactis Secara Makroskopis
Bakteri Lactobacillus lactis ditumbuhkan pada MRSA, kemudian diinkubasi pada suhu 370C selama 24 jam. Kemudian, dilakukan pengamatan terhadap bentuk, permukaan dan warna spesifik dari bakteri pada media pertumbuhan.
b. Identifikasi Lactobacillus lactis Secara Mikroskopis (Pewarnaan Gram)
Bakteri Lactobacillus lactis disapukan sedikit di atas kaca obyek, ditambahkan 1 tetes air, kemudian disuspensikan. Ditambahkan zat warna karbol gentian violet dan dibiarkan selama satu menit, lalu dibilas dengan air suling. Ditambahkan Lugol dan dibiarkan selama dua menit, lalu bilas dengan air suling. Tetesan yang terbentuk dicuci dengan alkohol sampai seluruh zat warna terlarut, lalu dibilas dengan air. Ditambahkan pewarna safranin dan dibiarkan selama satu menit, lalu dibilas dengan air. Kemudian diteteskan minyak imersi pada preparat dan dilakukan pemeriksaan dibawah mikroskop dengan perbesaran 10-1000 kali.
c. Identifikasi Lactobacillus lactis Menggunakan Media TSIA
56 Media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) diisikan
pada dua tabung reaksi, 1 tabung dibuat tegak dan 1 tabung dibuat miring. Diinokulasikan bakteri starter, untuk media yang tegak dengan cara ditusuk, sedangkan untuk media yang miring dengan cara digores. Diinkubasi kedua tabung tersebut pada suhu 370C selama 24 jam. Pengamatan berdasarkan adanya pembentukkan gelembung-gelembung gas, pembentukkan gas H2S dan perubahan warna media. Jika warna media menjadi kuning dapat diartikan reaksi positif glukosa-laktosa, tetapi jika warna media tidak berubah (tetap merah) dapat diartikan reaksi negatif glukosa-laktosa.
Pembuatan Kurva Pertumbuhan Lactobacillus lactis
Kurva pertumbuhan dilakukan dalam media MRSB (Mann Rogose and Sharpe Broth). Media MRSB dibuat dari 26 g MRSB yang ditambahkan 500 mL aquadest. Kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 1210C selama 15 menit. Biakan Lactobacillus lactis usia 24 jam pada media MRSA disuspensikan ke dalam larutan garam fisiologis secara aseptis. Kepekatan diatur sehingga memberikan transmitan 25% pada panjang gelombang 580 nm. Suspensi Lactobacillus
lactis diinokulasikan sebanyak 10% v/v secara
aseptis ke dalam labu erlenmeyer berisi media MRSB, kemudian diinkubasi dalam inkubator kocok dengan kecepatan 150 rpm pada suhu 400C. Pengamatan dilakukan setiap jam selama 48 jam dengan mengukur kekeruhan substrat menggunakan Spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang 580 nm. Nilai transmitan hasil pengukuran dikonversikan menjadi nilai serapan. Data serapan dan waktu pengambilan sampel menghasilkan kurva pertumbuhan bakteri
yaitu kurva serapan terhadap waktu. Data serapan yang diukur merupakan gambaran jumlah populasi sel bakteri pada setiap fase pertumbuhan.
Pembuatan Substrat Fermentasi
Kulit nanas dipisahkan dari kotoran-kotoran yang menempel, kemudian dipotong kecil-kecil, lalu dimasukkan dalam oven pada temperatur 70oC untuk mengurangi kadar air. Setiap hari dilakukan penimbangan kulit nanas. Jika berat kulit nanas 2 hari berturut-turut sama atau mendekati sama, maka pemanasan dihentikan karena diasumsikan kandungan airnya sudah habis. Kulit nanas kering ditimbang sebanyak 300 g, 400 g, dan 500 g untuk volume kerja 1000 mL, diblender dan ditambah aquadest pada masing-masing variasi berat kulit nanas, kemudian dilakukan proses pemanasan selama 2 jam pada temperatur 800C dengan penambahan H2SO4 4% sebanyak 125 mL untuk memecah karbohidrat menjadi glukosa. Setelah proses pemanasan, sari kulit nanas disaring dan dimasukkan ke dalam botol penampung yang bersih dan steril untuk masing-masing konsentrasi (300 g/1000 mL, 400 g/1000 mL dan 500 g/1000 mL) sebanyak 250 mL. Kemudian didinginkan dalam keadaan tertutup. Keasaman medium diatur pada pH awal 5 dengan penambahan CaCO3. Ditambahkan pula 12,5 g/L amonium klorida sebagai nutrisi. Selanjutnya botol-botol yang berisi medium tersebut ditutup dengan kapas sumbat serta dilapisi dengan kertas sampul, lalu disterilisasi pada suhu 1210C selama 15 menit.
Proses Fermentasi dan Produksi Asam Laktat a. Pembuatan Starter
Menginokulasi biakan kultur murni sebanyak 10% v/v dari 250 mL medium starter. Kemudian menyimpan botol di dalam inkubator kocok kecepatan 150 rpm dengan
57 suhu 400C, selama 24 jam atau sampai fase
logaritmik berakhir. pH awal diatur 5 dengan penambahan CaCO3.
b. Proses Fermentasi
Substrat yang telah steril dimasukkan ke dalam inkubator kocok dengan kecepatan pengadukan 150 rpm pada suhu 400C. Diinokulasi biakan kultur murni yang berasal dari medium starter sesuai dengan kombinasi perlakuan yang telah ditentukan (variasi konsentrasi substrat). Jumlah biakan yang diinokulasi sebanyak 10% v/v dari 250 ml medium fermentasi. Pengujian metabolit hasil fermentasi dilakukan pada awal fase log, akhir fase log dan awal fase stasioner dari kurva pertumbuhan. Substrat hasil fermentasi yang diharapkan mengandung asam laktat kemudian di sentrifugasi pada 3000 rpm selama 20 menit. Supernatan dan biomassa dipisahkan, selanjutnya dilakukan pengujian asam laktat.
Analisis Kualitatif Asam Laktat
a. Jika larutan laktat direaksikan dengan asam sulfat encer dan larutan kalium permanganat dan dipanaskan, akan terjadi asetaldehida, yang dapat dikenal dari baunya.
b. Jika sampel ditambahkan dengan besi (III) klorida, sampel akan menghasilkan larutan berwarna kuning.
c. Jika sampel ditambahkan dengan larutan iodin dan natrium hidroksida, maka akan menghasilkan larutan berwarna kuning jika mengandung asam laktat.
Analisis Kuantitatif Asam Laktat
Pengukuran total asam laktat tertitrasi dilakukan dengan metode Fardiaz (1987). Sampel sebanyak 5 mL di titrasi dengan larutan NaOH 0,1 N dengan indikator fenolftalein. Titrasi dihentikan setelah terbentuk warna merah muda yang tetap
(terjadi perubahan warna). Total asam laktat dihitung sebagai persentase asam laktat dengan rumus:
𝑉1 𝑥 𝑁 𝑥 𝐵
𝑉2 𝑥 1000
𝑥 100%
Keterangan :V1 = Volume NaOH yang digunakan (mL) V2 = Berat sampel yang dititrasi (gram) N = Normalitas NaOH
B = Berat Molekul Asam Laktat (90) HASIL DAN DISKUSI
1. Hasil Identifikasi Bakteri Starter Lactobacillus lactis
Bakteri Lactobacillus lactis yang akan digunakan sebagai starter dilakukan proses identifikasi untuk melihat kebenaran dan kemurnian kultur bakteri. Di identifikasi secara makroskopis dengan melihat warna dan permukaan koloni bakteri.Lalu di identifikasi secara mikroskopis dengan pewarnaan Gram, diperoleh bakteri berbentuk batang dengan Gram positif.Bakteri di uji pula dengan menggunakan media TSIA (Triple Sugar Iron Agar) untuk melihat penggunaan gula pada keberlangsungan hidup bakteri. Tabel 1 menunjukkan hasil identifikasi bakteri Lactobacillus lactis.
2. Kurva Pertumbuhan Lactobacillus lactis Kurva pertumbuhan dilakukan pada media MRSB (Mann Rogose and Sharpe Broth) untuk memperoleh hasil yang lebih akurat dibandingkan pada substrat fermentasi. Suspensi sel bakteri sebanyak 10% v/v dengan transmitan 25% diinokulasikan pada media MRSB. Pengukuran pertumbuhan bakteri dilakukan dengan metode turbidimetri, yaitu melihat jumlah sel bakteri dengan mengukur kekeruhan dengan spektrofotometer pada
58 panjang gelombang 580 nm yang dilakukan
selama 48 jam dengan selang waktu 1 jam. Metode tersebut termasuk metode tidak langsung, karena tidak dapat membedakan antara bakteri yang hidup dengan yang sudah mati sehingga seolah-olah tidak ada fase kematian (Dwipayana dan Herto Dwi Ariesyady, 2009). Kurva pertumbuhan memberikan informasi penting mengenai fase pertumbuhan dan metabolisme bakteri. Hasil kurva pertumbuhan Lactobacillus lactis pada media MRSB memiliki tipe pertumbuhan yang hampir sama seperti semua bakteri pada umumnya, yaitu terjadinya fase log yang dilanjutkan dengan fase stasioner.
Berdasarkan hasil kurva pengamatan pertumbuhan Lactobacillus lactis pada media MRSB, diperkirakan memasuki awal fase log pada jam ke 3, akhir fase log atau awal fase stasioner pada jam ke 21-24, dan hingga jam ke 48 masih mengalami fase stasioner. Menurut Stacy (1998), menyatakan bahwa waktu pertumbuhan optimum bakteri Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus adalah 12-18 jam (Pratama, Ridho, 2012).
3. Proses Fermentasi dan Produksi Asam Laktat Hasil metabolisme pada saat lag phase sebagian besar berupa asam laktat yang dimanifestasikan oleh adanya penurunan nilai pH. Produksi asam ini suatu saat menjadi penghambat dalam pertumbuhan mikroba yang bersangkutan (efek negative feed back) (Koroleva, 1991), yaitu ketika telah mencapai fase stasioner bakteri tidak tumbuh lagi bahkan banyak yang lisis atau mati (Usmiati, Sri dan Tri Marwati, 2007).
4. Analisis Kualitatif Asam Laktat
Untuk mengetahui keberadaan asam laktat pada media fermentasi, dilakukan uji kualitatif terlebih dahulu.Pengujian metabolit hasil
fermentasi dilakukan pada awal fase log, akhir fase log dan awal fase stasioner dari kurva pertumbuhan. Semua analisis kualitatif menghasilkan reaksi positif untuk semua sampel yang di uji, dari sampel awal fase log (kemungkinan jam ke 3) hingga awal fase stasioner (kemungkinan jam ke 21-24). Sehingga dapat diambil kesimpulan bahwa asam laktat telah diproduksi dari awal fase log dan terus bertambah hingga awal fase stasioner.
5. Analisis Kuantitatif Asam Laktat
Untuk mengetahui kadar asam laktat yang berada pada sampel, maka dilakukan uji kuantitatif dengan metode titrasi alkalimetri. Dari hasil penelitian menunjukkan bahwa komposisi substrat terbaik yang menghasilkan asam laktat paling banyak adalah 500 g/L kulit nanas dibandingkan dengan komposisi 300 g/L dan 400 g/L kulit nanas. Untuk komposisi 500 g/L, kadar asam laktat pada jam ke 3 adalah 1,726% b/v dan pada jam ke 24 setelah fermentasi kadar asam laktatnya 1,834% b/v. Sedangkan untuk komposisi 300 g/L dan 400 g/L, kadar asam laktat pada jam ke 24 setelah fermentasi secara berturut-turut adalah 1,375% b/v dan 1,747% b/v. Perbedaan asam laktat yang dihasilkan selama fermentasi dapat disebabkan oleh faktor nutrisi yang dibutuhkan untuk bakteri berkembangbiak. Pada komposisi 300 g/L dan 400 g/L kulit nanas kemungkinan nutrisi untuk bakteri belum tercukupi secara sempurna sehingga asam laktat yang dihasilkan pun jauh lebih sedikit. Sedangkan pada komposisi 500 g/L kulit nanas, nutrisi untuk bakteri telah tercukupi sehingga bakteri dapat tumbuh secara optimal dan menghasilkan asam laktat yang lebih banyak. Menurut Nystrom (2004), ketika sumber nutrisi tercukupi, sumber
59 nutrisi akan digunakan untuk pertumbuhan,
sebaliknya ketika sumber nutrisi ada pada jumlah yang terbatas, semua energi mikroba
akan dikonsentrasikan untuk survival atau bertahan hidup (Yudhi, Andri, dkk).
Tabel 1. Hasil Identifikasi Bakteri Starter Lactobacillus lactis No. Bentuk Pengamatan
Lactobacillus lactis
Hasil Pustaka
1 Makroskopis dan Mikroskopis
Bentuk Batang Sesuai
Permukaan Licin Sesuai
Warna Putih Sesuai
2 Pewarnaan Gram* Gram positif Sesuai
3 Media TSIA Tegak
Laktosa/sakarosa (+)
Gas H2S (-) Sesuai
Miring Glukosa (+) Gas dan gas H
2S (-) Sesuai
Keterangan : )* = Berdasarkan pustaka Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology sebagai acuan pemeriksaan.
Gambar 2. Kurva pertumbuhan Lactobacillus lactis dalam media MRS Broth yang diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 580 nm
Gambar 2. Kurva penurunan pH substrat kulit nanas selama proses fermentasi
0.0000 0.5000 1.0000 1.5000 2.0000 2.5000 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41 43 45 47 49 Se rap an (A) Waktu (Jam) 0 1 2 3 4 5 3 4 5 18 19 20 21 22 23 24 pH Waktu (Jam) 300 g/L 400 g/L 500 g/L
60
Gambar 3. Kurva total asam laktat dalam substrat kulit nanas yang dianalisis dengan metode titrasi alkalimetri
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa substrat kulit nanas dapat digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri Lactobacillus lactis.
Konsentrasi substrat terbaik yang menghasilkan asam laktat paling banyak adalah 500 g/L kulit nanas dibandingkan dengan konsentrasi 300 g/L dan 400 g/L kulit nanas, dengan total asam laktat 1,834% b/v setelah 24 jam fermentasi.
DAFTAR PUSTAKA Dwipayana dan Herto Dwi Ariesyady. 2009. “Identifikasi
Keberagaman Bakteri Pada Lumpur Hasil Pengolahan Limbah Cat Dengan Teknik Konvensional”. Institut Teknologi Bandung.
Febriningrum, P. N. 2013. “Pengaruh Konsentrasi Substrat Kulit Nanas dan Kecepatan Pengadukan
terhadap Pertumbuhan Lactobacillus plantarum
untuk Produksi Asam Laktat”.Jurnal Rekayasa Kimia
dan Lingkungan. Volume 9, No. 3, Hal. 144-151.
Pratama, Ridho. 2012. Pemanfaatan Metabolit
Ekstraseluler Lactobacillus delbrueckii subsp.
bulgaricus Dalam Pembentukan Nanopartikel Perak.
Skripsi. Bogor: Institut Pertanian Bogor.
Rahman, N. A. dan Harimbi S. 2012. “Peningkatan Kadar Bioetanol dari Kulit Nanas Menggunakan Zeolit Alam
dan Batu Kapur”. Jurnal Teknik Kimia. Volume 6, No.
2, Hal. 46-49.
Usmiati, Sri dan Tri Marwati. 2007. “Seleksi dan Optimasi
Proses Produksi Bakteriosin dari Lactobacillus sp”.
J.Pascapanen. Hal. 27-37.
Wignyanto, Suharjono, dan Novita. 2001. “Pengaruh Konsentrasi Gula Reduksi Sari Hati Nanas dan
Inokulum Saccharomyces cerevisiae Pada
Fermentasi Etanol”. Jurnal Teknologi Pertanian.
Volume 2, No. 1, Hal.68-77.
Yudhi, Andri, dkk. “Proses Fermentasi Pati Singkong
Mentah oleh Lactobacillus plantarum B9 (Kajian
Jenis dan Konsentrasi Sumber Nitrogen)”. Universitas Brawijaya Malang.
0 0.5 1 1.5 2 3 4 5 18 19 20 21 22 23 24 To tal A sam Laktat ( % b /v ) Waktu (Jam) 300 g/L 400 g/L 500 g/L
