EFEK PEMBERIAN EKSTRAK BIJI JARAK PAGAR (Jatropha curcas L) TERHADAP STRES OKSIDATIF DAN DIAMETER VENA SENTRALIS HEPAR

EFEK PEMBERIAN EKSTRAK BIJI JARAK PAGAR (Jatropha curcas L) TERHADAP STRES OKSIDATIF

DAN DIAMETER VENA SENTRALIS HEPAR

Laporan penelitian ini ditulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar SARJANA KEDOKTERAN

OLEH:

Putri Nurbaeti 11161030000030

PROGRAM STUDI KEDOKTERAN FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

1441 H/2019 M

ii

iii

iv

v

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil’alamin, segala puji dan syukur saya panjatkan kehadirat Allah SWT, karena berkat rahmat dan karunia-Nya saya dapat menyelesaikan laporan penelitian ini yang berjudul “EFEK PEMBERIAN EKSTRAK BIJI JARAK PAGAR (Jatropha curcas L) TERHADAP STRES OKSIDATIF DAN DIAMETER VENA SENTRALIS HEPAR”, sebagai salah satu syarat untuk mendapatkan gelar Sarjana Kedokteran di Fakultas Kedokteran Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta. Shalawat serta salam tidak lupa saya sampaikan kepada Nabi Muhammad SAW, suri tauladan dengan sebaik- baiknya akhlak. Saya menyadari bahwa keberhasilan dalam penulisan laporan penelitian ini tidak lepas dari bantuan berbagai pihak yang senantiasa selalu memberikan bimbingan, petunjuk, motivasi, serta do’a untuk saya. Oleh karena itu, saya ingin menyampaikan ucapan terimakasih dan penghargaan yang sebesar- besarnya kepada:

1. dr. Hari Hendarto, Ph.D-KEMD, FINASIM selaku Dekan Fakultas Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, dr. Ahmad Zaki, M.Epid, Sp.OT selaku Kepala Program Studi Kedokteran, Fakultas Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

2. Drg. Laifa Annisa Hendarmin, PhD selaku Penanggung Jawab Riset Mahasiswa Program Studi Kedokteran, Fakultas Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Dr. Endah Wulandari, S.Si., M. Biomed dan Rr. Ayu Fitri Hapsari, S.Si., M. Biomed selaku dosen pembimbing penelitian saya yang selalu memberikan bimbingan, arahan, waktu dan tenaga, serta dukungan selama penelitian.

4. Laboran Laboratorium Fakultas Kedokteran dan Fakultas Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta, Mba Dien, Mba Ayi, Mba Sur, Mba Lilis, Mba Novi yang membantu saya dalam persiapan selama penelitian berlangsung.

vi

5. Kedua orang tua tercinta, Nuril Rakhman dan Rohaeti dan adik saya Saiful Ramadhan yang senantiasa selalu memberikan semangat, kasih sayang, dukungan moril dan materil, serta do’a yang tiada henti.

6. Teman seperjuangan penelitian, Faradila Amirabagya yang selalu menemani, memberi semangat dan masukan, serta saling membantu selama penelitian dan penyusunan laporan penelitian ini.

7. Teman-teman terbaik saya, Masnunah, Arini Hikmah, Sarah Hanifah, Hafidzah Qaulan, Rasya Salma, Azza Nur Laila, Rani Rahmawati, Ayu Saputri R dan Ariyona Insyani yang selalu menemani, menyemangati, dan mendoakan.

8. Seluruh teman-teman Pacemaker FK UIN 2016 yang saya sayangi dan selalu berjuang bersama dari awal hingga sekarang.

9. Kak Nabilah Aulia H dari Program Studi Kedokteran tahun 2013 dan Kak Fio Noviany dari Program Studi Farmasi 2011, UIN Syarif Hidayatullah Jakarta yang sudah membantu saya dalam mencari kepustakaan dan mengizinkan saya untuk melanjutkan penelitian yang telah dilakukan.

10. Serta untuk semua pihak yang telah membantu selama penelitian dan penyusunan laporan penelitian ini yang tidak dapat saya sebutkan satu persatu. Terima kasih atas bantuan dan segala do’a yang telah kalian berikan, semoga Allah SWT membalas semua kebaikan kalian.

Saya menyadari bahwa dalam penulisan laporan penelitian ini masih jauh dari sempurna dan tidak luput dari kesalahan. Oleh karena itu, saya mengharapkan kritik dan saran yang membangun dari pembaca. Semoga laporan penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak.

Ciputat, 23 Mei 2019

Putri Nurbaeti

vii

ABSTRAK

Putri Nurbaeti. Program Studi Kedokteran. Efek Pemberian Ekstrak Biji Jarak Pagar (Jatropha curcas L) Terhadap Stres Oksidatif dan Diameter Vena Sentralis Hepar. 2019.

Latar belakang: Tanaman jarak pagar merupakan tanaman yang berasal dari daerah tropis. Tanaman jarak pagar mengandung radikal bebas (MDA/Malondialdehid) yang dapat menyebabkan kerusakan jaringan melalui stres oksidatif. Stres oksidatif dapat dicegah oleh aktivitas antioksidan, seperti GSH (Glutathione). Proses tersebut dapat terjadi di hepar sebagai organ detoksifikasi. Stres oksidatif yang terjadi dapat menyebabkan kerusakan hepatosit yang mengganggu proses detoksifikasi sehingga zat berbahaya terus terbawa aliran hepatik dan bermuara di vena sentralis. Metode: Tikus diberi dosis ekstrak biji jarak pagar (5, 25, 50, 250 mg/kgBB) selama 28 hari. Aktivitas GSH dan kadar MDA diukur dengan spektrofotometer dan dibandingkan dengan kurva standar GSH dan MDA. Vena sentralis hepar diukur diameternya pada setiap kelompok. Hasil: Kadar MDA terendah ada pada kelompok kontrol sebesar 0,818 nmol/ml dan tertinggi pada dosis 50 mg/kgBB yaitu 2,720 nmol/ml. Aktivitas GSH tertinggi ada pada kelompok kontrol yaitu 0,979 µg/ml dan terendah pada dosis 50 mg/kgBB yaitu 0,463 µg/ml. Rata-rata diameter vena sentralis terbesar dimiliki oleh kelompok kontrol yaitu 169 µm dan terkecil pada dosis 25 mg/kgBB yaitu 23,7 µm. Simpulan: Kadar MDA semakin tinggi dengan bertambahnya dosis ekstrak biji jarak pagar secara bermakna. Aktivitas GSH hepar semakin rendah dengan bertambahnya dosis ekstrak biji jarak pagar. Kadar MDA dan aktivitas GSH memiliki korelasi negatif pada pemberian ekstrak biji jarak pagar, secara bermakna menunjukkan bahwa pada dosis rendah stres oksidatif dapat ditekan, namun bila dosis ekstrak biji jarak pagar tinggi maka stres oksidatif tidak dapat ditekan. Pemberian ekstrak biji jarak pagar dengan dosis 25-250 mg/kgBB memiliki diameter vena sentralis lebih kecil, dibandingkan kelompok.

Kata Kunci: Jatropha curcas L, GSH, MDA, hepar.

viii

ABSTRACT

Putri Nurbaeti. Medical Study Program. Effect of Jatropha curcas L Seeds Extract Towards Oxidatve Stress and Diameter of Liver Central Vein. 2019.

Background: Jatropha curcas L is a plant originates from the tropics. The plant contains free radicals (MDA/Malondialdehyde) which is cause tissue damage through oxidative stress. Oxidative stress can be prevented by antioxidant activity, such as GSH (Glutathione). This process can occur in the liver as a detoxification organ. Oxidative stress that occurs can cause damage to hepatocytes that interfere the detoxification process so the harmful substances cotinue to be carried by the hepatic flow and lead to the central vein. Method: Mice were given a dose of Jatropha curcas L seeds extract (5, 25, 50, 250 mg/BW for 28 days. GSH activity and MDA levels were measured by spectrophotometer and compared with standard GSH and MDA curves. The diameter of liver central vein was measured in each group. Result: The lowest MDA levels are in the control group is 0,818 nmol/ml and the highest at dose 50 mg/BW is 2,720 nmol/ml. The highest GSH activity is in the control group is 0,979 µg/ml and the lowest at dose 50 mg/BW is 0,463 µg/ml. The largest avarage diameter of liver central vein is owned by the control group as 169 µm and the smallest at dose 25 mg/BW is 23,7 µm.

Conclusion: MDA levels are higher with increasing doses of Jatropha curcas L seeds extract significantly. GSH activity is lower with increasing doses of Jatropha curcas L seeds extract. MDA levels and GSH activity have a negative correlation, significantly indicating that at low dose oxidative stress can be surpressed, but if the dose of Jatropha curcas L seeds extract is higher then oxidative stress cannot be suppressed. Giving Jatropha curcas L seeds extract at dose 25-250 mg/BW has a smaller diameter of liver central vein than the control group.

Key Words: Jatropha curcas L, GSH, liver.

ix

DAFTAR ISI

LEMBAR JUDUL ... i

LEMBAR PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ... ii

LEMBAR PERSETUJUAN PEMBIMBING ... iii

LEMBAR PENGESAHAN ... iv

KATA PENGANTAR ... v

ABSTRAK ... vii

ABSTRACT ... viii

DAFTAR ISI ... ix

DAFTAR GAMBAR ... xi

DAFTAR TABEL ... xii

DAFTAR LAMPIRAN ... xiii

DAFTAR SINGKATAN ... xiv

BAB 1 PENDAHULUAN 1.1. Latar Belakang Masalah ... 1

1.2. Rumusan Masalah ... 2

1.3. Tujuan Penelitian ... 3

1.3.1. Tujuan Umum ... 3

1.3.2. Tujuan Khusus ... 3

1.4. Hipotesis ... 3

1.5. Manfaat Penelitian ... 3

1.5.1. Bagi Peneliti ... 3

1.5.2. Bagi Institusi Akademis ... 4

1.5.3. Bagi Masyarakat ... 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L) ... 5

2.1.1. Khasiat Jarak Pagar di Bidang Kesehatan ... 8

2.1.2. Efek Antioksidan Tanaman Jarak Pagar ... 8

2.1.3. Toksisitas Tanaman Jarak Pagar ... 9

2.2. Radikal Bebas dan Stres Oksidatif ... 10

2.2.1. Stres Oksidatif Pada Biji Jarak Pagar ... 12

2.2.2. Lipid Peroksidase ... 12

2.3. Malondialdehid (MDA) ... 14

2.4. Antioksidan GSH ... 18

2.5. Fungsi dan Sistem Vaskularisasi Hepar ... 21

2.6. Kerangka Teori... 25

2.7. Kerangka Konsep ... 26

x BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1. Desain Penelitian ... 27

3.2. Waktu dan Tempat Penelitian ... 27

3.3. Populasi dan Sampel Penelitian ... 27

3.4. Cara Kerja Penelitian ... 28

3.4.1. Alat dan Bahan ... 28

3.4.1.1. Alat ... 28

3.4.1.2. Bahan ... 29

3.4.2. Pembuatan Ekstrak Biji Jarak Pagar ... 29

3.4.3. Persiapan dan Pemberian Perlakuan hewan Uji ... 30

3.4.4. Proses Terminasi dan Eksisi Tikus ... 30

3.4.5. Persiapan Jaringan Hepar ... 30

3.4.6. Pengukuran Kadar Malondialdehid (MDA) dan Aktivitas GSH ... 31

3.4.6.1. Pembuatan Homogenat Jaringan ... 31

3.4.6.2. Pengukuran Kadar MDA ... 31

3.4.6.3. Pengukuran Aktivitas GSH ... 32

3.4.7. Pembuatan Preparat Histologi dan Pewarnaan Hematoksilin-Eosin ... 32

3.4.7.1. Dehidrasi ... 32

3.4.7.2. Clearing ... 32

3.4.7.3. Embedding ... 33

3.4.7.4. Pencetakkan ... 33

3.4.7.5. Pemotongan Jaringan ... 34

3.4.7.6. Pewarnaan dengan Hematoksilin-Eosin ... 34

3.4.7.7. Foto dan Pengukuran Diameter Vena Sentralis ... 35

3.4.8. Analisis Data ... 35

3.5. Alur Penelitian ... 36

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Hasil Pengukuran Kadar Malondialdehid (MDA) dan Aktivitas GSH Ekstrak Biji Jarak Pagar ... 37

4.2. Gambaran Diameter Vena Sentralis Hepar ... 42

BAB 5 PENUTUP 5.1. Simpulan ... 46

5.2. Saran ... 46

DAFTAR PUSTAKA ... 47

LAMPIRAN-LAMPIRAN ... 50

xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1 Tanaman Jarak Pagar ... 6

2.2 Akar Jarak Pagar ... 6

2.3 Daun Jarak Pagar ... 6

2.4 Bunga Jarak Pagar ... 7

2.5 Buah Jarak Pagar ... 7

2.6 Biji Jarak Pagar ... 7

2.7 Mekanisme Peroksidasi Lipid ... 14

2.8 Proses Pembentukan MDA ... 16

2.9 Proses Pembentukan GSH ... 19

2.10 Mekanisme Transfer GSH ... 19

2.11 Sintesis GSH di Hepar ... 20

2.12 Fungsi GSH Sebagai Antioksidan ... 21

2.13 Struktur Histologi Hepar ... 24

4.1 Hasil Pengukuran Kadar MDA dan Aktivitas GSH ... 37

4.2 Vena Sentralis Pada Perbesaran 20x ... 42

xii

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

4.1. Rata-rata Diameter Vena Sentralis ... 43

xiii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Hasil Determinasi ... 50

2. Hasil Uji Etik Hewan Percobaan ... 51

3. Alur Pembuatan Ekstrak Biji Jarak Pagar (Jatropha curcas L) ... 52

4. Perhitungan Volume Administrasi (VAO) ... 53

5. Alur Pengukuran Kadar MDA ... 55

6. Alur Pengukuran Aktivitas GSH ... 56

7. Alur Pembuatan Preparat ... 57

8. Kurva Standar Kadar MDA dan Aktivitas GSH ... 58

9. Analisis Statistik Kadar MDA Ekstrak Biji Jarak Pagar (Jatropha curcas L) . 59 10. Analisis Statistik Aktivitas GSH Ekstrak Biji Jarak Pagar (Jatropha curcas L)61 11. Analisis Statistik Korelasi Kadar MDA dan Aktivitas GSH Ekstrak Biji Jarak Pagar (Jatropha curcas L) ... 63

12. Analisis Statistik Diameter Vena Sentralis Hepar ... 64

13. Gambar Alat dan Bahan Penelitian ... 66

14. Riwayat Penulis ... 68

xiv

DAFTAR SINGKATAN

ANOVA Analysis of Variance ALA α-Lipoic Acid CAT Catalase DAG Diacylglycerol DAS Days After Sowing DHLA Dihydrolipoic Acid DNA Deoxyribonucleic Acid DTNB Dithio bisnitro benzoat GCL Glutamate cystein-ligase GPx Glutathione Peroxidase GRed Glutathione Reduktase GSH Glutathione

GSS Glutathione Syntethase GSSG Glutathione Disulfide GST Glutathione S-Transferase HHT 12-Hydroxyheptadeca-Trienoate HNE 4-Hydroxynonenal

H2O Hidrogen Monoksida H2O2 Hidrogen Peroksida

iNOS inducible Nitric Oxide Synthase MDA Malondialdehid

MG Methylglyoxal

NaCMC Natrium Carboxyl Methyl Cellulose

NADPH Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phospat

xv

NO Nitrit Oksida

O2 Oksigen

PBS Phosphate Buffer Saline PGH2 Prostaglandin Endoperoxide PUFA Polyunsaturated Fatty Acid RNS Reactive Nitrogen Species ROO Lipid Peroksida

ROS Reactive Oxygen Species ROOH Lipid Hidroperoksida SAMe S-Adenosylmethionine SOD Superoxide Dismutase TBA Thiobarbituric Acid TCA Trichloroacetic Acid

TO Vitamin E

1 BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Masalah

Tanaman jarak pagar adalah tanaman yang berasal dari daerah tropis sehingga pertumbuhannya di Indonesia cukup baik. Tanaman jarak pagar memiliki nama ilmiah yaitu Jatropha curcas L, yang terdiri dari genus Jatropha dan famili Euphorbiaceae. Berdasarkan informasi yang diperoleh, seluruh bagian tanaman jarak pagar memiliki berbagai manfaat di bidang kesehatan (medis), salah satunya yaitu biji jarak pagar. Biji jarak pagar kaya akan berbagai makronutrien dan zat aktif, seperti curcin, flavonoid, alkaloid, viteksin, isoviteksin, lectin, phorbol ester, dan lain-lain. Tanaman jarak pagar memiliki efek antiinflamasi, wound healing, antimikroba, dan antiparasit. Pada penelitian yang dilakukan Indah F Maula tahun 2014 menyatakan bahwa tanaman biji jarak pagar juga bermanfaat sebagai antifertilisasi^1,2,3,4, namun hal ini masih memerlukan penelitian lebih lanjut.

Pada penelitian yang dilakukan oleh Fio Noviany (2015) didapatkan informasi bahwa pemberian ekstrak biji jarak pagar menyebabkan kerusakan pada alat reproduksi tikus jantan spesies Sparague Dawley. Kemudian dilakukan penelitian lebih lanjut oleh Nabilah Aulia (2016) ternyata pemberian ekstrak biji jarak pagar mampu memberikan efek wound healing. Adanya efek terhadap kerusakan jaringan dan efek proteksi tersbut, peneliti dalam penelitian ini hendak mengukur kadar radikal bebas dan aktivitas antioksidan pada ekstrak biji jarak pagar.

Biji jarak pagar yang juga mengandung senyawa toksik yang berbahaya bagi tubuh. Senyawa toksik tersebut akan bereaksi dengan berbagai senyawa dan membentuk senyawa kimia yang mengandung elektron tanpa pasangan pada orbit luar yang disebut radikal bebas. Radikal bebas dapat menyebabkan kerusakan sel pada jaringan, terutama yang tersusun oleh lipid ikatan rangkap yaitu

2 Malondialdehid (MDA). Peningkatan kadar MDA merupakan indikator terjadinya peroksidasi lipid oleh radikal bebas ^5,6

Hati adalah salah satu organ yang mudah diserang oleh akumulasi radikal bebas. Pada umumnya, sel parenkim hepar memiliki peranan penting dalam meregulasi radikal bebas dan penanganan stres oksidatif melalui berbagai mekanisme pembentukan antioksidan. Glutathione S-Transferase (GSH), antioksidan endogen yang berperan untuk detoksifikasi yang meregulasi senyawa toksik dan kondisi stres oksidatif di hepar. Apabila produksi radikal bebas meningkat atau sistem pemusnahan tidak efektif, maka akan terjadi penumpukan radikal bebas sehingga terjadi keadaan stres oksidatif. Peningkatan kadar MDA yang tidak diimbangi dengan jumlah antioksidan GSH yang terbentuk akan menyebabkan kerusakan hepatosit. Hepatosit merupakan bagian yang memegang peranan penting karena tersusun dari banyak retikulum endoplasma (RE) kasar dan halus. RE kasar berperan dalam sintesis protein sedangkan RE halus berperan dalam proses oksidasi, metilasi, dan konjugasi untuk inaktivasi atau detoksifikasi berbagai zat sebelum diekskresikan. Oleh karena itu, kerusakan pada hepatosit akan menyebabkan proses detoksifikasi tidak berjalan baik yang menyebabkan zat-zat berbahaya terus terbawa aliran darah dalam sistem hepar hingga bermuara di vena sentralis^7,8,9 sehingga pada penelitian ini akan diukur diameter vena sentralis hepar.

Dengan demikian, berdasarkan latar belakang di atas, penelitian ini dilakukan untuk mengetahui efek pemeberian ekstrak biji jarak pagar (Jatropha curcas L) terhadap stres oksidatif dan gambaran diameter vena sentralis hepar.

1.2. Rumusan Masalah

Bagaimana efek pemberian ekstrak biji jarak pagar (Jatropha curcas L) terhadap stres oksidatif dan diameter vena sentralis hepar ?.

3 1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1. Tujuan Umum

Untuk mengetahui efek pemberian ekstrak biji jarak pagar (Jatropha curcas L) terhadap stres oksidatif dan diameter vena sentralis hepar.

1.3.2. Tujuan Khusus

a. Untuk mengetahui efek dari pemberian ekstrak biji jarak pagar (Jatropha curcas L) terhadap kadar Malondialdehid (MDA).

b. Untuk mengetahui efek dari pemberian ekstrak biji jarak pagar (Jatropha curcas L) terhadap aktivitas Glutathione S-Transferase (GSH).

c. Untuk mengetahui efek pemberian ekstrak biji jarak pagar terhadap gambaran histologi jaringan hepar dengan melihat diameter vena sentralis.

1.4. Hipotesis

a. Pemberian ekstrak biji jarak pagar (Jatropha curcas L) berefek terhadap peningkatan kadar MDA.

b. Pemberian ekstrak biji jarak pagar (Jatropha curcas L) berefek terhadap penurunan aktivitas GSH.

c. Pemberian ekstrak biji jarak pagar berefek terhadap diameter vena sentralis hepar.

1.5. Manfaat Penelitian

1.5.1. Bagi Peneliti

a. Menambah ilmu pengetahuan dan kemampuan dalam penelitian.

b. Memahami efek pemberian ekstrak biji jarak pagar (Jatropha curcas L) terhadap kadar MDA dan aktivitas GSH dan diameter vena sentralis hepar.

4 c. Mempeoleh gelar sarjana kedokteran di Fakultas Kedokteran Universitas

Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

1.5.2. Bagi Institusi Akademis

Menambah referensi penelitian mahasiswa Fakultas Kedokteran Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta dan dapat menjadi data untuk penelitian lebih lanjut.

1.5.3. Bagi Masyarakat

Sebagai informasi mengenai efek pemberian ekstrak biji jarak pagar (Jatropha curcas L) dalam bidang kesehatan.

5 BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L)

Tanaman Jarak Pagar (Jatropha curcas L) adalah tanaman yang berasal dari Amerika Tengah dan Meksiko yang kemudian tersebar ke Asia dan Afrika.

Kini tanaman tersebut hampir dapat ditemukan di semua negara tropis dan subtropis, serta memiliki nama yang bervariasi pada setiap negara. Tanaman jarak pagar adalah tanaman kecil yang memiliki batang kulit halus berwarna abu-abu yang ketika dipotong akan memperlihatkan warna seperti latex. Tanaman jarak pagar biasanya tumbuh mencapai 3-5 meter, tetapi dengan kondisi lingkungan yang sesuai tanaman jarak pagar bisa tumbuh mencapai 8 meter. Tanaman tersebut memiliki sekitar 170 spesies. Nama genus Jatropha berasal dari bahasa Yunani Jatros yang berarti dokter, dan trophe yang berarti digunakan untuk pengobatan.^5,10

Berikut adalah taksonomi dari tanaman jarak pagar (Jatropha curcas):

 Kingdom : Plantae

 Subkingdom : Tracheobionta

 Divisi : Magnoliophyta

 Kelas : Magnoliopsida

 Subkelas : Rosidae

 Orde : Euphorbiales

 Famili : Euphorbiaceae

 Genus : Jatropha

 Species : Jatropha curcas

Taman jarak pagar merupakan tanaman yang berkerabat dekat dengan tanaman castor oil (Ricinus communis), singkong (Manihot esculenta), dan pohon para rubber (Hevea brasiliensis).¹⁰

6 Tanaman jarak pagar memiliki akar yang pendek dan bercabang. Bibit tanaman jarak pagar dapat ditemukan 5 percabangan akar. Tanaman jarak pagar memiliki bentuk batang yang bervariasi untuk setiap spesiesnya dengan ukuran tangkai bisa mencapai 10-15 cm. Pada tangkai tersebut melekat daun tanaman jarak pagar yang berwarna hijau, permukaan lebar dan panjang yang dapat mencapai sekitar 7-16 cm, memiliki bulu halus di bawah pembuluh darah daun.

Daun tersebut biasanya gugur di musim panas dan dapat terlihat kembali di awal musim hujan.¹⁰

Gambar 2.2 Akar Jarak Pagar ¹⁰ Gambar 2.3 Daun Jarak Pagar¹⁰

Bunga tanaman jarak pagar berjenis monoecius dengan warna kuning kehijauan yang biasanya muncul di musim dingin. Dalam kondisi yang memadai,

Gambar 2.1 Tanaman Jarak Pagar⁵

7 periode pertumbuhan berlangsung 3-5 hari pada bunga betina dan 12-14 hari pada bunga jantan. Selain berbunga, tanaman jarak pagar juga menghasilkan buah yang berkembang selama 60-120 hari. Buah yang sudah dewasa akan menunjukkan warna kehitaman.¹⁰

Benih/biji jarak pagar memiliki ukuran yang cukup besar yaitu sekitar 1,5- 2,0 cm dengan diameter 1,0-1,3 cm dan bertekstur kering. Menurut literatur, biji jarak pagar mengandung beberapa komponen zat dengan konsentrasi yang berbeda, diantaranya 7,2% air, 37,5% minyak, 55,3% gula, pati, albuminoid dan lain-lain. Perkecambahan benih biasanya berlangsung selama 15 hari.¹⁰

Gambar 2.6 Biji Jarak Pagar ⁵

Gambar 2.4 Bunga Jarak Pagar¹⁰ Gambar 2.5 Buah Jarak Pagar¹⁰

8 2.1.1. Khasiat Jarak Pagar di Bidang Kesehatan

Setiap bagian pada tanaman jarak pagar mengandung berbagai manfaat bagi kesehatan. Daun tanaman jarak pagar dapat berfungsi sebagai antiparasit.

Getah daunnya dapat digunakan untuk luka akibat sengatan lebah atau tawon.

Selain itu juga, getah tersebut dapat digunakan untuk menghentikan perdarahan.

Kandungan apigenin, vitexin, dan ansovitexin dalam daun biji jarak pagar bermanfaat untuk menghilangkan nyeri otot. Minyak biji jarak pagar jika dikombinasikan dengan benzyl benzoate dapat mengobati scabies dan dermatitis.

Batang daun muda tanaman jarak pagar dapat bermanfaat untuk mengobati infeksi urinaria. Akarnya dapat digunakan sebagai antiracun akibat gigitan ular.¹

Ekstrak metanol daun jarak pagar memiliki aktivitas antimetastasis dan antiproliferatif melawan keganasan. Latex tanaman jarak pagar memiliki aktivitas koagulan dan antikoagulan. Tanaman jarak pagar juga berperan dalam proses peyembuhan luka dengan meningkatkan skin breaking strength, kontraksi daerah luka, dan lain-lain. Bagian terakhir yaitu akarnya memiliki aktivitas sebagai antidiare karena fraksi metanol yang terkandung di dalamnya.⁵

2.1.2. Efek Antioksidan Tanaman Jarak Pagar

Tanaman jarak pagar memiliki aktivitas antioksidan yang terkandung dalam biji, daun, dan bagian lainnya. Biji tanaman jarak pagar mengandung enzim utama yang dapat menguraikan radikal bebas, seperti superoksida dismutase (SOD), askorbat peroksidase (APx), katalase (CAT), peroxide glutathione (GPx), dan peroxiredoxin (PrxR).¹¹

Berdasarkan penelitian yang dilakukan Silva (2018), diketahui bahwa kadar SOD meningkat pada 9 bulan penyimpanan biji yang diekstrak dari buah jarak pagar berwarna coklat, kadarnya menurun sampai 15 bulan penyimpanan dan selanjutnya terus mengalami peningkatan selama proses penyimpanan.

Aktivitas SOD yang tinggi akan meningkatkan H₂O₂ dan memicu peningkatan aktivitas enzim antioksidan lainnya untuk menguraikan ROS. Enzim APx mengalami peningkatan terutama pada biji yang diekstrak dari buah jarak pagar

9 berwarna coklat dan kuning kecokelatan selama 3 bulan dan setelah 9 bulan penyimpanan, selanjutnya mengalami penurunan sepanjang periode penyimpanan.

Kadar enzim GPx mengalami peningkatan pada 4 DAS (Days After Sowing)/setelah penanaman benih meskipun dengan kondisi salinitas tinggi yang berperan penting untuk menjaga selama proses perkembangan dan perkecambahan tanaman.^11,12

Perubahan kadar enzim selama periode maturasi mempengaruhi aktivitas antioksidan di dalamnya. Kondisi ini menyebabkan penurunan kualitas biji jarak pagar lebih dipengaruhi oleh perubahan aktivitas enzim antioksidan selama penyimpanan daripada pembentukan ROS yang terjadi. Peningkatan aktivitas enzim antioksidan dapat dipicu oleh peningkatan produksi ROS atau sebagai mekanisme perlindungan adaptif oleh spesies terhadap stres oksidatif.¹¹

Selain ekstrak biji jarak pagar, bagian daunnya pun memiliki aktivitas antioksidan. Jumlah karotenoid, anthocyanin, glutathione, dan kandungan asam askorbat yang tinggi berperan sebagai sistem pertahanan dalam proses aklimatisasi untuk mengendalikan homeostasis ROS. Senyawa fenolik merupakan senyawa yang bertindak sebagai antioksidan primer atau terminator radikal bebas pada ekstrak daun jarak pagar.¹³

2.1.3. Toksisitas Tanaman Jarak Pagar

Meskipun tanaman jarak pagar memiliki banyak manfaat, tetapi tanaman ini pun dapat berefek toksik bagi tubuh. Gejala keracunan tanaman jarak pagar biasanya melambat sekitar satu jam atau lebih mulai dari konsumsi sampai muncul awitan pertama. Beberapa gejala yang muncul, seperti nyeri akut abdomen dengan sensasi terbakar di tenggorokan selama satu setengah jam, nausea, muntah, dan diare. Gejala yang lebih parah yaitu gastroenteritis hemoragi dan dehidrasi akibat banyak pengeluaran cairan. Efek jangka panjang dapat menyebabkan gangguan sistem saraf pusat dan depresi kardiovaskular. Beberapa efek samping tanaman jarak pagar terhadap sistem organ dalam tubuh, diantaranya: ⁵

 Kardiovaskular : Hipotensi dan syok kardiogenik.

10

 Respirasi : Hyperpnea.

 Neurologi : Kejang akibat toksoalbumin pada tanaman jarak pagar, peningkatan produksi liur, berkeringat, dan gejala lain yang mirip akibat efek penggunaan atropin.

 Muskuloskeletal : Spasme otot.

 Gastrointestinal : Nyeri abdomen dengan sensasi terbakar di tenggorokan, nausea, muntah, dan diare.

 Liver : Peningkatan ALT, bilirubin total, dan AST.

 Urinaria : Peningkatan produksi urin.

 Kulit : Dermatitis akibat iritasi.

 Reaksi hipersensitivitas, iritasi mata, dan hemaglutinasi.⁵

2.2. Radikal Bebas dan Stres Oksidatif

Radikal bebas merupakan suatu komponen kimia yang memiliki elektron yang tidak berpasangan pada orbit luar. Adanya elektron yang tidak berpasangan membuat radikal bebas menjadi sangat tidak stabil dan reaktif sehingga ia mampu bergabung dengan zat kimia apapun baik organik ataupun anorganik agar dapat berpasangan. Zat yang terbentuk dari reaksi antara radikal bebas dengan komponen kimiawi lainnya akan membentuk suatu senyawa radikal bebas baru yang memicu kerusakan sel, seperti kerusakan asam nukleat, berbagai protein sel, dan lipid.⁶

Dalam sistem biologi, terdapat dua jenis radikal bebas, yaitu Reactive Oxygen Species (ROS) dan Reactive Nitrogen Species (RNS). ROS dapat dibentuk melalui beberapa proses diantaranya yaitu:

 ROS dibentuk selama proses metabolisme dan reaksi redoks

ROS dibentuk selama proses respirasi dan penghasilan energi di mitokondria. Terbentuknya molekul air di akhir proses katabolisme melalui penambahan empat elektron menyebabkan ada satu molekul oksigen yang tidak berpasangan sehingga terbentuklah radikal bebas dalam jumlah sedikit, seperti superoksida (O2*

) dan hidrogen peroksida (H2O2*

).

 ROS dibentuk oleh leukosit fagositik, terutama neutrofil dan makrofag

11 ROS dihasilkan di fagosom dan fagolisosom, membran fagosom akan mengkatalisasi pembentukan superoksida dan diubah menjadi H2O2 yang selanjutnya diubah menjadi hipoklorit reaktif.

RNS berasal dari superoksida dan nitrit oksida (NO) melalui rekasi oksidasi inducible Nitric Oxide Synthase (iNOS) dan Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate (NADPH).^6,7

Tubuh memiliki sistem untuk menyeimbangkan konsentrasi radikal bebas agar tetap dapat dimanfaatkan oleh tubuh, seperti memperkuat mekanisme pertahanan selama latihan fisik dan menginduksi apoptosis. Akan tetapi, ketika terjadi ketidakseimbangan antar produksi dan pembuangan radikal bebas oleh tubuh maka akan timbul akumulasi radikal bebas yang dapat memicu suatu kondisi yang disebut stres oksidatif. Kondisi tersebut dapat memicu kerusakan sel, seperti kerusakan asam nukleat, protein sel, dan lipid. Beberapa faktor yang memicu peningkatan produksi radikal bebas, yaitu absorpsi energi radiasi (sinar UV, sinar X), metabolisme enzim zat kimia eksogen^, dan peradangan.^6,7

Spesies oksigen reaktif menyebabkan jejas sel melalui beberapa reaksi, yaitu:

 Proksidasi lipid

Ikatan rangkap pada membran lemak poliunsaturated bereaksi dengan radikal bebas menghasilkan peroksidase yang dapat memicu reaksi autokatalitik.

 Reaksi silang dan perubahan lain pada protein

Radikal bebas mengakibatkan reaksi silang dengan protein yang menyebabkan peningkatan degradasi enzim dan fragmentasi polipeptida.

 Kerusakan DNA

Interaksi radikal bebas dengan thymin pada DNA inti dan mitokondria menyebabkan kerusakan pita DNA yang memicu kerusakan sel, penuaan, dan transformasi keganasan sel.⁶

12 2.2.1. Stres Oksidatif Pada Biji Jarak Pagar

Kekeringan dan salinitas adalah dua kondisi yang mempengaruhi aktivitas ROS dan antioksidan pada tanaman jarak pagar. Kadar garam yang tinggi dapat memicu berbagai peristiwa yang dapat menghambat aktivitas enzim metabolisme, penurunan efisiensi pemakaian karbon dan dekomposisi protein membran. Kadar ROS mengalami peningkatan melebihi sistem antioksidan pada salinitas yang tinggi.¹⁴

Peroksidasi lipid adalah salah satu akibat yang disebabkan oleh ROS. Biji jarak pagar mengandung senyawa Malondialdehid (MDA). Malondialdehid tersebut dianggap sebagai biomarker kerusakan oksidatif dan metode penentuan peroksidasi lipid. Berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Silva (2018), kadar MDA mengalami penurunan selama 9 bulan penyimpanan, lalu meningkat setelah 12 bulan penyimpanan biji jarak pagar, dan selanjutnya mengalami penurunan sepanjang periode penyimpanan.¹¹

Pada keadaan tersebut, terjadi penurunan aktivitas enzim katalase dan askorbat peroksidase diikuti dengan peningkatan kadar MDA. Akumulasi MDA akan memberikan umpan balik negatif dengan menghambat aktivitas enzim tersebut. Kondisi tersebut dapat memicu stres oksidatif sehingga terjadi kerusakan protein sitotoksik, kerusakan DNA, dan peroksidasi lipid. Pada penelitian lainnya juga dikatakan bahwa kadar antioksidan yang terbentuk pada kondisi salinitas yang tinggi tidak efisien dalam mencegah efek negatif dari stres oksidatif.¹¹

2.2.2. Lipid Peroksidase

Lipid secara umum terbagi menjadi dua kelompok, yaitu apolar dan polar.

Lipid apolar atau yang biasa dikenal dengan trigliserida, disimpan di berbagai sel, terutama di jaringan adiposa sebagai salah satu sumber energi mamalia. Lipid polar adalah kelompok lipid yang menjadi komponen penyusun membran sel yang berperan sebagai barrier permeabilitas membran sel. Lipid juga memiliki peran penting dalam tranduksi sinyal salah satunya yaitu diacylglycerol (DAG) yang

13 berperan sebagai aktivator protein kinase C dan faktor transkripsi NF-kB yang berfungsi dalam pertahanan dan proliferasi sel.^15,16

Pada kondisi stres oksidatif terjadi ketidakseimbangan antara radikal bebas dan antioksidan, maka akan terjadi kerusakan struktur lipid. Peroksidasi lipid merupakan mekanisme utama yang menyebabkan kerusakan oksidatif terhadap sel dan kematian sel. Peroksidasi lipid diinisiasi oleh abstraksi hidrogen atau penambahan radikal oksigen yang kemudian menyebabkan kerusakan oksidatif pada polyunsaturated fatty acid (PUFA).^15,16

Secara umum proses peroksidasi lipid terdiri dari tiga tahap, yaitu inisiasi, propagasi, dan terminasi. Pada proses inisiasi, asam lemak tak jenuh (PUFA) mudah diserang radikal karena memiliki sistem 1,4 pentadien sehingga memungkinkan pengambilan atom hidrogen dari salah satu gugus metilen untuk membentuk radikal karbon.

RH + OH* → R* + H2O -R₂C = CR₂ → -R2*C-CR₂-

Adanya ikatan karbon akan melemahkan ikatan hidrogen sehingga atom hidrogen terlepas. Pada tahap propagasi kehilangan atom hidrogen akan menyebabkan penyusunan ulang ikatan untuk menstabilkan senyawa dengan membentuk konjugasi diena. Akan tetapi, hasil konjugasi ini akan mudah diserang oleh oksigen radikal peroksil. Lipid radikal yang terbentuk akan dengan cepat bereaksi dengan oksigen membentuk lipid peroxyl radical (ROO^*). ^15,16

R* + O2 → ROO*

ROO* + RH → ROOH + R*

Radikal peroksil akan menyerang asam lemak lainnya dan menghasilkan radikal hidroperoksida dan radikal asam lemak baru melalui reaksi berantai sehingga radikal bebas akan terus dihasilkan. Pada tahap terminasi senyawa radikal dapat bergabung dengan senyawa lain menjadi molekul yang tidak reaktif atau bereaksi dengan senyawa antioksidan seperti vitamin E. Vitamin E akan

14 mendonorkan atom hidrogennya kepada ROO^* dan membentuk vitamin E radikal yang akan bereaksi dengan ROO^* lainnya membentuk produk nonradikal.

Pemecahan ikatan karbon selama peroksidasi lipid akan membentuk produk sampingan berupa malondialdehid.^15,16

Gambar 2.7 Mekanisme Peroksidasi Lipid ¹⁶

2.3. Malondialdehid (MDA)

Malondialdehid (MDA) adalah produk enzimatik genotoksik endogen dan spesies reaktif oksigen yang diinduksi oleh lipid peroksidasi. Peroksidasi lipid adalah suatu reaksi berantai selama proses reaksi oksidatif ketika radikal hidroksil bereaksi dengan asam lemak tak jenuh dari membran sel sehingga terbentuklah berbagai senyawa aktif, seperti propanedial, 4-hydroxynonenal (HNE), radikal lipid peroksida (ROO*), lipid hidroperoksida (ROOH), dan produk fragmentasi seperti MDA. Senyawa aldehid tersebut sangat beracun dan berpotensi mutagenik, aterogenik, dan tumorogenik jika konsentrasinya meningkat. Berdasarkan

15 penelitian, rata-rata konsentrasi normal MDA pada darah manusia sekitar 1,076 nmol/ml.^17,18

MDA dapat terbentuk melalui proses enzimatik secara in vivo sebagai produk sampingan dalam sintesis tromboxan A2 yang merupakan metabolit aktif dari asam arakidonat. Asam lemak tak jenuh yang menginduksi terbentuknya MDA, diantaranya asam arakidonat dan polyun. Asam arakidonat adalah asam lemak omega-6 tak jenuh ganda yang ada di membran sel otak, otot, dan hati yang berperan sebagai sumber atom hidrogen untuk radikal bebas. Konversi asam arakidonat menjadi MDA dikatalis oleh mikrosom platelet pada manusia, tetapi dapat dihambat oleh vinblastine dan aspirin/indometasin. Selain diinduksi oleh asam lemak tak jenuh, MDA juga dihasilkan selama pemecahan prostaglandin en- doperoxide (PGH2) menjadi 12-hydroxyheptadeca-trienoate (HHT).

Phosphoglucose isomerase akan memetabolisme sitoplasma MDA menjadi methylglyoxal (MG) dan D-lactate oleh enzim dalam sistem glyoxalase dengan menggunakan GSH sebagai kofaktor. Selanjutnya MDA akan diekskresikan melalui urin dalam berbagai bentuk, seperti N-epsilon-(2-propenal)lysine atau N- 2-propenal serine.^15,17

16 Oksigen radikal terbentuk dari reduksi molekul oksigen yang dimediasi oleh NADPH oksidase dan xantin oksidase atau melalui reaksi nonenzimatik dari rantai transfer elekstron di mitokondria. Oksigen radikal diubah oleh enzim superoksida dismutase menjadi hidrogen peroksida (H2O2). Selanjutnya hidrogen peroksida diubah oleh enzim glutathione peroxide (GPx) dengan bantuan enzim GSH sebagai pendonor elektron menjadi H2O dan O2.^19,20

Glutathione yang teroksidasi (GSSG) direduksi menjadi GSH menggunakan enzim glutathione reduktase (Gred) dengan bantuan NADPH sebagai pendonor elektron. Beberapa logam transisi mampu memecah hidrogen peroksida menjadi gugus hidroksil yang bersifat radikal (OH^*). Radikal hidroksil

Gambar 2.8 Proses Pembentukan MDA²⁰

17 reaktif akan memisahkan elektron pada PUFA menjadi radikal lipid (L^*).

Kemudian radikal lipid akan berinteraksi dengan molekul oksigen sehingga terbentuk radikal peroksida lipid (LOO^*). Radikal peroksida lipid ini akan menjadi target antioksidan untuk direduksi untuk mencegah peroksidasi lipid.

Radikal peroksidasi lipid akan tereduksi dalam membran oleh reduktor yang dibentuk vitamin E (T-OH) sehingga terbentuk hidroperoksida lipid dan radikal vitamin E (TO^*). Selanjutnya vitamin E radikal direduksi kembali menjadi vitamin E oleh asam askorbat dan menghasilkan produk sampingan berupa radikal askorbil (Asc) atau vitamin E radikal yang dapat direduksi oleh GSH.^19,20

Glutathione teroksidasi (GSSG) dan radikal askorbil (Asc) akan direduksi menjadi GSH dan askorbat monoanion, AscH. Asam dihidrolipoat (DHLA) akan mengonversi dirinya menjadi asam α lipoat (ALA). DHLA diregenerasi dari ALA dengan bantuan NADPH. Lipid hidroperoksida direduksi menjadi alkohol dan mengalami deoksigenasi oleh enzim GPx dengan GSH sebagai pendonor elektron.

Lipid hidroperoksida dapat bereaksi cepat dengan Fe²⁺ membentuk radikal alkoksi lipid (LO^*) atau bereaksi lambat dengan Fe membentuk radikal peroksida lipid (LOO^*). Derivat radikal alkoksi lipid (LO^*) akan mengalami siklisasi membentuk enam cincin hidroperoksida. Kemudian cincin tersebut akan membentuk 4- hidroksil nonenal. Senyawa tersebut akan direduksi menjadi glutathiyl yang tidak membahayakan.^19,20

Radikal peroxyl yang terletak di dalam asam lemak akan mengalami siklisasi untuk membentuk siklik peroksida dan bersama inti karbon akan menjadi senyawa yang bersifat radikal. Radikal tersebut mampu direduksi menjadi bentuk hidroperoksida atau mengalami siklisasi membentuk peroksida bisiklik yang merupakan produk antara dari MDA. MDA bereaksi dengan sitosin membentuk M1C, bereaksi dengan adenin membentuk M1A dan dengan guanin membentuk M1G.^19,20

Selain itu penelitian juga menunjukkan bahwa MDA menginduksi peningkatan frekuensi mutasi 15 kali lipat dalam gen reporter supF jika dibandingkan dengan untrated DNA. Mutasi yang terjadi dapat berupa insersi, delesi, dan substitusi. Mutasi yang terjadi diakibatkan adanya reaksi silang pada

18 urutan pasang basa 5’-d (CG) DNA. Mutasi yang diinduksi oleh MDA tersebut akan menimbulkan stres oksidatif.²¹

Akumulasi MDA dapat menimbulkan stres oksidatif sehingga MDA sering digunakan sebagai biomarker munculnya stres oksidatif. Metode yang sangat berguna untuk mendeteksi adanya stres oksidatif tersebut melalui determinasi MDA di plasma darah dan jaringan homogenat. Beberapa penelitian yang dilakukan pada hewan uji coba telah menunjukkan keberhasilan MDA sebagai biomarker kondisi stres oksidatif. Salah satunya yaitu pengukuran kadar MDA pada plasma kambing melalui proses kondensasi dengan asam tiobarbiturat sebagai biomarker stres oksidatif. Berdasarkan penelitian lebih lanjut pada manusia, diketahui bahwa MDA dapat membentuk schiff base dengan residu protein lisin dan reaksi silang protein in vitro yang diamati melalui GC/MS assay.^17,22

2.4. Antioksidan GSH

GSH adalah nonprotein thiol terbanyak dalam sel yang terakumulasi di hepar. GSH terdiri dari glutamat, sistein, dan glisin. Bentuk oksidasi GSH adalah Glutathine disulfide (GSSG). Kadar GSH dan GSSG sangat berpengaruh dalam menjaga homeostasis redoks dalam sel. Jumlahnya yang banyak membuat GSH menjadi protektor sel terhadap toksisitas dari paparan radikal bebas endogen ataupun eksogen. GSH berperan sebagai kofaktor untuk enzim glutathione peroxidase (GPx) dalam memetabolisme H2O2 dan lipid peroksida. Melalui proses enzimatik dari enzim famili GST, GSH dapat berkonjugasi dengan komponen radikal bebas endogen dan xenobiotik sehingga melindungi dari kerusakan sel dalam tubuh. Selain itu, GSH juga mampu meregenerasi antioksidan lainnya, seperti vitamin C dan E kembali menjadi bentuk aktifnya. Selain berfungsi sebagai antioksidan, GSH juga berperan dalam metabolisme nukleotida, pembentukan lipid second messengers, regulasi homeostasis nitrit oksida, dan memodulasi fungsi protein melalui modifikasi reduksi-oksidasi.²³

19 GSH disintesis melalui dua reaksi enzimatik. Reaksi pertama dikatalis oleh glutamate cysteine ligase (GCL), yang terdiri dari subunit katalitik dan modifikator (GCLC dan GCLM) dengan mengkonjugasikan sistein dan glutamat membentuk γ-glutamylcysteine (γ-GC). Reaksi yang kedua menggabungkan glycine ke γ-GC yang dikatalis oleh GSH sintase (GSS/GS) membentuk γ- glutamilsisteinglisin. Kedua enzim membutuhkan satu molekul ATP pada setiap siklus katalis. GSH yang terbentuk akan memberikan umpan balik negatif terhadap GCL.^23,24

Selanjutnya GSH diangkut keluar sel dengan ecto-enzyme γ- glutamylpeptidase (GGT) mentransfer gugus γ-glutamyl dari GSH ke asam amino (akseptor cystine) untuk membentuk asam γ-glutamyl amino acid dan

Gambar 2.9 Proses Pembentukan GSH²⁴

Gambar 2.10 Mekanisme Transfer GSH²⁴

20 cysteinylglycine. γ-glutamyl amino acid kemudian diangkut kembali ke dalam sel untuk dimetabolisme lebih lanjut untuk melepaskan asam amino dan 5-oxyproline yang dapat dikonversi menjadi glutamat dan dimasukkan kembali ka dalam GSH.

Cysteinylglycine dipecah oleh dipeptidase untuk menghasilkan sistein dan glisin yang juga diangkut kembali ke sel untuk dimasukkan ke dalam GSH. Sebagian besar sistein akan berinkorporasi dengan GSH, sedangkan sisanya dipecah menjadi sulfat atau taurin.²⁴

Hati memiliki aktivitas transsulfurasi yang memungkinkan metionin dan SAMe (S-adenosylmethionine) digunakan sebagai prekursor pembentukan GSH melalui perubahan homosistein menjadi sistationin oleh cystathionine B-synthase.

Sistationin akan diubah menjadi cysteine oleh vitamin B6-dependent enzyme cystathionase. Selanjutnya Sistein yang terbentuk akan diubah menjadi γ-GC dengan bantuan enzim GCL. γ-GC akan dikatalis oleh GS memebntuk GSH.²⁴

Gambar 2.11 Sintesis GSH di Hepar²⁴

21 GSH berperan penting sebagai antioksidan dalam kondisi stres oksidatif.

Proses metabolisme aerob akan menghasilkan hidrogen peroksida (H₂O₂) yang dapat dimetabolisme oleh GSH peroksidase (GPx) di sitosol dan mitokondria, dan dengan katalase di peroksisom. GSSG dapat diubah menjadi GSH oleh GSSG reduktase (GR) dengan melepaskan NADPH sehingga terbentuklah siklus redoks.

Selama kondisi stres oksidatif, residu protein sistein dapat dioksidasi menjadi asam sulfenat (Prot-SOH) dan bereaksi dengan GSH membentuk Prot-SSG (Glutathionylatione) yang dapat direduksi kembali menjadi Prot-SH melalui glutaredoxin (Grx) atau sulfiredoxin (Srx). Proses ini merupakan salah satu mekanisme untuk melindungi protein thiols dari oksidasi yang bersifat ireversibel dan mencegah hilangnya GSH pada kondisi oksidatif. Kemampuan sel untuk mereduksi GSSG menjadi GSH dapat mengatasi kerusakan sel akibat stres oksidatif yang mengarah pada akumulasi GSSG. Untuk mencegah pergeseran keseimbangan redoks, GSSG dapat ditransfor secara aktif keluar sel atau bereaksi dengan protein sulfidril (Prot-SH).²⁴

2.5. Fungsi dan Sistem Vaskularisasi Hepar

Hepar adalah organ terbesar dalam tubuh dengan berat sekitar 1,5 kg pada rata-rata manusia dewasa. Unit fungsional hati adalah lobulus hati yang berbentuk heksagonal yang mengeliingi vena sentralis dan bermuara ke vena hepatika dan

Gambar 2.12 Fungsi GSH Sebagai Antioksidan²⁴

22 vena cava. Hati manusia mengandung 50.000-100.000 lobulus. Di setiap enam sudut luar lobulus terdapat tiga pembuluh, yaitu cabang arteri hepatika, vena porta, dan duktus biliaris. Masing-masing lempeng hati terdiri dari kanalikuli biliaris kecil yang bermuara ke duktus biliaris di dalam septum fibrosa yang memisahkan lobulus hati yang berdekatan. Duktus biliaris dari berbagai lobulus menyatu dan membentuk duktus biliaris komunis. Duktus biliaris komunis akan mengangkut empedu dari hati ke duodenum.²⁵

Di dalam septum fibrosa terdapat venula porta kecil yang menerima darah dari vena saluan pencernaan melalui vena porta. Arteriola hepatika yang terdapat di dalam septum interlobularis akan menyuplai darah ke jaringan septum di antara lobulus yang berdekatan dan beberapa bermuara langsung ke sinusoid. Hepatosit menerima darah segar dari arteri hepatika yang membawa oksigen dan metabolit untuk diproses di hati. Darah dari arteri hepatika dan venula porta mengalir ke sinusoid dan diteruskan ke vena sentralis. Vena sentralis membentuk dua atau lebih vena hepatika besar untuk selanjutnya darah dialirkan menuju vena cava inferior.^9,25,26

Darah selalu mengalir dari perifer ke sentral pada setiap lobulus. Kondisi tersebut menyebabkan, oksigen, metabolit, substansi toksik yang diserap usus akan mencapai bagian perifer terlebih dahulu lalu bergerak ke sentral. Kondisi tersebut menyebabkan bagian hepatosit periportal berperan dalam metabolisme aerob dan sintesis protein, sedangkan bagian sentrolobular yang memiliki konsentrasi nutrisi dan oksigen rendah berperan dalam detoksifikasi dan metabolisme glikogen. Hepatosit tersusun dari banyak retikulum endoplasma (RE) kasar dan halus. RE kasar berperan dalam sintesis protein sedangkan RE halus berperan dalam proses oksidasi, metilasi, dan konjugasi untuk inaktivasi atau detoksifikasi berbagai zat sebelum diekskresikan. Oleh karena itu, kerusakan pada hepatosit akan menyebabkan proses detoksifikasi tidak berjalan baik yang menyebabkan zat-zat berbahaya terus terbawa aliran darah dalam sistem hepar.⁹

Hati memiliki aliran darah yang tinggi dengan tahanan vaskular yang rendah. Sekitar 1.350 ml darah per menit mengalir ke sinusoid hati yang berasal dari 1.050 ml vena porta dan 300 ml arteri hepatika. Rata-rata tekanan di dalam vena porta yang bermuara ke vena sentralis sekitar 9 mmHg dan rata-rata tekanan

23 yang keluar ke vena cava hampir 0 mmHg. Hal tersebut menunjukkan bahwa tahanan aliran darah yang menuju sinusoid sangat rendah. Hati merupakan organ yang dapat membesar sehingga sejumlah besar volume darah disimpan di hati sekitar 450 ml sehingga hati dapat menampung darah secara bermakna dalam kondisi volume darah berlebihan dan mampu menyuplai darah ekstra di saat kekurangan volume darah.²⁵

Sinusoid vena dilapisi oleh sel endotel khusus dan sel kupffer besar.

Lapisan endotel sinusoid memeiliki pori-pori yang besar dengan diameter sekitar 1 µm sehingga zat-zat dalam plasma dapat bergerak bebas dan banyak protein berdifusi dalam ruang Disse. Ruang Disse/perisinusoidal adalah ruang yang terletak di bawah lapisan endotel yang berhubungan dengan pembuluh limfe di dalam septum interlobularis.²⁵

Sel kupffer, sel stellata hepatik dan sel endotelial memiliki potensial yang besar untuk mengalami stres oksidatif akibat ROS yang dapat berakibat pada inflamasi dan apoptosis. Sel kupffer (sel retikuloendotelial) merupakan makrofag yang melapisi sinusoid dan mampu memfagositosis bakteri dan benda asing lainnya dalam sinus hepatikus. Berbagai sitokin seperti TNFα dapat dihasilkan oleh sel kupffer yang mengalami stres oksidatif. Stres oksidatif ini akan mengganggu metabolisme lipid, protein, ekspresi DNA, dan lain-lain.

Patofisiologi kerusakan hepar akibat stres oksidatif terdiri dari disregulasi metabolisme lipid (steatosis), disfungsi hepar (degenerasi hepatosit dan kematian), dan aktivasi respon imun (inflamasi dan fibrosis/sirosis). Tubuh akan merespon jejas sel terhadap stres oksidatif hepar dengan mensintesis GSH.^7,9,25

24 Gambar 2.13 Struktur Histologi Hepar ⁹

Hepar memiliki banyak fungsi, yaitu sebagai tempat penyimpanan darah dan besi dalam bentuk ferritin, tempat metabolisme beberapa nutrien utama (karbohidrat, lemak, protein), membentuk protein plasma termasuk protein fase akut dan zat-zat darah yang digunakan untuk koagulasi, sebagai tempat penyimpanan makro dan mikronutrien (glikogen, lemak, besi, tembaga, vitamin), aktivasi vitamin D, dan menyekresi obat-obatan, hormon, serta zat lainnya. Selain itu, hepar juga berfungsi dalam detoksifikasi berbagai substansi yang masuk ke dalam tubuh. Obat-obatan, toksik lingkungan, dan komponen diet memiliki potensi untuk menyebabkan kerusakan hepar melalui stres oksidatif.^7,25,26

Pada kondisi sel-sel parenkim hati rusak akibat proses peradangan berulang dan berkepanjangan, sel-sel tersebut akan digantikan oleh jaringan fibrosa di sekitar pembuluh darah sehingga menghambat aliran darah porta. Bila sistem portal tersumbat maka kembalinya darah dari usus dan limpa melalui sistem portal ke sirkulasi sistemik akan terhambat dan terjadi hipertensi portal.²⁵

25 2.6. Kerangka Teori

Ekstrak biji jarak pagar

mengandung ROS

radikal hidroksil berikatan dengan

PUFA

peroksidasi lipid

MDA memiliki aktivitas

antioksidan

SOD, Katalase, Peroksidase, GSH

antioksidan bereaksi dengan radikal

bebas

GSH konjugasi dengan radikal

bebas

↑aktivitas GSH

timbul stres oksidatif

↑kadar MDA

menekan stres oksidatif

jejas sel

kerusakan hepatosit gangguan detoksifikasi

zat berbahaya terus terbawa

aliran intrahepatik akumulasi di

vena sentralis melindungi dari

kerusakan sel

curcin, flavonoid

26 2.7. Kerangka Konsep

Ekstrak biji jarak pagar

stres oksidatif

Hepar Kadar MDA?

Aktivitas GSH ? efek proteksi

Perubahan diameter vena sentralis ?

27

. BAB 3

METODE PENELITIAN 3.1. Desain Penelitian

Desain penelitian yang digunakan yaitu desain eksperimental analitik.

Penelitian ini menggunakan kelompok perlakuan dosis ekstrak biji jarak pagar dan kelompok kontrol, mengukur kadar MDA dan aktivitas GSH serta diameter vena sentralis. Penelitian ini merupakan penelitian lanjutan yang dilakukan oleh Fio Noviany dan Nabilah Aulia sehingga beberapa tahapan penelitian telah dilakukan sebelumnya dan telah dinyatakan lolos uji etik oleh Komisi Etik Penelitian Kesehatan Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia (SK No 68/UN2.F1/ETIK/2015).

Tahapan yang telah dilakukan pada penelitian sebelumnya, yaitu pembuatan ekstrak biji jarak pagar dan perhitungan dosis, penghilangan senyawa resin, persiapan, pemberian perlakuan dan adaptasi tikus putih jantan (Rattus novergicus) spesis Sparague-Dawley, terminasi dan eksisi tikus, pembuatan homogenat jaringan, dan pembuatan paraffin blok dari jaringan hepar.

3.2. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada Februari 2019 - April 2019. Penelitian tersebut dilakukan di Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Histologi Fakultas Kedokteran UIN Syarif Hidayatullah Jakarta. Laboratorium Biokimia digunakan sebagai tempat pemeriksaan kadar MDA dan aktivitas GSH dengan menggunakan spektrofotometer, sedangkan Laboratorium Histologi digunakan sebagai tempat pembuatan preparat hepar.

3.3. Populasi dan Sampel Penelitian

Populasi yang digunakan pada penelitian ini adalah 25 ekor tikus putih jantan (Rattus novergicus) spesies Sparague-Dawley yang berusia 9-10 minggu

28 dengan massa 250-350 gram. Hewan uji tersebut dikelompokkan menjadi satu kelompok kontrol dan empat kelompok perlakuan yang mendapat dosis ekstrak biji jarak pagar yang berbeda-beda. Kelompok tersebut terdiri dari kelompok perlakuan dosis 5 mg/kgBB, dosis 25 mg/kgBB, dosis 50 mg/kgBB, dan dosis 250 mg/kgBB. Masing-masing kelompok terdiri dari 5 ekor tikus jantan. Jumlah kelompok sampel sebanyak lima kelompok, disesuaikan dengan guideline WHO (2000) pada Research Guideline for Evaluating the Safety and Efficacy of Herbal Medicines Guideline tersebut menyatakan bahwa penelitian dengan hewan pengerat masing-masing kelompok harus terdiri dari setidaknya lima ekor. Sampel jaringan yang digunakan dari hewan uji tersebut adalah jaringan hepar.²⁷ Faktor inklusi untuk hewan uji coba pada penelitian ini yaitu tikus jantan fertil dan tikus yang sehat yakni berat badan selama proses aklimatisasi tidak mengalami perubahan lebih dari 10% dan secara visual menunjukkan perilaku normal. Tikus yang mati selama proses induksi ekstrak biji jarak pagar tidak dilanjutkan untuk digunakan pada penelitian.

3.4. Cara Kerja Penelitian

3.4.1. Alat dan Bahan

3.4.1.1. Alat

Alat yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari spatula, timbangan analitik, gunting, isolasi, lem, stapler, wadah plastik tertutup, wadah kaca tertutup, batang pengaduk, pinset, gelas ukur, beaker glass, embedding cassette, inkubator, hotplate stirrer, paraffin water bath, rotary microtome, kuas, object glass, cover glass, staining jar, timer, mikroskop, microtube, homogenizer stirrer, freezer, kulkas, tabung reaksi, vortex, mikropipet, pipet tetes, disposable, rotator, alat penangas, dan spektrofotometer.

29 3.4.1.2. Bahan

Bahan yang digunakan pada penelitian ini terdiri dari serbuk biji jarak pagar, tikus putih jantan (Rattus novergicus) spesies Sparague-Dawley yang berusia 9-10 minggu, karton/kertas kalender, formalin 10% dalam PBS, alkohol 30%, alkohol 50%, alkohol 70%, alkohol 80%, alkohol 90%, alkohol 95%, alkohol absolut, toluol-alkohol (1:1), toluol murni, toluol parafin (1:1), parafin cair, es batu, albumin dan gliserin, aquadest, xylol, asam alkohol (alkohol 70%+HCl), Hematoksilin-Eosin (HE), canada balsam, homogenat jaringan, asam trikloroasetat (TCA) 10%, TBA 0,67%, TCA 5%, DTNB, dan dapar fosfat pH 8,0.

3.4.2. Pembuatan Ekstrak Biji Jarak Pagar

Biji jarak pagar diperoleh dari BALITTRO (Balai Penelitian Tanaman Rempah dan Obat) Bogos, Jawa Barat berupa serbuk halus (simplisia) sebanyak 1,5 kg. Serbuk disimpan dalam wadah kering, tertutup rapat, dan terlindung dari cahaya. Ekstrak biji jarak pagar dibuat dengan menggunakan metode ekstraksi cara dingin yaitu maserasi. Serbuk simplisia dimaserasi dengan pelarut n-heksana dalam wadah gelap sampai terendam. Zat pelarut diganti setiap 2-3 hari sekali.

Proses maserasi diulang hingga menghasilkan maserat berwarna pucat. Maserat difiltrasi menggunakan kapas dan kertas saring hingga terbentuk filtrat. Filtrat dipekatkan menggunakan vacuum rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak biji jarak bagar sebanyak 150 gram.^27,28

Kelompok kontrol/kontrol negatif pada penelitian ini yaitu dosis 0 (Na CMC 1%). Dosis kelompok perlakuan terdiri dari 5 mg/kgBB, 25 mg/kgBB, 50 mg/kgBB, dan 250 mg/kgBB. Dosis 250 mg/kgBB dilakukan penghilangan senyawa resin. Proses penghilangan resin disebut degumming. Resin dihilangkan dengan cara memanaskan 40 gram ekstrak biji jarak pagar pada suhu 70⁰ C, lalu ditambahkan 1,2 ml akuades suhu 90⁰ C dan 80 µl asam fosfat 85%. Campuran tersebut dihomogenkan dengan kecepatan 1000 rpm selama 60 menit. Endapan yang terbentuk disentrifugasi dengan kecepatan 3500 rpm selama 30 menit hingga

30 terpisah dari filtratnya. Filtrat yang diperoleh sebanyak 36,58 gram dikeringkan untuk menghilangkan sisa pelarut.^27,28

3.4.3. Persiapan dan Pemberian Perlakuan Hewan Uji

Beberapa hal yang dipersiapkan untuk pemeliharaan hewan uji meliputi kandang, sekam, tempat makan dan minum. Tikus putih jantan diaklimatisasi di Laboratorium Animal House selama 28 hari. Tikus diberi makan dan minum standar ad libitum dan setiap hari dilakukan pengamatan kondisi umum dan penimbangan berat badan tikus. Kemudian tikus diberikan tanda pengenal/label dan perlakuan sesuai dengan perencanaan.^27,28

Penelitian ini terdiri dari empat kelompok perlakuan dan satu kelompok kontrol. Setiap kelompok terdiri dari lima ekor tikus putih jantan yang telah diberi tanda pengenal. Ekstrak biji jarak pagar diberikan secara oral sesuai dengan dosis yang telah ditentukan. Pemberian ekstrak biji jarak pagar dilakukan satu kali sehari pada siang hari.²⁷

3.4.4. Proses Terminasi dan Eksisi Tikus

Setelah 25 ekor tikus jantan spesies Sparague Dawley usia 9-10 minggu yang bermassa 250-350 gram diberi perlakuan selama 28 hari, tikus diterminasi dengan cara dimasukkan ke suatu kamar yang telah dilapisi kapas yang sudah dibasahi eter. Tikus dibiarkan dalam kamar tersebut hingga mati. Tikus yang telah mati lalu dibedah untuk diambil organ heparnya. Organ hepar kemudian disimpan di dalam wadah dan dimasukkan ke dalam freezer suhu -80⁰C.^27,28

3.4.5. Persiapan Jaringan Hepar

Jaringan hepar yang telah disimpan dalam freezer selanjutnya dipotong dan ditimbang dengan timbangan analitik hingga didapatkan massa 25 mg jaringan dari masing-masing tikus. Jaringan tersebut kemudian dimasukkan ke microtube dan ditambahkan larutan PBS 7,4 untuk dibuat homogenat jaringan dan

31 dilakukan pengukuran kadar MDA serta aktivitas GSH. Sebagian jaringan yang lain dipotong sedikit bagiannya untuk dimasukkan ke dalam wadah plastik berisi formalin 10% dan PBS untuk dibuat preparat dengan pewarnaan Hematoksilin- Eosin untuk melihat histologi parenkim hepar.^27,28

3.4.6. Pengukuran Kadar Malondialdehid (MDA) dan Aktivitas GSH

3.4.6.1. Pembuatan Homogenat Jaringan

Jaringan dalam PBS 7,4 dihomogenasi dengan Homogenizer Stirrer.

Homogenat yang diperoleh dimasukkan ke dalam microtube dan disimpan di freezer dengan suhu -80⁰ C. Homogenat tersebut kemudian akan diukur kadar MDA dan aktivitas GSH dengan menggunakan spektrofotometer.²⁸

3.4.6.2. Pengukuran Kadar MDA

Siapkan 2 tabung reaksi dan beri label untuk tabung uji dan tabung blanko.

Selanjutnya tambahkan 0,125 ml/125 µl homogenat jaringan ke dalam tabung reaksi berlabel uji dibuat duplo. Untuk tabung blanko, masukkan 0,125 ml/125 µl akuades. Lalu pada masing-masing tabung reaksi, tambahkan larutan TCA 10%

dingin sebanyak 0,25 ml/250 µl. Setelah penambahan TCA, kedua tabung reaksi dimasukkan ke dalam mesin rotator untuk dikocok dan disentrifugasi hingga terbentuk supernatan. Tabung reaksi disentrifugasi dengan kecepatan 5000 rpm selama 5 menit. Setelah terbentuk supernatan, ambil supernatan pada masing- masing tabung reaksi. Kemudian tambahkan larutan TBA 0,67% sebanyak 0,375 ml/375 µl ke dalam masing-masing tabung reaksi yang mengandung supernatan.

Selanjutnya masukkan kedua tabung reaksi tersebut ke dalam mesin penangas yang berisi air mendidih selama 10 menit lalu angkat dan dinginkan. Setelah kedua larutan dalam tabung reaksi menjadi dingin, pindahkan larutan ke dalam tabung spektrofotometer. Baca serapan dengan panjang gelombang 532 nm pada spektrofotometer.²⁹

32 3.4.6.3. Pengukuran Aktivitas GSH

Untuk pengukuran kadar GSH digunakan 25 µL homogenat jaringan yang dibuat duplo, kemudian dtambahkan 100 µL TCA 5%, untuk mengendapkan protein, dan dikocok hingga homogen. Setelah itu ditambahakan 875 µL dapar fosfat pH 8,0. Selanjutnya dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 3200 rpm selama 10 menit, lalu supernatan diambil dan ditambahkan 12,5 µL DTNB yang sebelumnya telah dilarutkan dalam buffer fosfat pH 7,0 (1:1) dan didiamkan selama satu jam. Serapan diukur pada panjang gelombang 412 nm pada spektrofotometer dan dibandingkan dengan serapan larutan standar GSH dengan kadar 0; 1; 2; 4; 5; 10 dan 20 µg/ml.²⁹

3.4.7. Pembuatan Preparat Histologi dan Pewarnaan Hematoksilin-Eosin

3.4.7.1. Dehidrasi

Proses dehidrasi dilakukan dengan menggunakan alkohol dengan konsentrasi yang berbeda-beda, yaitu 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, dan alkohol absolut. Setelah selesai pengenceran, setiap alkohol dengan konsentrasi yang berbeda dituangkan ke dalam 3 buah wadah plastik sebanyak setengah volume wadah plastik tersebut, lalu diberi label I, II, dan III untuk mengidentifikasi dan menandakan urutan perlakuan. Jaringan yang sudah direndam formalin 10% dengan PBS dikeluarkan untuk proses dehidrasi dan dimasukkan ke dalam wadah plastik yang telah diberi label sebelumnya secara berurutan mulai dari alkohol konsentrasi rendah sampai konsentrasi tinggi dan alkohol absolut. Jaringan tersebut kemudian didiamkan selama 20 menit pada masing-masing wadah plastik.²⁸

3.4.7.2. Clearing

Proses clearing bertujuan untuk menghilangkan alkohol dari dalam jaringan. Bahan yang digunakan terdiri dari campuran toluol-alkohol dengan