BAB III
BAHAN,ALAT,METODE PENELITIAN
3.1. Bahan
1. Inokulum Rhizopus oryzae dari , Laboratorium Pato-logi Klinik RSUD dr Soetomo Surabaya.
2. Media potatoes dekstrosa agar { komposisi pada lampiran I . )
3. Media Czapek tanpa agar ( komposisi pada lampiran 1.) *1 . HCl pa (E.Merck) 5. HgSO.! pa (E.Merck} 6. HNGj pa (E.Merck) 7. NaOH pa (E.Merck) 8. CuSO^ pa {E.Merck)
9. Kertas saring whatman No 42 3.2 ALAT
L . Spekt.rof otomet.er sorapan atom Perkin Elmer 380 2.Spectronic 20 Bausch and Lamb
3 . pH meter T O A H M -30 ii
4.Autoclaf All American Mode No 25 Y 5.Almari pengeriny memmert 85 S
6.Iimbangan anaiitik Sartorius type 2472 7.Laminair air flow cabinet
8.Shaker
'i.3. Metode penelitian 3.3.1. Penyediaan inokulum
Pihu.it media pot ,i I nos (U'Uf;trosa agar 1 liter. Kentany dikupat-; dan dicuei bersih lalu ditiriskan, ditimbaug 200 gram. Kemudian diiris tipis dan direbus dengan 1 liter air, dibiarkan mendidih dan ditunggu sampai lunak. Disaring panas -panas dengan kain kasa. Pada filtrat dimasukkan dekstrosa 20 garam, agar 18 g r a m , CaCO^ 0 , 2 gram, MgSO^ 7 ^ 0 0 , 2 gram, diaduk hingga h o m o g e n ,ditambah air suling hingga 1 liter. Media yang ptniciu ini dituang dalam tabung-tabling reaksi. Solan jut nya disterilkan dalam autoklaf suhu !2l°c, i '•ls.iti.ui 2 a t in ‘.flaiiM >11) men i t . Sete 1 ah didigiu- kan sampai inemadat, media diinokulasi dengan inokulum
Rhi^upua oryzdo, d i inkubaa i pada suhu katnar hingga
tumbuh spora dewasa. Kemudian inokulum ini diinoku lasi kan dalam media Czapek tanpa agar.
3.3.2. Penyediaan Media Czapek Tanpa Agar
Untuk pembuatan media Czapek Tanpa Agar , ditim- bang seluruh bahan, dilarutkan dengan air suling hingga mendekati 1 liter, kemudian diamati pH media dengan pH meter. pH diatur dengan penambahan NaoH 1N/0,1\ dan H C 1 1/0,IN hingga diperoleh pH b. selan- jutnva ditambah air suling hingga 1 liter, disteri- lisasi dengan autoklal pada suhu 121°C tekanan 2 atm selania 20 menit.
3.3.3.Pembiakan spora Rhizopus oryzae dalam media kultur terendam
Biakan Rhizopus oryzae yang berumur tiga hari, d i m a s u k k a n em p a t ose ke d a l a m m e d i a CTA 100 ml secara aseptis, kemudian diinkubasi pada suhu kamar
(25-30)°C samb.il distirer selaroa waktu (4-5) hari hingga diperoleh transmitan 25 % pada panjang gelom- bang 650 nm.Selanjutnya secara aseptis dimasukkan 5 ml suspensi biakan kultur terendam tersebut ke dalam media Czapek tanpa agar (CTA) 25 ml ,diinkubasi pada suhu kamar ( 2 5-30)° C .S a m b i 1 dikocok dengan shaker, untuk diamati pertumbuhannya setiap hari.
3.3.4. Pengamatan Pertumbuhan
Pengamatan dilakukan setiap hari dengan cara menimbang berat sel kering setiap hari. Koloni dalam erlenmeyer yang telah dilakukan pengocokan, ditimbang berat sel kering dengan disaring pada kertas whatman no. 42. Hasil penyaringan dioven pada suhu 105 °C dan ditimbang sampai berat konstan.Dengan mengetahui berat kertas whatman tersebut akan diketahui berat sel keringnya.Dilakukan replikasi tiga kali dan data yang diperleh dibuat kurva antara berat sel kering
(mg) dan waktu (hari).
3.3.5.Pembuatan Media CTA yang mengandung Cu
Dibuat larutan baku induk uang men g a n d u n g Cu 100 ppm dengan melarutkan 0,0786 gram CuSO^ 5 ^ 0
labu ukur 100 ml. D i p i p e t 5 ml dari b a k u induk tersebut
dan ditambahkan 35 ml media steril CTA ke dalam erienmeyer. Media CTA yang mengandung Cu tersebut disterilkan dengan autoklaf 121°C,2 atm selatna 20 m e n i t .
3.3.6. Penambahan suspensi sel dalam media CTA
Dimasukkan sejumlah 10 ml suspensi sel basil biakan dengan traninitan 25 % secara teknis aseptis kedalam erienmeyer yang sudah berisi 5 ml 100 ppm Cu dan 35 ml media CTA hingga didapatkan media yang m eng a n d u n g Cu 10 ppm . Diinkubasi pada suhu kamar (25-30)°C sambil dilakukan pengocokan selama tujuh hari. Sel dipanen pada fase stasioner dengan cara disaring menggunakan corong b uchner dengan kartas saring whatman No 42 yang telah ditimbang beratnya. Sel dikeringkan bersama kertas saringnya pada suhu 105°C sampai berat k o n s t a n , f'iltrat yang mengandung sisa sel dimatikan sisa selnya dalam autoklaf pada suhu 121°C 2 atm selama 20 menit. Dengan cara yang sama dilakukan pada media tanpa Cu.
3.3.7. Penetapan Cu dalam sel
Sel yang telah dikeringkan, ditimbang teliti dalam labu destruksi, ditambah HNO3 (2:1) 18 ml. Destruksi campuran tersebut pelan-pelan dengan api kecil hingga didapatkan cairan jernih kekuningan, diuapkan sisa asamnya dan kemudian didinginkan. Hasil destruksi dipindahkan dalam labu ukur 1 0 0 ml,
ditam-bah pelarut ( HNO3 pekat 1,5 ml/1 ) sampai tanda. Disaring, filtrat diamati serapannya dengan SAA pada pamjang gelombang 324,7 n m . Dengan cara yang sama dilakukan pada sel dari media tanpa Cu.
3.3.8.Penetapan Cu dalam filtrat
Filtrat hasil pemisahan sel dipekatkan hingga 50 ml. Ditnasukkan dalam labu destruksi, ditambah HNO3 (2:1) 18 ml. Campuran dipanaskan pelan-pelan dengan api kecil sampai didapat cairan jernih keku- ningan, diuapkan sisa asam serta didinginkan. Dipin- dahkan hasil destruksi dalam labu ukur 1 0 0 ml ,ditam bah pelarut sampai tanda. Filtrat diamati serapannya
dengan SAA pada panjang gelombang 324,7. Dengan cara yang sama dilakukan pada filtrat media yang mengan- dung sel tanpa Cu.
3.3.9.Pembuatan kurva linier
Larutan baku induk dibuat dengan kadar 1 0 0 ppm. Ditimbang 0,0786 gram CuSO^ 5 ^ 0 , dilarutkan dengan larutan H N O3 yang mengandung H N O3 pekat 1,5 ml/1. Dipindahkan ke labu ukur 100 ml dan ditambahkan air suling sampai garis tanda. Dari baku induk tersebut dibuat pengenceran hingga didapatkan kadar larutan baku kerja dengan kadar 1,2,4,6,8,dan 10 ppm. Kemud
ian diamati serapannya dengan SAA pada panjang gelom bang 324,7 nm. Dari hasil pengamatan dibuat persamaan garis regresi.hubungan antara kadar dengan serapan. 3.3.10.Pembuatan kurva kalibrasi Cu dalam media.
p p m .Dit imbang 0,0706 gram C u S 04 5 1 ^ 0 , dilarutkan dengan larutan H N O3 yang mengandung H N O3 pekat 1,5 m l /1.Dipipet 10 ml larutan tersebut dan dimasukkan dalam labu destruksi yang mengandung komposisi media sesuai volume akhir. Kemudian ditambahkan H N O3 : H2SC>4 (2:1) 18 m l . C a m p u r a n t e r s e b u t d i p a n a s k a n pelan-pelan hingga didapatkan larutan jernih kekunin gan. Hasil destruksi tersebut dipindahkan dalam labu ukur- 100 ml dengan larutan H N O3 hingga didapatkan larutan yang mengandung Cu dengan kadar 10 ppm.Dengan cara yang sama dilakukan untuk m e n dapatkan larutan yang m engandung Cu dengan kadar 1 , 2 , 4 ,6,dan 8 ppm. Kemudian diamati serapannya dengan SAA pada panjang gelombang 324,7 n m . Hasil dari p engamatan dihitung dan dibuat persamaan kurva kalibrasi hubungan antara kadar dan serapan.
3 . 3 .11.Pembuatan kurva kalibrasi Cu dalam sel
Sejumlah sel yang telah disaring dan kering dari media, ditambah 10 ml larutan Cu dari baku induk 100 ppm dan ditambahkan larutan H N O g i ^ S O ^ (2:1) 18 ml. Panaskan campuran tersebut pelan-pelan sampai didapatkan larutan jernih kekuningan . Pindahkan hasil destruksi dalam labu ukur 1 0 0 ml dengan larutan H N O3 hingga didapatkan larutan yang mengandung Cu 10 ppm. Dengan cara yang sama dilakukan untuk mendapat kan larutan yang mengandung Cu dengan kadar 1,2 , 4,6 dan 8 ppm.Kemudian diamati serapannya dengan SAA pada
panjang gelombang 324,7. Hasil Dari pengamatan dihi- tung dan dibuat persamaan kurva kalibrasi hubungan antara kadar dan serapan.
3.4. Validasi metode (26) 3.4.1. Presisi
Adalah suatu ukuran dari derajad kinerulangan d a r i m e t o d e a n a l i s i s p a d a k o n d i s i p e l a k s a n a n n o r m a l .Biasanya dinyatakan sebagai deviasi relatif
(koefisien relatif) dengan rumus : S D
KV = ---- x 100 % X
dimana KV = koefisien variasi SD = standar deviasi
D i b u a t tuj u h l a r u t a n Cu d e n g a n k a d a r 6 ppm dilakukan pengamatan serapan terhadap larutan Cu tersebut. Dari hasil pengamatan dihitung koefisien variasi yang merupakan eerminan presisi.
3.4.2.Akurasi
adalah kedekatan hasil yang diperoleh dari suatu metode analisis dengan kadar yang sebenarnya. Akurasi sering dinyatakan dengan prosen recovery. Dilakukan pengukuran serapan terhadap larutan Cu dalam media pada kadar 1,2,4,6 , 8 dan 10 ppm dengan panjang gelombang 324,7 n m .Dimasukkan serapan yang dipero leh pada persamaan kurva linier hingga diperoleh kadar Cu dalam media . Dibandingkan kadar Cu dalam
media dengan kadar Cu standart hingga didapatkan prosen recovery (26).
3.4.3. Batas Deteksi
Adalah batas kadar terkec.il dari zat yang diana- lisa y a n g s e e a t a k u a l i t a t i f m a s i h b i s a dideteksi.Dilakukan pengukuran terhadap serapan media 1 0 kali, dan dihitung standar d e v i a s i n y a .Standar deviasi tersebut kalikan dua yan g merupakan harga serapan. Dilakukan pengamatan serapan terhadap Cu dalam media dengan kadar 0,005-0,4. Kadar terkecil yang mempunyai harga dua kali standar deviasi merupa- kan harga batas deteksi(26).
3.4.4.Batas kuantitasi
Adalah batas kadar terkecil dari analit yang ditetapkan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima. Besarnya batas kuantita si adalah 5 kali batas deteksi (26).
3.4.5. Linieritas
Linieritas suatu metode adalah kemampuan metode untuk memberikan hasil analisis yang sesuai dengan h u k u m L a m b e r t - B e e r d a l a m t r a y e k k a d a r t e r t e n t u . L i n i e r i t a s s u a t u m e t o d e a n a l i s i s d i p e r o l e h d e n g a n m e l a k u k a n p e n y e l e s a i a n m a t e m a t i k t e r h a d a p hasil-hasil analisis, terhadap sampel dengan berbagai kadar analit. Kadar logam berat dalam sampel dihi tung dengan membuktikan korelasi linier antara sera pan dan kadar larutan baku.Hal ini dapat dilihat
dari harga koefisien korelasi :
r
/
( nSXi2 -(S X i )2). (nSYi-(Syi)2) rxv koefisien korelasix - kadar logam berat dalam larutan baku
Y = serapan yang terbaca
n jumlah sampel
Apabila rxy hitung lebih besat dari rxy tabel dengan batas kepercayaan 95 % berarti ada korelasi antara serapan dengan kadar(25).
3.5. Analisa statistik
Untuk mengetahui ada perbedaan bermakna atau tidak antara perlakuan terhadap kadar Cu yang didapat dengan dan tanpa induksi sel menggunakan rancangan dua kelompok teraeak sempurna (pooled t test)
Urutan analisa adalah :
1. Menentukan hipotesa nol (0) dan hipotesa alternatif (Ha).
HO- tidak ada perbedaan bermakna antara
kadar Cu yang didapat dengan dan tanpa induksi sel.
Ha= ada perbedaan bermakana antara Cu yang didapat dengan dan tanpa induksi sel Menghitung harga t hitung.
t =
X i - x
2
sp = /(n1-n2)Sl2 + (n2-l)S2 nl+n2
sp * standar deviasi pooled S * standar deviasi
n = jumlah sampel X * rata»-rata sampel
t hitung dari perhitungan dibandingkan dengan t tabel pada * 5 % . Bila t hitung lebih besar t tabel maka HO ditolak, Ha diterima.
