Makalah 1 - Home Group 4- Asam Nukleat

Makalah Biologi Molekuler

Makalah Biologi Molekuler

CL 1

CL 1

 _–

 _–

 Asam Nukleat

 Asam Nukleat

Disusun oleh:

Disusun oleh:

Home Group

Home Group 4

4

 Angela Susanti

 Angela Susanti

/ 1206247303

/ 1206247303

Farandy

Farandy Haris

Haris

/

/ 1206261251

1206261251

Gandhi

Gandhi Alamsyah

Alamsyah

/

/ 1206242896

1206242896

Indra

Indra Saputra

Saputra

/

/ 1206242132

1206242132

Kevin

Kevin Stevanus

Stevanus S.

S.

/

/ 1206244075

1206244075

DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA

DEPARTEMEN TEKNIK KIMIA

FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA

FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS INDONESIA

DEPOK

DEPOK

2014

2014

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI

Dafta

Daftar r Isi Isi ... 1... 1 Struktur

Struktur Asam Asam Nukleat ...Nukleat ... ... 2 2 - - 77 Fungsi Asam Nukleat ... 8 - 12 Fungsi Asam Nukleat ... 8 - 12 Sintesis

Sintesis Asam Asam Nukleat ...Nukleat ... ... 13 13 - - 2020  Analisis Ku

 Analisis Kualitatif dan Kuanalitatif dan Kuantitatif Asam Nukleatitatif Asam Nukleat t ... ... 21 - 2821 - 28  Aplikasi Asam N

DAFTAR ISI

DAFTAR ISI

Dafta

Daftar r Isi Isi ... 1... 1 Struktur

Struktur Asam Asam Nukleat ...Nukleat ... ... 2 2 - - 77 Fungsi Asam Nukleat ... 8 - 12 Fungsi Asam Nukleat ... 8 - 12 Sintesis

Sintesis Asam Asam Nukleat ...Nukleat ... ... 13 13 - - 2020  Analisis Ku

 Analisis Kualitatif dan Kuanalitatif dan Kuantitatif Asam Nukleatitatif Asam Nukleat t ... ... 21 - 2821 - 28  Aplikasi Asam N

Struktur Asam Nukleat

Struktur Asam Nukleat

Oleh Kevin S. Sembiring / Teknik Kimia / 1206244075 Oleh Kevin S. Sembiring / Teknik Kimia / 1206244075

Abstrak

Abstrak

 Asam

 Asam nukleat nukleat termasuk termasuk dalam dalam makromolekul makromolekul dengan dengan monomer monomer mononukleotimononukleotida da yangyang terdapat pada semua makhluk hidup. Asam nukleat juga dinamakan polinukleotida karena terdapat pada semua makhluk hidup. Asam nukleat juga dinamakan polinukleotida karena tersusun dari polimer nukleotida. Setiap nukleotida tersusun atas tiga

tersusun dari polimer nukleotida. Setiap nukleotida tersusun atas tiga komponen utama, yaitu basakomponen utama, yaitu basa nitrogen, gugus fosfat, dan gula pentosa.

nitrogen, gugus fosfat, dan gula pentosa.  Asam

 Asam nukleat nukleat terbagi terbagi menjadi menjadi dua dua jenis, jenis, yaitu yaitu DNA(DNA(deoxyribonucleid acid deoxyribonucleid acid ) dan) dan RNA(

RNA(ribonucleid acid ribonucleid acid ). Perbedaan struktur yang menonjol dari kedua jenis asam nukleat ini). Perbedaan struktur yang menonjol dari kedua jenis asam nukleat ini terdapat pada komponen gula pentosanya. Perbedaan lainnya terdapat pada basa N-nya. Basa N terdapat pada komponen gula pentosanya. Perbedaan lainnya terdapat pada basa N-nya. Basa N pada DNA dan RNA memiliki struktur cincin aromatik heterosiklik (mengandung C dan N) yang pada DNA dan RNA memiliki struktur cincin aromatik heterosiklik (mengandung C dan N) yang dikelompokkan menjadi dua, yaitu basa purin dan pirimidin. Pada basa purin terdpat dua cincin, dikelompokkan menjadi dua, yaitu basa purin dan pirimidin. Pada basa purin terdpat dua cincin, sedangkan pada pirimidin hanya terdapat cincin tunggal. DNA dan RNA memiliki basa purin yang sedangkan pada pirimidin hanya terdapat cincin tunggal. DNA dan RNA memiliki basa purin yang sama, yaitu adenin dan guanin,tetapi memiliki perbedaan pada basa pirimidinnya. Pada DNA, sama, yaitu adenin dan guanin,tetapi memiliki perbedaan pada basa pirimidinnya. Pada DNA, basa pirimidin penyusunnya adalah sitosin dan guanin, sedangkan pada RNA, basa pirimidin basa pirimidin penyusunnya adalah sitosin dan guanin, sedangkan pada RNA, basa pirimidin penyusunnya adalah sitosin dan urasil.

penyusunnya adalah sitosin dan urasil. Kata kunci :

Kata kunci : asam nukleat, RNA, DNA, ikatan, gugus, basa nitrogenasam nukleat, RNA, DNA, ikatan, gugus, basa nitrogen

Asam Nukleat

Asam Nukleat

 Asam

 Asam nukleat nukleat adalah adalah makromolekul makromolekul yang yang sering sering juga juga dinamakn dinamakn polinukleotipolinukleotida, da, karenakarena tersusun dari sejumlah molekul nukleotida sebagai monomernya. Setiap nukleotida terdapat tiga tersusun dari sejumlah molekul nukleotida sebagai monomernya. Setiap nukleotida terdapat tiga struktur, yaitu basa nitrogen, gugus fosfat, dan gugus gula. Apabila ketiga gugus tersebut struktur, yaitu basa nitrogen, gugus fosfat, dan gugus gula. Apabila ketiga gugus tersebut berikatan akan membentuk nukleotida, sedangkan apabila gugus basa nitrogen dan gugus gula berikatan akan membentuk nukleotida, sedangkan apabila gugus basa nitrogen dan gugus gula saja akan membentuk nukleosida.

saja akan membentuk nukleosida.

(a) (b)

(a) (b)

Gambar 1

Gambar 1

. (a) . (a) Nukleotida. (b)NukleosiNukleotida. (b)Nukleosidada

Basa Nitrogen

Basa Nitrogen

Terdapat dua jenis nasa nitrogen, yaitu purin dan pirimidin. Basa purin adenin dan guanin Terdapat dua jenis nasa nitrogen, yaitu purin dan pirimidin. Basa purin adenin dan guanin terdapat dalam DNA dan

terdapat dalam DNA dan RNA. RNA. Basa pirimidin pada Basa pirimidin pada DNA, yaitu timin dan DNA, yaitu timin dan sitosin, sedangksitosin, sedangk an padaan pada RNA, yaitu urasil dan sitosin.

RNA, yaitu urasil dan sitosin.  A.

 A. Adenin (A)Adenin (A)  Adenin

 Adenin adalah adalah molekul molekul organik organik yang yang dapat dapat ditemukan ditemukan dalam dalam DNA, DNA, RNA, RNA, dan dan adenosineadenosine trifosfat, atau yang lebih umum dikenal sebagai ATP. Adenin memiliki cincin 6 anggota yang trifosfat, atau yang lebih umum dikenal sebagai ATP. Adenin memiliki cincin 6 anggota yang membentuk ikatan dengan 5 anggota cincin pirimidin. Dalam DNA, ikatan yang terjadi antara membentuk ikatan dengan 5 anggota cincin pirimidin. Dalam DNA, ikatan yang terjadi antara adenin dengan timin membentuk struktur akrab yang disebut

adenin dengan timin membentuk struktur akrab yang disebut double helix.double helix. B.

B. Guanin Guanin (G)(G)

Guanin adalah basa purin yang ditemukan dalam RNA dan DNA yang berikatan dengan Guanin adalah basa purin yang ditemukan dalam RNA dan DNA yang berikatan dengan sitosin membentuk ribonukleosida disebut deoksiribosa dan kemudian membentuk sitosin membentuk ribonukleosida disebut deoksiribosa dan kemudian membentuk deoxyguanosine

C. Sitosin (C)

Sitosin adalah basa nitrogen berbentuk piramida yang berikatan dengan guanin dalam DNA dan RNA sebagai nukleotida dan berfungsi sebagai bagian dari kode genetik.

D. Timin (T)

Timin adalah basa pirimidin yang dapat ditemukan dalam DNA yang berikatan dengan adenin. Ketika berkombinasi dengan deoksiribosa akan terbentuk thymadine nukleosida, yang terlibat dalam transfer serta preservasi informasi genetik. Timin juga dapat berikatan dengan senyawa fosfat menjadi monofosfat, difosfat, atau trifosfat.

Purin dan pirimidin berikatan dengan deoksiribosa membentuk nukleosida atau deoksiribonukleosida. Basa nitrogen yang terdapat dalam DNA memiliki jumlah yang tidak sama, namun jumlah adenin(A) dan timin(T) sama, begitu pula dengan jumlah guanin(G) dan sitosin(C). Persamaan jumlah ini sesuai dengan ketentuan Chargaff, yaitu adenin(A) akan berpasangan dengan timin(T) membentuk dua ikatan hidrogen, sedangkan sitosin(C) berpasangan dengan guanin(G) membentuk tiga ikatan hidrogen.

Gambar 2

. Basa Purin

Gambar 3

. Basa Pirimidin

Gugus Fosfat

Gugus fosfat merupakan gugus yang dapat menentukan sifat keasaman pada asam nukleat. Pada pH netral, adanya gugus fosfat yang berikatan menyebabkan asam nukleat bermuatan negatif karena gugus tersebut mudah untuk melepaskan protonnya. Pada asam nukleat juga terdapat ikatan kovalen yang menhubungkan gugus fosfat dengan gugus hidroksil (OH) pada C5 dan C3 gula pentosa nukleotida selanjutnya. Ikatan inilah yang dinamakan ikatan fosfodiester.

Gula Pentosa

 Asam nukleat juga tersusun atas ribosa (b-D-furanosa), yaitu gula pentosa (jumlah karbon lima). Gula ribosa yang berikatan dengan basa nitrogen disebut nukleosida, dan apabila berikatan lagi dengan satu atau lebih gugus fosfat, disebut nukleotida.

Gambar 5

. Struktur Aldehid dan Beta-Furanose

Ikatan Fosfodiester

Nukleotida yang berurutan pada DNA dan RNA dihubungkan dengan ikatan kovalen melalui gugus fosfat di mana gugu fosfat yang bernomor 5‟ pada satu nukleotida bergabung dengan gugus hidroksil 3‟ pada nukleotid a selanjutnya membentuk ikatan fosfodiester.

Gambar 6

. Ikatan Fosfodiester pada DNA dan RNA

DNA(

d e o x y r i b o n u c l e i d a c i d  

)

DNA adalah makromolekul polinukleotida yang tersusun atas polimer nukleotida yang berulang, tersusun rangkap dan membentuk DNA helix ganda dan berpilin. DNA tersusun oleh nukleotida yang terdiri dari tiga gugus molekul, yaitu gugus gula, gugus fosfat, dan basa nitrogen.

Gambar 7

. (a) Gambaran Skematik Bentuk dari Helix. (b) Gambaran batang, menunjukkan struktur dan kumpulan basa. (c) Model Space-Filling 

DNA tersusun atas basa purin, yaitu timin dan adenin yang dihubungkan dengan dua ikatan hidrogen, dan basa pirimidin, yaitu guanin dan sitosin yang dihubungkan dengan tiga ikatan hidrogen. Ikatan hidrogen antara guanin dan sitosin lebih banyak, sehingga mengakibatkan ikatan G-C akan lebih sulit mengalami denaturasi dibandingkan dengan ikatan A-T.

Gambar 8

. Ikatan A-T dan G-C

Struktur DNA terdiri dari 2 utas polinukleotida yang saling melingkar membentuk heliks ganda dengan arah putar ke kanan. Dilihat dari strukturnya, DNA terbagi atas tiga bentuk yang berbeda, yaitu A-DNA, B-DNA, dan Z-DNA. Pada ketiga tampilan DNA tersebut, kedua untai polinukleotida anti paralel tersebut dihubungkan berdasarkan prinsip pasangan basa Watson Crick.

Tabel 1

. Perbandingan A-DNA, B-DNA, dan Z-DNA

RNA (

R i b o n u c l ei d A c i d  

)

RNA (ribonucleid acid ) merupakan asam ribonukleat yang berfungsi sebagai tempat penyimpan dan pentransfer informasi genetik. RNA juga dapat berfungsi sebagai enzim yang dapat mengkalis molekul RNA lainnya atau formasi RNAnya sendiri. Setiap RNA tersusun atas rantai tunggal polinukleotida. Setiap nukleotida tersebut tersusun atas tiga komponen utama, yaitu gugus fosfat, basa nitrogen, dan gugus gula. Pada gugus nitrogen, purin dan pirimidin yang berikatan dengan ribosa akan membentuk suatu molekul yang dinamakan nukleosida. Nukleosida yang berikatan dengan gugus fosfat disebut juga nukleotida.

Tipe RNA terbagi atas tiga, yaitu mRNA ( messenger  RNA), tRNA (transfer RNA), dan rRNA (ribosomonal RNA). mRNA merupakan RNA yang membawa pesan atau kode genetik dari kromosom menuju ke ribosom. Kode-kode yang dibawa RNA tersebut kemudian akan dibuat menjadi cetakan untuk menentukan spesifitas urutan asam amino pada rantai polipeptida. tRNA kemudian datang membawa asam amino yang sesuai dengan kode yang dibawa oleh mRNA. tRNA akan tergabung dengan mRNA sesuai dengan kode pasangan basa N-nya yang seharusnya. Kemudian, asam amino akan berjajar sesuai urutan dengan kode sehingga terbentuklah protein yang diharapkan.

Gambar 10

. Struktur Tiga Dimensi dari RNA

A-DNA

B-DNA

Z-DNA

Helical sense Right handed Right handed Left handed

Diameter 26 Å 20 Å 18 Å

Base pairs per helical turn

11 10.5 12

Helix rise per base pair

2.6 A 3.4 A 3.7 A

Base tilt normal to the helix axis

20o 6o 7o

Sugar pucker c o n f o r m a t i o n

C-3‟ endo C-2‟ endo C-2‟ endo for

 pyrimidines; C-3’ endo for purines

G l y c o s y l b o n d c o n f o r m a t i o n

 Anti Anti Anti fir pyrimidines;

Referensi

 Anonim. Asam Nukleat. Tersedia pada :

http://fpk.unair.ac.id/webo/kuliah-pdf/ASAM%20NUKLEAT-6%20%5Bcompatibility%20Mode%5D.pdf  (diakses Sabtu,15 Februari 2014).

Koolman, J. dan Roehm, K.H.(2005) Color Atlas of Biochemistry . Stuttgart: Thieme.

Murray, R.K., Granner,D.K., dan Rodwell,V.W.(2006) Harper’s Illustrated Biochemistry . 27th edition. Colombus: The McGraw-Hill Companies.

Sridianti (2013) Mengenal Empat Jenis Basa Nitrogen. Tersedia pada :

http://sridianti.com/mengenal-empat-jenis-basa-nitrogen.html (diakses Sabtu,15 Februari 2014).

Sutarno (2012) Struktur Materi Genetik. Tersedia pada :

http://sutarno.staff.uns.ac.id/files/2012/10/Genet-lanjut-3-materi-genetik-struktur.ppsx (diakses Sabtu, 15 Februari 2014).

Fungsi Asam Nukleat

Oleh Gandhi Alamsyah / Teknik Kimia / 1206242896

Abstrak

 Asam nukleat merupakan sebuah substansi kimia yang membawa informasi genetik sel. Dalam DNA sel tersimpan informasi yang akan menentukan sifat dari suatu sel, mengatur pertumbuhan dan pembelahan sel, mengarahkan proses biosintesis dari enzim-enzim dan berbagai protein lain yang diperlukan untuk menjalankan fungsi sel. Salah satu fungsi utama DNA adalah menjaga informasi – informasi yang akan diberikan dari sel induk kepada turunannya.

Kata kunci : sintesis protein, autokatalis, heterokatalis, transfer kode genetik, katalisator, miRNA, RNAi

I. Asam Nukleat

 Asam nukleat merupakan makromolekul yang tersusun dari polimer nukleotida. Asam nukleat memiliki fungsi utama dalam tubuh yaitu antara lain sebagai materi genetik, koenzim serta energi. Asam nukleat yang berperan sebagai materi genetik adalah DNA dan RNA, sedangkan yang berperan sebagai koenzim dan energi antara lain adalah adalah ATP atau  Adenosine Triphospate dan NAD atau Nicotinamide-adenine Dinucleotide.

NAD adalah asam nukleat yang berfungsi sebagai koenzim. NAD atau disebut Nicotinamide-adenine Dinucleotide  terdiri dari dua nukleotida yang dihubungkan dengan dua gugus fosfat dan mengandung basa nitrogen adenin dan yang lain adalah nikotinamida. NAD dapat berubah menjadi NADH. Jika NAD berfungsi sebagai oksidator, maka NADH berfungsi sebagai reduktor.

 ATP atau  Adenosin Triphospate adalah asam nukleat yang berperan sebagai energi. ATP tersusun dari tiga gugus fosfat, satu gula pentosa, dan satu basa nitrogen adenin. ATP berasal dari sintesis senyawa AMP yang kemudian menjadi ADP. ATP inilah yang bisa digunakan sebagai energi bagi tubuh kita.

II. Asam Deoksiribonukleat (

Deoxyribonu cleic acid 

, DNA)

DNA, Deoxyribose Nucleic Acid adalah asam nukleotida, biasanya dalam bentuk heliks ganda yang mengandung instruksi genetik yang menentukan perkembangan biologis dari seluruh bentuk kehidupan sel. DNA berbentuk polimer panjang nukleotida, yang mengkode barisan residu asam amino dalam protein dengan menggunakan kode genetik, sebuah kode nukleotida triplet. DNA seringkali dirujuk sebagai molekul hereditas karena ia bertanggung jawab dalam penurunan sifat genetika dari kebanyakan ciri yang diwariskan.  DNA adalah material genetik yang organisme warisi dari orang tua mereka. Setiap kromosom mengandung satu molekul DNA yang panjang, yang umumnya membawa beberapa ratus atau lebih gen.

Beberapa fungsi penting dari DNA antara lain : sebagai pembawa materi genetika dari generasi ke generasi berikutnya, untuk mengontrol aktivitas hidup secara langsung maupun tidak langsung, melakukan sintesis protein, sebagai autokatalis (yaitu kemampuan DNA untuk menggandakan diri / replikasi), dan sebagai heterokatalis (yaitu kemampuan DNA untuk dapat mensintesis senyawa lain).

II. 1 Peran Asam Deoksiribonu kleat dalam Sintesis Protein

Pada replikasi DNA, rantai DNA baru dibentuk berdasarkan urutan nukleotida pada DNA yang digandakan. Replikasi merupakan proses pelipatgandaan DNA. Proses replikasi ini diperlukan ketika sel akan membelah diri.  Pada setiap sel, kecuali sel gamet,  pembelahan diri harus disertai dengan replikasi DNA supaya semua sel turunan memiliki informasi genetik yang sama.

Pada dasarnya, proses replikasi memanfaatkan fakta bahwa DNA terdiri dari dua rantai dan rantai yang satu merupakan "konjugat" dari rantai pasangannya. Dengan kata lain, dengan mengetahui susunan satu rantai, maka susunan rantai pasangan dapat dengan mudah dibentuk.

 Ada beberapa teori yang mencoba menjelaskan bagaimana proses replikasi DNA ini terjadi. Salah satu teori yang paling populer menyatakan bahwa pada masing-masing DNA baru yang diperoleh pada akhir proses replikasi; satu rantai tunggal merupakan rantai DNA dari rantai DNA sebelumnya, sedangkan rantai pasangannya merupakan rantai yang baru disintesis. Rantai tunggal yang diperoleh dari DNA sebelumnya tersebut bertindak sebagai "cetakan" untuk membuat rantai pasangannya. Proses replikasi memerlukan protein atau   enzim pembantu; salah satu yang terpenting dikenal dengan nama DNA polimerase,  yang merupakan enzim pembantu pembentukan rantai DNA baru yang merupakan suatu polimer.  Proses replikasi diawali dengan pembukaan untaian ganda DNA pada titik-titik tertentu di sepanjang rantai DNA.

Proses pembukaan rantai DNA ini dibantu oleh enzim helikase yang dapat mengenali titik-titik tersebut, dan enzim girase yang mampu membuka pilinan rantai DNA. Setelah cukup ruang terbentuk akibat pembukaan untaian ganda ini, DNA polimerase masuk dan mengikat diri pada kedua rantai DNA yang sudah terbuka secara lokal tersebut. Proses pembukaan rantai ganda tersebut berlangsung disertai dengan pergeseran DNA polimerase mengikuti arah membukanya rantai ganda. Monomer DNA ditambahkan di kedua sisi rantai yang membuka setiap kali DNA polimerase bergeser. Hal ini berlanjut sampai seluruh rantai telah benar-benar terpisah. Proses replikasi DNA ini merupakan proses yang rumit namun teliti. Proses sintesis rantai DNA baru memiliki suatu mekanisme yang mencegah terjadinya kesalahan pemasukan monomer yang dapat berakibat fatal. Karena mekanisme inilah kemungkinan terjadinya kesalahan sintesis amatlah kecil.

II.2 Asam Deoksiribonuk leat s ebagai Penyimpan Materi Genetik

Pada masing-masing basa nitrogen terdapat informasi genetik yang disimpan oleh DNA. Oleh karena itu, basa nitrogen pada DNA disebut juga sebagai kode genetik atau kodon. Basa nitrogen yang dikenal terdapat 2 jenis, purin dan pirimidin. Purin (adenin dan guanin) serta pirimidin ( sitosin dan timin atau urasil pada RNA) berpasangan satu sama lain pada masing-masing untaian pada DNA. Pasangan yang terbentuk sesuai dengan aturan bahwa adenin berpasangan (A) dengan timin (T), sedangkan guanin (G) dengan sitosin (C). Pada proses pembentukan protein, dimana salah satu untaian akan ditranskripsi menjadi mRNA, basa nitrogen ini akan diterjemahkan tiap 3 buah basa nitrogen. Dari t iap 3 basa nitrogen akan disintesis sebuah asam amino yang nantinya menyusun protein yang dibutuhkan.

III. Asam Ribonukleat (

ribon ucleic acid, RNA

)

 Asam ribonukleat (ribonucleic acid , RNA) memiliki peran sebagai senyawa yang merupakan bahan genetik dan memainkan peran utama dalam ekspresi genetik. Dalam dogma genetika molekular, RNA menjadi perantara antara informasi yang dibawa DNA dan ekspresi fenotipik yang diwujudkan dalam bentuk protein.

Tugas utama dari RNA adalah untuk mentransfer kode genetik guna pembentukan protein dari inti ke ribosom. Proses ini mencegah DNA harus meninggalkan inti. Hal ini membuat DNA dan kode genetik yang dilindungi terhindar dari kerusakan. Tanpa RNA, protein dapat tidak pernah dibuat. Pengaturan kodon pada RNA juga akan mempengaruhi protein yang disintesis.

Tugas lain dari RNA adalah sebagai katalisator. Pada tahun 1967, Carl Woese, Francis Crick dan Leslie Orgel adalah yang pertama untuk menyarankan bahwa RNA dapat bertindak sebagai katalis. Ide ini didasarkan pada penemuan bahwa RNA dapat membentuk struktur sekunder yang kompleks. Ribozyme adalah molekul RNA yang mengkatalis suatu reaksi kimia. Selama proses sintesis protein dalam ribosom, rRNA-lah yang bertugas sebagai ribozyme. rRNA akan bertugas sebagai katalisator dalam proses pembuatan ikatan peptida.

III.1 RNA Du ta ( 

Messenger 

 RNA)

RNA duta adalah sebuah molekul RNA tunggal yang panjang, yang melengkapi salah satu untaian DNA dari gen. mRNA adalah versi RNA dari gen yang meninggalkan inti sel dan bergerak ke sitoplasma dimana protein dibuat. Selama sintesis protein, organel yang disebut ribosom bergerak sepanjang mRNA, membaca urutan basisnya, dan menggunakan kode genetik untuk menerjemahkan setiap triplet, atau kodon, menjadi asam amino yang sesuai.

III.2 Trans fer RNA

RNA transfer merupakan pembawa asam amino spesifik. RNA transfer adalah molekul yang menginterpretasikan pesan genetik berupa serangkaian kodon di sepanjang molekul mRNA

dengan cara mentransfer asam-asam amino ke ribosom dalam proses translasi. RNA transfer memiliki antikodon triplet yang komplemen dengan kodon yang terdapat pada mRNA. Dengan adanya komplementasi antara kodon dengan antikodon, maka urutan asam amino akan didikte oleh urutan kodon mRNA.

III.3 Ribos om al RNA

RNA Ribosom adalah molekul utama penyusun ribosom. RNA ini berupa pita tunggal, tidak bercabang, dan fleksibel. rRNA dan protein secara bersama membangun subunit-subunit ribosom yang terdiri dari subunit kecil dan subunit besar untuk kemudian bergabung membentuk ribosom fungsional ketika dua subunit terikat pada mRNA saat translasi. rRNA berfungsi sebagai tempat translasi kode genetik karena seperti yang telah disebutkan bahwa rRNA adalah komponen utama penyusun organel ribosom.

III.4 Mik ro RNA

miRNA dibentuk dari sebuah RNA  precursor   yang membentuk satu atau lebih struktur hairpin double-stranded, dimana keduanya diikat oleh ikatan hidrogen. Setelah dipotong-potong, maka salah satunya disebut sebagai miRNA. miRNA akan membentuk molekul kompleks dengan satu atau lebih protein dan selanjutnya akan mendegradasi mRNA yang menjadi target atau menghentikan translasinya.

Gambar di bawah menjelaskan mekanisme dari miRNA dalam mendegradasi mRNA yang menjadi target. Jika mRNA dengan miRNA komplementer sepanjang untaian mRNA, maka mRNA nantinya akan terdegradasi. Sedangkan bila mRNA dengan miRNA tidak komplementer, maka translasi mRNA akan dihentikan.

III.4

Interference

 RNA

Suatu gejala yang baru ditemukan pada penghujung abad ke-20 adalah adanya mekanisme peredaman (silencing ) dalam ekspresi genetik. Kode genetik yang dibawa RNA tidak diterjemahkan (translasi) menjadi protein oleh tRNA. Ini terjadi karena sebelum sempat ditranslasi, mRNA dicerna/dihancurkan oleh suatu mekanisme yang disebut sebagai “RNAi”. RNA Interferen (RNAi) adalah teknologi yang relatif baru yang merevolusi cara para peneliti mempelajari ekspresi gen dari mamalia. RNAi telah memiliki dampak yang signifikan terhadap kemudahan, kecepatan, dan spesifisitas dengan analisis penghambat fungsi gen dalam model sel mamalia dan hewan. Hal ini bermula saat RNA untai ganda ditemukan ( double strand RNA) yang ternyata menunjukkan kemampuan menghambat ekspresi gen. Prinsip dasar dari RNA Interferen adalah masuknya dsRNA ke dalam sitoplasma yang akhirnya membungkam ekspresi gen ditingkat antara transkripsi dan translasi protein.

Gambar 2

. Mekanisme Kerja RNA Interferen Mekanisme kerja RNA Interferen adalah sebagai berikut :

 Untaian panjang dsRNA dipotong oleh enzim RNA-se III melalui mekanisme dicer  menjadi

fragmen-fragmen yang lebih kecil, disebut juga small interfering   RNA (siRNA) yang selanjutnya akan memicu terjadinya RNAi pada sel target

 Beberapa fragmen siRNA akan berikatan dengan protein kompleks RISC (RNA-induced

silencing complex ) yang akan memandu mengenal mRNA yang berisi sekuen homolog yang dimana kedua sekuen ini akan berkomplemen. Setelah berkomplemen maka enzim nuklease yang ada pada komplek RISC akan mendegradasi mRNA

 Setelah mRNA terdegradasi maka ekspresi gen yang tidak diinginkan secara spesifik

Referensi

Bryce,C.F.A. dan Pacini, D. (1998) The Structure and Function of Nucleic Acids. UK : Hoolbrooks Printers Ltd.

Duchaine,T.F. dan Slack F.J. (2009) „RNA Interference and Micro-RNA –Oriented Therapy in Cancer: Rationales, Promises, and Challenges‟ Current Oncology , 16 (4): 61 –66. Enger, E., Ross, F., dan Bailey, D. (2005) Concepts in Biology . New York: McGraw-Hill.

Sintetis Asam Nukleat

Oleh Indra Saputra / Teknik Kimia / 1206242132

Abstrak

 Asam Nukleat merupakan salah satu bentuk makromolekul polimerik protein yang sering ditemukan di dalam sel makhluk hidup. Bentuk asam nukleat yang sering kita temukan dalam kehidupan sehari-hari ialah DNA (Deoxyribo Nucleic Acid) dan juga RNS (Ribo Nucleic Acid).  Asam nukleat terdiri dari monomer-monomer yang sering disebut nukleotida yang terdiri dari

pentose, grup basa nitrogen dan grup fosfat. Di dalam tubuh makhluk hidup, asam-asam nukleat akan saling berikatan dan bersintesis membentuk deret asam nukleat yang berguna untuk memberi dan mentransfer kode genetik serta mengekspresikan informasi genetik suatu makhluk hidup.

Kata kunci : leading strand , lagging strand , transkripsi, translasi, excision repair 

I. Replikasi DNA

Replikasi DNA ialah suatu proses untuk menciptakan dua replika identik dari satu molekul DNA. Biasanya Replikasi DNA terjadi sebelum pembelahan sel pada makhluk hidup. Terdapat beberapa perbedaan antara proses replikasi DNA pada sel eukaruiotik dan prokariotik. Pada sel-sel prokariotik, replikasi DNA dapat terjadi terus menerus sedangkan pada sel-sel eukariotik, replikasi DNA terjadi secara teratur melalui fase-fase tertentu. Enzim yang terlibat pada Replikasi DNA ialah

 DNA polymerase   berfungsi mengkatalisasi reaksi polimerisasi deoksiribonukleotida

menjadi rantai DNA, dengan kata lain enzim ini mengkatalisasi reaksi pembentukan DNA.

 Enzim Helikase  berfingsi memutuskan ikatan-ikatan hydrogen (double helix) pada Garpu

Replikasi

 Enzim Ligase  berfungsi menghubungkan / melekatkan fragment-fragment okazaki

 Enzim topoisomerase  berfungsi untuk membantu helikase untuk memotong untaian DNA

dengan mengurangi tegangan untaian DNA.

 Enzim Primerase  Enzim yang memungkinkan akses pembentukan RNA primer.

Pada umumnya,replikasi DNA dimulai oleh suatu RNA primer yang selanjutnya akan diperpanjang oleh DNA polimerase untuk membentuk leading  dan lagging strand .

Proses replikasi DNA merupakan suatu masalah yang kompleks, dan melibatkan set protein dan enzim yang secara kolektif merakit nukleotida dalam urutan yang telah ditentukan. Dalam menanggapi isyarat molekul yang diterima selama pembelahan sel, molekul-molekul ini melakukan replikasi DNA dan mensintesis dua untai baru menggunakan helai yang ada sebagai template atau „cetakan‟. Masing-masing dua resultan, molekul DNA yang identik terdiri dari satu untai baru lama dan salah satu DNA. Oleh karena itu, proses replikasi DNA disebut sebagai semi-konservatif.

Rangkaian peristiwa yang terjadi selama replikasi DNA prokariotik telah dijelaskan di bawah ini. Proses Replikasi DNA terdiri dari :



Inisiasi

Replikasi DNA dimulai pada lokasi spesifik disebut inisiator DnaA. Inisiator DnaA mengikat molekul DNA di tempat asal, untuk docking   protein lain dan enzim penting untuk replikasi DNA. Sebuah enzim yang disebut Helikase direkrut ke lokasi untuk unwinding   (proses penguraian) heliks dalam alur tunggal.

Helikase melepaskan ikatan hidrogen antara pasangan basa yang tergantung energi. Titik ini merupakan wilayah DNA yang sekarang dikenal sebagai garpu replikasi (garpu replikasi atau cabang replikasi adalah struktur yang terbentuk ketika DNA bereplikasi). Setelah heliks terurai, protein yang disebut SSB mengikat daerah unwound , dan mencegah mereka untuk melakukan proses annealing  (penempelan). Proses replikasi pada garpu replikasi dilanjutkan dalam dua arah yang berlawanan sepanjang molekul DNA.

Gambar 1.

Tahap Inisiasi

Sumber : http://www.sridianti.com/tahap-proses-replikasi-dna-7-langkah.html Pelepasan Untai DNA



Sintesis Primer 

Sintesis baru, untai komplementer DNA menggunakan untai yang ada sebagai template, yang dibawa oleh enzim yang dikenal sebagai DNA polimerase. Selain replikasi, DNA polimerase berfungsi untuk perbaikan DNA dan rekombinasi. Namun, DNA polimerase tidak dapat memulai sintesis DNA secara independen dan membutuhkan 3′ gugus hidroksil untuk memulai penambahan nukleotida komplementer. Ini disediakan oleh enzim yang disebut DNA primase yang merupakan jenis DNA dependent -RNA polimerase. DNA primase mensintesis bentangan pendek RNA ke untai DNA yang ada. Segmen pendek ini disebut primer, dan terdiri dari 9-12 nukleotida. Hal ini memberikan DNA polimerase  platform  yang diperlukan untuk mulai menyalin sebuah untai DNA. Setelah primer terbentuk pada kedua untai, DNA polimerase dapat memperpanjang primer ini menjadi untai DNA baru.

Unwinding   DNA dapat menyebabkan supercoiling 

(

bentukan seperti spiral yang mengganggu

)

  di wilayah garpu. Superkoil DNA unwinding   oleh enzim khusus yang disebut topoisomerase yang mengikat ke bentangan DNA depan garpu replikasi. Ini menciptakan nick  di untai DNA untuk meringankan supercoil  tersebut.

Gambar 2

. Sintesis Primer

Sumber : http://www.sridianti.com/tahap-proses-replikasi-dna-7-langkah.html Sintesis DNA Primer



Sintesis

Leading Strand 

DNA polimerase dapat menambahkan nukleotida baru hanya untuk ujung 3 „ dari untai yang ada, dan karenanya dapat mensintesis DNA dalam arah 5′ → 3 „saja.  Akan tetapi, untai DNA berjalan di arah yang berlawanan, dan karenanya sintesis DNA pada satu untai dapat terjadi terus menerus. Hal ini dikenal sebagai untaian pengawal (leading strand ). Di sini, DNA polimerase III (DNA pol III) mengenali 3 „OH akhir primer RNA, dan menambahkan nukleotida komplementer baru. Seperti garpu replikasi berlangsung, nukleotida baru ditambahkan secara terus menerus, sehingga menghasilkan untai baru.

Gambar 3.

Sintesis Leading Strand

Sumber : http://www.sridianti.com/tahap-proses-replikasi-dna-7-langkah.html Replikasi DNA untaian pengawal (leading strand)



Sintesis

Lagging Strand 

 (Untai Tertinggal)

Pada untai berlawanan, DNA disintesis secara terputus dengan menghasilkan serangkaian fragmen kecil dari DNA baru dalam arah 5 „→ 3′. Fragmen ini disebut fragmen Okazaki, yang kemudian bergabung untuk membentuk sebuah rantai terus menerus nukleotida. Untai ini dikenal sebagai lagging strand   (untai tertinggal) sejak proses sintesis DNA pada untai ini hasil pada tingkat yang lebih rendah.

Di sini, primase menambahkan primer di beberapa tempat sepanjang untai unwound . DNA pol III memperpanjang primer dengan menambahkan nukleotida baru, dan jatuh ketika bertemu fragmen yang terbentuk sebelumnya. Dengan demikian, diperlukan untuk pelepasan untai DNA, lalu penggeseran lebih lanjut up-stream untuk memulai perluasan primer RNA lain. Sebuah penjepit geser memegang DNA di tempatnya ketika bergerak melalui proses replikasi.

Gambar 4.

Sintesis Lagging Strand

Sumber : http://www.sridianti.com/tahap-proses-replikasi-dna-7-langkah.html Sintesis lagging Strand



Penghapusan Primer 

Meskipun untai DNA baru telah disintesis primer RNA hadir pada untai baru terbentuk harus digantikan oleh DNA. Kegiatan ini dilakukan oleh enzim DNA polimerase I (DNA pol I). Ini khusus menghilangkan primer RNA melalui ‟5→ 3′ aktivitas eksonuklease nya, dan menggantikan mereka dengan deoksiribonukleotida baru oleh 5 „→ 3′ aktivitas polimerase DNA.

Gambar 5.

Penghapusan Primer

Sumber : http://www.sridianti.com/tahap-proses-replikasi-dna-7-langkah.html Menghilangkan primer RNA



Ligasi

Setelah penghapusan primer selesai untai tertinggal masih mengandung celah atau nick   antara fragmen Okazaki berdekatan. Enzim ligase mengidentifikasi dan menyegel nick  tersebut dengan menciptakan ikatan fosfodiester antara 5 „fosfat dan 3′ gugus hidroksil fragmen yang berdekatan.

Gambar 6.

Ligasi

Sumber : http://www.sridianti.com/tahap-proses-replikasi-dna-7-langkah.html Ligasi



Pemutusan

Replikasi DNA diberhentikan di lokasi terminasi khusus yang terdiri dari urutan nukleotida yang unik. Urutan ini diidentifikasi oleh protein khusus yang disebut tus  yang mengikat ke situs tersebut, sehingga secara fisik menghalangi jalur helikase. Ketika helikase bertemu protein tus,  helikase itu jatuh bersama dengan untai tunggal protein pengikat terdekat.

Gambar 7.

Pemutusan

Sumber  http://www.nature.com/scitable/content/dna-replication-of-the-leading-and-lagging-14668888 

Perbedaan Prokariotik dan Eukariotik

Eukariotik

Prokariotik

- Memiliki membran inti - Tidak memiliki membran inti

- Lebih kompleks - Lebih sederhana

- DNA linear - DNA sirkular

- DNA memiliki histon - DNA tidak memiliki histon - Jumlah gen banyak - Jumlah gen sedikit

- Ribosom terdiri dari 5 jenis rRNA - Ribosom terdiri dari 3 jenis rRNA

- Ribosom memiliki sekitar 20 jenis protein - Ribosom memiliki sekitar 10 jenis protein - Ukuran sel lebih besar - Ukuran sel lebih kecil

- Sintesis protein terjadi dalam inti sel dan sitoplasma

- Sintesis protein hanya terjadi dalam sitoplasma

- Organel sel lebih banyak - Organel sel lebih sedikit

II. Reparasi dan Rekombinasi DNA

Kesalahan pemasangan awal antara nukleotida yang baru masuk dan nukleotida yang sudah ada di untai cetakan 100.000 kali lebih umum terjadi suatu tingkat kesalahan sebesar 1 dalam 10.000 pasangan basa. Salah satu mekanisme perbaikan DNA, perbaikan salah pasang (mismatch repair ), memperbaiki kesalahan-kesalahan yang terjadi ketika DNA disalin. Selama replikasi DNA, DNA polimerase sendirilah yang melakukan perbaikan salah pasang. Polimerase ini mengoreksi setiap nukleotida terhadap cetakannya begitu nukleotida ditambahkan pada untaian.

Selain perbaikan kasalahan replikasi, pemeliharaan informasi genetik yang dikode dalam DNA  juga menuntut perbaikan kerusakan pada DNA yang ada. Molekul-molekul DNA selalu terancam oleh agen fisis dan kimiawi yang bisa melukai. Zat-zat kimia reaktif, emisi radioaktif, sinar X, dan cahaya ultraviolet dapat mengubah nukleotida dengan cara yang dapat berpengaruh pada informasi genetik yang terkode, umumnya berpengaruh buruk.

Seperti halnya perbaikan salah pasang, kebanyakan mekanisme perbaikan DNA rusak memanfaatkan struktur pasangan basa yang dimiliki DNA. Biasanya, satu segmen dari untai yang mengandung kerusakan dipotong habis dan dibuang (dieksisi, excised ) oleh suatu enzim pemotong DNA yaitu nuklease. Celah yang terbentuk diisi dengan nukleotida-nukleotida yang pasangannya sesuai dengan nukleotida yang terdapat dalam untai yang tidak rusak. Enzim yang terlibat dalam pengisian celah ini adalah DNA polimerase dan DNA ligase. Perbaikan DNA tipe ini disebut perbaikan eksisi (excision repair ).

III. Transkripsi

Transkripsi adalah pembuatan RNA dengan menyalin sebagian berkas DNA. Transkripsi adalah bagian dari rangkaian ekspresi genetik.  Transkripsi berlangsung di dalam inti sel atau di dalam matriks mitokondria dan plastida. Transkripsi dapat dipicu oleh rangsangan dari luar maupun tanpa rangsangan. Pada proses tanpa rangsangan, transkripsi berlangsung terus-menerus (gen-gennya disebut gen konstitutif atau "gen pengurus rumah", house-keeping genes). Sementara itu, gen yang memerlukan rangsangan biasanya gen yang hanya diproduksi sewaktu-waktu; gennya disebut gen regulatorik karena biasanya mengatur mekanisme khusus. Rangsangan akan mengaktifkan bagian promoter inti, segmen gen yang berfungsi sebagai pencerap RNA polimerase yang terletak di bagian hulu bagian yang akan disalin (disebut transcription unit ), tidak jauh dari ujung 5' gen. Promoter inti terdiri dari kotak TATA, kotak CCAAT dan kotak GC.

Hasil transkripsi adalah berkas RNA yang masih "mentah" yang disebut mRNA primer. Di dalamnya terdapat fragmen berkas untuk protein yang mengatur dan membantu sintesis protein (translasi) selain fragmen untuk dilanjutkan dalam translasi sendiri, ditambah dengan bagian yang nantinya akan dipotong (intron). Berkas RNA ini selanjutnya akan mengalami proses yang disebut sebagai proses pascatranskripsi ( post-transcriptional process).

o

Inisiasi

Tahapan proses inisiasi transkripsi meliputi 4 langkah yaitu: (1) pembentukan kompleks promoter tertutup

(2) pembentukan kompleks promoter terbuka

(3) penggabungan beberapa nukleotida awal (sekiatar 10 nukleotida)

(4) perubahan konfirmasi RNA polimerase karena subunit σ dilepaskan dari kompleks holoenzim.

Subunit σ tersebut selanjutnya dapat digunakan lagi dalam proses inisiasi transkripsi selanjutnya. Bagian DNA yang terbuka setelah RNA polimerase menempel biasanya terjadi pada daerah sekitar -9 sampai +3 sehingga menjadi struktur untai tunggal. Bagian DNA yang berkaitan dengan RNA polimerase membentuk suatu struktur gelembung transkripsi (transcription bubble) sepanjang kurang lebih 17 pasang basa. Setelah struktur promoter terbuka secara stabil, maka selanjutnya RNA polimerase melakukan proses inisiasi transkripsi dengan menggunakan urutan DNA cetakan sebagai panduannya. Dalam proses transkripsi, nukleotida RNA digabungkan sehingga membentuk transkrip RNA. Nukleotida pertama yang digabungkan hampir selalu berupa molekul purin. Kajian pada 88 promoter menunjukkan bahwa 51% molekul RNA diawali dengan basa A, 42% diawali dengan G, 5% diawali dengan C, dan 2% diawali dengan U. pada awalnya basa-basa RNA yang digabungkan membentuk ikatan hidrogen dengan basa DNA cetakan, sehingga jika urutan DNA cetakan adalah ATG, maka basa RNA yang digabungkan adalah UAC.

Subunit σ mempunyai peranan dalam menstimulasi inisiasi transkripsi tetapi tidak mempercepat laju pertambahan untaian RNA. Proses inisiasi transkripsi merupakan proses yang menentukan laju transkrpisi. Inisiasi transkripsi dapat dihambat oleh pemberian antibiotik rifampisin, tetapi antibiotik ini tidak menghambat proses pemajangan transkrip. Penelitian yang dilakukan oleh Alfred Heil dan Walter Zilig pada tahun 1970 membuktikan bahwa subunit RNA polimerase yang menentukan kepekaan atau ketahanan terhadap antibiotik rifampisin adalah subunit β.

Setelah proses inisiasi transkripsi terjadi, selanjutnya subunit σ terlepas dari  enzim inti dan dapat digunakan oleh enzim inti RNA polimerase yang lain.siklus subunit σ tersebut pertama kali diungkapkan oleh Travers dan Burgess pada tahun 1969. Mereka menunjukan bahwa jika transkripsi berlangsung pada kekuatan ionic yang rendah, maka RNA polimerase inti tidak terlepas dari DNA cetakan pada ujung suatu gen. Hal ini menyebabkan inisiasi transkrisi berhenti. Jika ke dalam sistem tersebut dimasukkan RNA polimerase inti yang baru maka, transkripsi kemudian berjalan kembali. Keadaan ini menunjukkan bahwa RNA polimerase inti yang baru tersebut kemudian bergabung dengan subunit σ yang sebelumnya telah dilepaskan dari enzim RNA polimerase inti lainnya.

o

Elongasi

Pada bagian gelembung transkripsi, basa-basa molekul RNA membentuk hibrid dengan DNA cetakan sepanjang kurang lebih 12 nukleotida. Hibrid RNA-DNA ini bersifat sementara sebab setelah RNA polimerasenya berjalan, maka hibrid tersebut akan terlepas dan bagian DNA yang terbuka tersebut akhirnya akan menutup lagi. RNA polimerase akan berjalan

membaca DNA cetakan untuk melakukan proses pemanjangan ( elongation) untaian RNA. Laju pemanjangan maksimum molekul transkrip RNA sekitar anatara 30 samapai 60 nukleotida perdetik, meskipun laju rata-ratanya dapat lebih rendah dari nilai ini. Secara umum, berdasarkan atas nilai laju semacam ini, suatu gen yang mengkode protein akan disalin menjadi RNA dalam waktu sekitar satu menit. Meskipun demikian, laju pemanjangan transkrip dapat menjadi sangat rendah (sekitar 0,1 nekleotida perdetik) jika RNA polimerase melewati sisi jeda (pause site) yang biasanya mengandung banyak basa GC. Proses pemanjangan transkrip dapat dihambat oleh antibiotik streptoligin. Kepekaan atau ketahanan terhadap streptoligin juga ditentukan oleh subunit β pada RNA polimerase.

Dalam pemanjangan transkrip, nukleotida ditambahkan secara kovalen pada ujung 3‟ molekul RNA yang baru terbentuk. Nukleotida RNA yang ditambah tersebut bersifat komplementer dengan nukleotida pada untaian DNA cetakan. Sebagai contoh, jika nukleotida pada DNA cetakan adalah A, maka nukleotida RNA yang ditambahkan adalah U.

Dalam proses pemanjangan transkrip ada dua hipotesis yang diajukan mengenai perubahan topologi DNA. Hipotesis pertama menyatakan bahwa enzim RNA polimerase bergerak melingkari untaian DNA sepanjang perjalananya. Dengan cara demikian maka dapat dihindari terjadinya pelintiran pada stuktur DNA, tetapi untaian RNA hasil transkripnya akan melintir sepanjang untaian DNA. Sebaliknya, hipotesis kedua menyatakan bahwa enzim RNA polimerase bergerak lurus sepanjang untaian DNA sehingga RNA yang terbentuk tidak mengalami pelintiran, tetapi untaian DNA yang ditranskripsi harus mengalami puntiran. Untaian DNA yang ada di depan RNA polymerase akan membuka sedangkan DNA yang berada di belakangnya akan memutir kembali untuk menutup.

Dalam proses pemanjangan transkrip RNA, demikian juga pada proses inisiasi sintesis RNA, terjadi pembentukan ikatan fosfodiester antara nukleotida RNA yang satu dengan nukleotida berikutnya. Pembentukan ikatan fosfodiester tersebut ditentukan oleh keberadaan subunit β pada RNA polimerase. Transkripsi akan berakir pada saat RNA polimerase mencapai ujung gen yang disebut terminator. Pada bakteri E. coli ada dua macam terminator yaitu: (1) terminator yang tidak tergantung pada protein rho (rho-dependent terminator), dan (2) terminator yang tergantung pada protein rho( rho-independent terminator ).

o

Terminasi

Pengakhiran Transkripsi yang Tidak Tidak Tergantung pada Faktor Rho

Pengakhiran terminasi yang tidak tergantung pada rho dilakukan tanpa harus melibatkan suatu protein khusus, melainkan ditentukan oleh adanya suatu urutan nukleotida tertentu pada bagian terminator. Sinyal yang akan mengakhiri transkripsi dengan mekanisme semacam ini ditentukan oleh daerah yang mengandung banyak urutan GC yang dapat membentuk struktur batang dan lengkung (stem-and-loop) pada RNA dengan panjang sekitar 20 basa di sebelah hulu dari ujung 3‟ –OH dan diikuti oleh rangkaian 4-8 residu uridin berurutan. Struktur batang lengkung tersebut menyebabkan RNA polimerase berhenti dan merusak bagian 5‟ dari hibrid RNA-DNA. Bagian sisa hibrid RNA-DNA tersebut berupa urutan oligo (rU) yang tidak cukup stabil berpasangan dengan dA. Akibatnya ujung 3 ‟ hibrid tersebut akan terlepas sehingga transkripsi berakhir. Eksperimen yang dilakukan oleh Peggy Farnham dan Terry Platt menunjukkan bahwa pengakhiran transkripsi tanpa melibatkan faktor rho mempunyai 2 ciri utama, yaitu, (1) adanya rangkaian basa berulang-balik ( inverted repeat ) yang dapat membentuk lengkungan, dan (2) adanya rangkaian basa T pada untaian DNA bukan cetakan (nontemplate strand ) sehingga membentuk pasangan basa yang lemah antara rU-dA yang menahan transkrip RNA pada untaian DNA cetakan. Pada waktu lengkungan RNA terbentuk, maka RNA polimerase berhenti dan ikatan basa yang lemah menyebabkan RNA yang baru terbentuk akan lepas.

Pengakhiran Transkripsi yang Tergantung pada Faktor Rho

Mekanisme pengakhiran transkripsi semacam ini memerlukan protein ρ (rho). Pengakhiran transkripsi yang memerlukan faktor rho hanya terjadi pada daerah jeda yang terletak pada jarak tertentu dari promoter. Dengan demikian jika ada daerah jeda yang t erletak di dekat promoter, maka daerah itu tidak dapat berfungsi sebagai daerah pengakhiran transkripsi. Terminator yang tergantung pada rho terdiri atas suatu urutan berulang-balik yang dapat membentuk lengkungan (loop), tetapi tidak ada rangkaian basa T seperti pada daerah terminator yang tidak melibatkan faktor rho. Faktor rho diduga ikut terikat pada transkip dan mengikuti pergerakan RNA polimerase sampai akhirnya RNA polimerase berhenti pada

daerah terminator yaitu sesaat setelah menyintesis lengkungan RNA. Selanjutnya, faktor rho menyebabkan destabilitasasi ikatan RNA-DNA sehingga transkrip RNA terlepas dari DNA cetakan

Eukariotik vs Prokariotik

Pada prokariotik, translasi dilakukan sebelum proses transkripsi selesai karena tidak terdapat membran inti sel. Dengan kata lain tidak ada yang memisahkan antara transkripsi dan translasi sehingga translasi dapat segera dilakukan

Mekanisme transkripsi secara umum pada organisme eukariotik serupa dengan mekanisme transkripsi pada organisme prokariotik, yaitu melalui tahapan inisiasi, elongasi dan terminasi. Perbedaan antara transkripsi pada eukariotik dengan prokariotik adalah RNA  polimerase tidak melekat pada DNA selama proses inisiasi.

Inisiasi transkripsi pada eukariot diperantarai oleh faktor-faktor transkripsi yang bersifat spesifik untuk tiap macam RNA polimerase. Segera setelah inisiasi, RNA polimerase langsung berikatan pada DNA. Ketiga macam RNA polimerase pada eukariot membutuhkan prakondisi yang berbeda untuk terlibat dalam transkripsi (Russel, 1992 dalam Corebima, 2002). Tiga macam RNA polimerase mengenali urutan promoter yang berbeda; dan membutuhkan perangkat protein yang berbeda (disebut “faktor transkripsi” atau “ transcription factor ”). Berikut penjelasan dari ketiga RNA polimerase yang bekerja pada eukariot.

o

RNA Polimerase I

Dalam Gardner (1991), dijelaskan bahwa RNA polimerase I terletak pada nukleolus dan mengkatalis pembentukan rRNA

o

RNA Polimerase II

Masih dalam Gardner dkk (1991), dijelaskan bahwa RNA polimerase II mentranskripsikan sebagian besar gen-gen struktural inti. RNA polimerase II ini bertanggungjawab pada pembentukan pra-mRNA.

o

RNA Polimerase III

RNA polmerase III, sebagaimana RNA polimerase II, tidak berada di nukleolus, melainkan di nukleoplasma. RNA polimerase III ini mentranskripsikan gen-gen untuk inti kecil RNAs dan tRNAs. Tempat pelekatannya berada di antara gen-gen tersebut (Gardner dkk, 1991). Sedikit telah disinggung di atas bahwa pada eukariot transkripsi terjadi tidak bersamaan dengan translasi. Dengan adanya membran inti pada eukariot, dapat dibedakan tempat terjadinya transkripsi dan translasi. Transkripsi terjadi di dalam inti sedangkan translasi terjadi di sitoplasma. Waktu untuk masing  – masing proses pun tidak dapat terjadi secara bersamaan, sebab sebelum dapat melakukan translasi, proses transkripsi harus dirampungkan terlebih dahulu. Proses transkripsi dan translasi pada eukariot pun lebih kompleks daripada prokariot.

Referensi

Campbell, N. A., Reece, J. B., dan Mitchell. L. G.( 2002) Biologi . Jilid 1 Edisi Kelima. Jakarta: Erlangga.

Corebima, A. D.( 2002) Genetika Kerja Gen I Diktat Kuliah Jurusan Biologi Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Malang: Universitas Negeri Malang.

Damayanti, E. (2011) Replikasi DNA dan Abnormalitasnya pada Pertumbuhan Sel Tumor . Tersedia pada : http://www.academia.edu/5085250/makalah._Replikasi_DNA (diakses Selasa, 18 Februari 2014).

Gardner, E.J., Simmons, M.J. dan Snustad, D.P.(1991) Principles of Genetics. 8th edition. New York: John Wiley & Sons.

Lodish,H. dkk. (2004) Molecular Cell Biology.5th edition. NJ : WHFreeman. Sridianti (2013) Tahap Proses Replikasi DNA 7 Langkah. Tersedia pada :

http://www.sridianti.com/tahap-proses-replikasi-dna-7-langkah.html  (diakses Selasa,18 Februari 2014).

Analisis Kualitatif dan Kuantitatif Asam Nukleat

Oleh Angela Susanti / 1206247303

Abstrak

 Asam nukleat merupakan molekul yang sangat penting bagi makhluk hidup. Molekul ini dapat dianalisis secara kuantitatif dan kualitatif. Beberapa aspek yang dapat dianalisis secara kualitatif antara lain : urutan basa nitrogen ( Sequencing ), ukuran molekul asam nukleat (Elektroforesis Gel  Agarosa), keberadaan asam nukleat dalam sebuah sampel (Staining ), dan kandungan basa nitrogen dalam sampel (Hybridization). Selain aspek kualitatif, aspek kuantitatif yang dapat dianalisis adalah kemurnian dan konsentrasi sampel asam nukleat (Spektrofotometri Visible dan UV-Vis). Untuk menunjang proses analisis masing  –  masing aspek tersebut, dapat diterapkan metode RT-PCR yang bertujuan untuk memperbanyak (multiplikasi) sampel.

Kata kunci : sequencing , elektroforesis gel agarosa, staining , hybridization, spektrofotometri visible, spektrofotometri UV-vis, RT-PCR

I. Pendahuluan

 Asam nukleat, baik DNA maupun RNA, merupakan bentuk molekul yang sangat fundamental bagi berbagai makhluk hidup. DNA maupun RNA dapat dianalisis dengan dua metode yang berbeda, yaitu secara kualitatif maupun secara kuantitatif. Beberapa contoh aspek kualitatif dari asam nukleat yang dapat dianalisis adalah keberadaan DNA maupun RNA dalam suatu sampel, urutan DNA (DNA Sequences), kandungan basa nitrogen atau basa nukleotida, ukuran DNA, maupun adanya mutasi. Berbeda dengan metode analisis kualitatif, aspek kuantitatif yang dapat dianalisis antara lain berupa konsentrasi dan kemurnian DNA atau RNA dalam sampel. Pembahasan berikut akan mencakup kedua aspek analisis, yaitu aspek kualitatif dan kuantitatif.

II. Analisis Kualitatif

Sequencing 

DNA Sequencing   merupakan sebuah proses penentuan urutan nukleotida dalam sebuah molekul DNA secara tepat. Salah satu aplikasi yang paling signifikan dari teknologi ini adalah dapat ditentukannya urutan keseluruhan genom dari ragi ( Saccharomyces cervisiae), cacing nematoda (Caenorhabditis elegans), Drosophila melanogaster , dan genom manusia. Seluruh urutan (sequence) genom memfasilitasi adanya penelitian terhadap pola ekspresi gen dan membantu adanya pemahaman terhadap evolusi dan penyebab suatu penyakit.

Pada akhir tahun 1970, dua metode sequencing DNA untuk molekul DNA dengan ukuran yang lebih panjang dikembangkan. Metode  – metode tersebut antara lain adalah :

  Metode

Sanger 

(dideoxy )

Untuk menenetukan urutan pada suatu daerah DNA, metode sequencing Sanger terdiri dari beberapa tahap berikut (seperti yang diilustrasikan pada Gambar 1).

Pertama, DNA beruntai dua yang akan diurutkan diambil. DNA ini akan bertindak sebagai DNA template  atau rantai awal. DNA template  kemudian dilekatkan dengan sebuah primer. Primer merupakan sebuah rantai yang memiliki panjang sekitar 12  – 24 basa yang komplementer dengan ujung 3‟ dari salah satu untai template DNA. Istilah primer didasarkan pada sifatnya yang akan memulai reaksi enzimatik. DNA template kemudian akan mengalami proses denaturasi oleh panas atau alkali ketika primer menempel pada template.

Ukuran primer yang tepat dalam proses ini harus ditentukan; primer yang terlalu pendek memiliki kemungkinan untuk menemukan rangkaian komplementernya pada banyak tempat sehingga dapat menempel (annealing   : proses penggabungan sehingga terbentuk kembali DNA untai ganda / double stranded ) dengan mudah, sedangkan primer yang terlalu panjang akan mengakibatkan proses penggabungan yang tidak stabil. Primer disintesis secara kimiawi dan proses annealing-nya dipengaruhi oleh pembentukan ikatan hidrogen antara primer dan untai DNA komplementer. Primer yang digunakan telah di-radiolabeled  (penandaan / pemberian label dengan radioaktif) pada ujung 5‟ dengan 32 P-fosfat. Pemberian label pada ujung rantai dilakukan oleh enzim polinukleotida kinase dan adenosine trifosfat (ATP) yang memiliki gamma-fosfat yang berlabel 32P. Ketika primer bergabung dengan DNA template, setiap produk yang terbentuk selama proses ekstensi oleh DNA polimerase akan memiliki label 32P pada ujung 5‟.

Larutan yang terbentuk kemudian dibagi ke dalam empat tabung berbeda yang diberi label G, A, T, dan C  yang mengandung reagen – reagen berikut :

 G : keempat dNTP, ddGTP, dan DNA polimerase  A : keempat dNTP, ddATP, dan DNA polimerase  C : keempat dNTP, ddCTP, dan DNA polimerase  T : keempat dNTP, ddTTP, dan DNA polimerase

DNA polimerase dalam keempat tabung akan memperpanjang salinan komplementer dari DNA template untai tunggal. dNTP ditambahkan secara berturut  –  turut pada rantai primer yang terus berkembang, dan basa yang komplementer dengan basa yang terdapat pada untai DNA pun dipilih. Ikatan fosfodiester akan terbentuk antara gugus 3‟ -hidroksil pada ujung primer yang berkembang dan gugus 5‟ -fosfat dari dNTP yang masuk.

Ketika ddNTP ditambahkan, ikatan fosfodiester tidak dapat terbentuk sehingga rantai akan terputus. ddNTP yang ditambahkan tidak mengandung gugus OH pada posisi 3‟ dari deoksiribosanya. Pada posisi tersebut hanya terdapat sebuah atom H. Ketidakhadiran gugus hidroksil tidak mengizinkan nukleotida berikutnya untuk bergabung karena 5‟ -fosfat dari nukleotida berikutnya tidak dapat membentuk ikatan dengan 3‟ -H.

Dalam metode ini, keempat reaksi dimulai dari nukleotida yang sama tetapi berakhir pada basa yang spesifik, yang berbeda untuk masing – masing tabung. Dalam larutan yang mengandung reaktan, DNA dengan rantai yang sama akan disintesis berulang kali. Akan tetapi, segera setelah ddNTP ditambahkan, rantai yang baru disintesis akan segera terpotong. Karena ddNTP ditambahkan secara acak (tidak teratur), sintesis akan terpotong pada berbagai posisi yang berbeda untuk masing  –  masing tabung reaksi. Masing  – masing ddNTP digunakan pada konsentrasi sekitar 1% dari konsentrasi dNTP. DNA polimerase akan mengintegrasikan dNTP atau ddNTP secara acak.

Setelah reaksi selesai berlangsung, produk (fragmen DNA yang baru disintesis dan diberi label) akan mengalami denaturasi oleh panas menjadi molekul DNA tunggal dan akan melalui proses elektroforesis. Proses elektroforesis dilaksanakan dalam tegangan tinggi dengan elektroda positif pada bagian bawah dan elektroda negatif pada bagian atas. Fragmen yang telah ditandai akan melakukan migrasi dari bagian atas menuju bagian bawah sesuai dengan ukuran mereka. Fragmen yang lebih pendek akan bergerak lebih cepat. Hasil dari masing – masing reaksi dipisahkan ke dalam empat jalur berbeda.

  Metode

Maxam

 _–

 Gilbert

(chemical cleavage)

Berbeda dengan teknik pemutusan rantai (chain-termination technique) yang melibatkan sintesis enzimatis, metode Maxam  –  Gilbert melibatkan degradasi kimia dari segmen DNA. Reaksi – reaksi pembelahan tersebut berlangsung dalam dua tahap :

 Basa spesifik (tipe – tipe basa) mengalami modifikasi kimia

 Basa yang telah mengalami modifikasi dipisahkan dari gulanya dan ikatan

fosfodiester menuju ujung 3‟ ke basa termodifikasi mengalami pembelahan.

Untuk proses sequencing   skala besar, metode ini lebih jarang digunakan dibandingkan dengan metode dideoxy  enzimatik. Metode Maxam – Gilbert tidak mengalami perubahan yang signifikan sejak pengembangan awalnya. Akan tetapi, beberapa reaksi pembelahan kimia tambahan telah disusun oleh para ilmuwan yang sebagian besar bergantung pada empat reaksi awal yang dijelaskan oleh Maxam dan Gilbert. Proses atau reaksi tersebut meliputi beberapa tahap sebagai berikut :

 DNA rantai ganda yang akan diurutkan diberi tanda dengan cara menempelkan gugus

fosfor radioaktif (P32) pada ujung 5‟. Enzim polinukleotida kinase dan 32P-dATP digunakan untuk proses radiolabeling .

 Dengan menggunakan dimetil sulfoksida (DMSO) dan pemanasan hingga suhu 90 °C,

dua rantai DNA dipisahkan dan dimurnikan.

 Salah satu sampel rantai dibagi menjadi sampel  –  sampel terpisah dan masing  –

masing sampel ditambahkan dengan salah satu reagen pembelahan. Bagian proses ini melibatkan perubahan atau modifikasi dari basa yang diikuti dengan pelepasan basa termodifikasi. Akhirnya, piperidin digunakan untuk proses pembelahan rantai pada saat basa menghilang.

Gambar 2

. Metode Sequencing Maxam – Gilbert

Elektroforesis

Elektroforesis merupakan suatu teknik pemisahan molekul berdasarkan ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Dalam teknik ini, muatan listrik yang terdapat pada DNA (misalnya yang bermuatan negatif) dimanfaatkan. Apabila molekul yang bermuatan negatif dialirkan melalui suatu medium, misalnya sel gel agarosa, kemudian molekul tersebut dialiri muatan listrik dari satu kutub ke kutub lainnya, molekul akan mengalami pergerakan dari kutub negatif menuju ke kutub positif. Besarnya kecepatan gerak molekul bergantung pada rasio antara muatan dan massanya, serta bergantung pada bentuk molekul tersebut.

Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk menganalisis DNA maupun RNA. Salah satu aplikasi dari metode elektroforesis DNA adalah untuk menganalisis fragmen  – fragmen DNA hasil pemotongan dengan enzim restriksi. Fragmen DNA yang telah dipotong dapat ditentukan ukurannya dengan cara membuat gel agarosa (medium), yang berupa bahan semi  –  padat polisakarida yang diekstraksi dari rumput laut. Gel agarosa dapat dibuat dengan cara melarutkannya dalam suatu larutan buffer . Agar proses pelarutannya dapat berlangsung dengan baik, proses pelarutan harus dibantu dengan pemanasan. Dalam keadaan panas, gel akan berwujud cair sehingga dapat dipindahkan ke suatu wadah ( plate). Sebelum kembali menjadi padat, ujung gel diberi lubang dengan menggunakan lembaran Perspex tipis yang dibentuk menyerupai sisir. Sisir tersebut ditancapkan pada salah satu ujung gel yang masih cair. Dengan

demikian ketika gel memadat dan sisir yang ditancapkan telah dicabut, akan terbentuk lubang  – lubang pada gel. Sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang  –  lubang kecil yang telah dibuat tersebut. Gel agarosa yang telah dibentuk kemudian dimasukkan ke dalam suatu tanki yang berisi larutan buffer yang sama dengan larutan yang digunakan untuk membuat gel. Larutan buffer yang digunakan dapat dibuat dari trisasetat-EDTA (TAE) atau trisborat-EDTA (TBE).

Setelah sampel DNA dimasukkan ke dalam lubang, arus listrik dialirkan. Kutub yang sejajar dengan lubang pada sampel merupakan kutub negatif sedangkan kutub lainnya adalah kutub positif. Karena DNA bermuatan negatif, DNA akan bergerak menuju ke kutub positif. Setelah beberapa saat, gel direndam dalam larutan yang mengandung etidium bromida. Etidium bromida akan menginterkalasi (menyisip ke dalam) DNA. Penggunaan etidium bromida bertujuan untuk membantu visualisasi karena etidium bromida akan memancarkan sinar UV. Apabila gel disinari dengan sinar UV dari bawa, akan tampak pita  – pita pada gel. Pita – pita yang tampak merupakan molekul DNA yang bergerak sepanjang gel selama proses elektroforesis.

Molekul RNA dapat dianalisis dengan menggunakan prinsip yang sama. Akan tetapi, untuk menganalisis molekul RNA digunakan larutan buffer yang berbeda yaitu larutan buffer   dengan kandungan formaldehid.

Gambar 3.

 Proses Elektroforesis dengan Medium Gel Agarosa

Staining

Staining merupakan sebuah metode yang dapat digunakan untuk memvisualisasikan atau menunjukkan keberadaan DNA maupun RNA, terutama setelah mengalami proses pemisahan (misalnnya dengan elektroforesis gel). Dalam metode ini, dapat digunakan beberapa jenis pewarna spesifik yang bergantung pada jenis substansi yang akan diidentifikasi. Untuk menunjukkan keberadaan DNA atau RNA dalam sampel, dapat digunakan beberapa jenis pewarna berikut :



Etidium Bromida

, merupakan jenis pewarna umum digunakan untuk memvisualisasikan

DNA. Jenis pewarna ini dapat digunakan dalam campuran gel, dalam larutan buffer  elektroforesis, atau memberikan warna pada gel yang telah digunakan. Molekul dari pewarna ini dapat melekat pada rantai DNA dan dapat berpendar di bawah sinar UV, sehingga dapat menunjukkan pita  –  pita yang terletak dalam gel. Etidium bromida merupakan substansi karsinogen potensial, sehingga penggunaannya harus dilakukan secara hati –hati.



SYBR

Gold 

 (Emas)

merupakan jenis pewarna yang dapat digunakan untuk mewarnai DNA

rantai tunggal atau ganda, maupun RNA. Pewarna ini merupakan salah satu alternatif yang dapat digunakan untuk menggantikan penggunaan etidium bromida dan dianggap memiliki sensitivitas yang lebih tinggi. Pewarna ini dapat menghasilkan fluoresensi UV 1000 kali lipat lebih besar setelah terikat dengan asam nukleat. SYBR Gold   dapat menembus gel

agarosa dengan ketebalan dan persentase yang tinggi serta dapat digunakan dalam gel formaldehid.



SYBR

Green 

(Hijau)

terbagi menjadi dua jenis, yaitu SYBR Green I dan II. Kedua jenis

pewarna ini dikembangkan untuk tujuan yang berbeda. SYBR Green  I lebih sensitif terhadap penggunaan DNA rantai-ganda, sedangkan SYBR Green II paling baik digunakan untuk DNA rantai-tunggal atau RNA. Seperti sifat etidium bromida, kedua jenis pewarna yang sangat sensitif ini akan berpendar di bawah sinar UV.



SYBR

Safe merupakan jenis pewarna yang dirancang sebagai sebuah alternatif yang lebih

aman dibandingkan dengan etidium bromida maupun jenis pewarna SYBR lainnya. SYBR Safe  dapat dikategorikan sebagai pewarna yang tidak berbahaya dan umumnya dapat dibuang melalui sistem saluran pembuangan biasa.

 Eva Green merupakan jenis pewarna fluoresensi hijau yang dapat dimanfaatkan dalam

metode RT-PCR. Jenis pewarna ini baik digunakan untuk gel dengan titik lebur yang rendah. Eva Green sangat stabil dalam suhu tinggi dan memiliki fluoresensi yang rendah, akan tetapi tingkat fluoresensinya menjadi sangat tinggi setelah berikatan dengan DNA. Pewarna ini juga memiliki tingkat toksisitas yang rendah seperti SYBR Safe.

 Acrid ine Orange merupakan pewarna kationik selektif asam nukleat yang berguna untuk

menentukan siklus sel. Jenis pewarna ini bersifat sel-permeabel dan dapat berinteraksi dengan DNA maupun RNA melalui interkalasi atau gaya tarik elektrostatik. Ketika berikatan dengan DNA, akan dihasilkan spektrum yang serupa dengan spektrum fluorescent .

Hybridization 

Hibridisasi asam nukleat merupakan sebuah alat yang fundamental dalam genetik molekular yang memanfaatkan kemampuan molekul asam nukleat untai-tunggal untuk membentuk molekul untai-ganda. Agar hal ini dapat terjadi, molekul DNA untai-tunggal yang berinteraksi harus memiliki basa komplementer dalam derajat yang cukup tinggi. Metode hibridisasi asam nukleat standar melibatkan penggunaan  probe asam nukleat berlabel untuk mengidentifikasi molekul DNA atau RNA terkait (molekul dengan tingkat kesamaan urutan / sequence yang tinggi) dalam campuran kompleks yang terdiri dari molekul asam nukleat yang tidak berlabel (asam nukleat target).

 Persiapan

Probe

Asam Nuk leat

Dalam uji hibridisasi asam nukleat standar,  probe ditandai dengan beberapa cara. Probe asam nukleat dapat berupa molekul untai tunggal maupun untai ganda. Akan tetapi,  probe yang bekerja harus berupa molekul untai tunggal.

Probe DNA konvensional diisolasi melalui kloning DNA berbasis sel atau melalui metode PCR. DNA awal dapat memiliki kisaran ukuran mulai dari 0,1 kb hingga ratusan kilobasa dalam segi panjang. Biasanya (meskipun tidak selalu), DNA tersebut awalnya merupakan molekul untai-ganda. Probe DNA yang dihasilkan melalui metode PCR biasanya memiliki panjang kurang dari 10 kb dan beruntai ganda. Probe DNA konvensional biasanya diberi label dengan menggabungkan beberapa dNTP berlabel selama reaksi sintesis DNA in vitro.

Probe RNA dapat diperoleh dari DNA yang telah dikloning dalam vektor plasmid khusus. Reaksi sintesis RNA dilakukan dengan menggunakan fag RNA polimerase yang relevan beserta keempat rNTP, yang paling tidak salah satunya memiliki label.

 Prinsip Hibridisasi Asam Nukleat 

Hibridisasi asam nukleat melibatkan proses pencampuran dua sumber asam nukleat untai-tunggal, yang merupakan sebuah  probe yang biasanya terdiri dari populasi homogen dari molekul yang telah teridentifikasi dan sebuah target yang biasanya mengandung populasi molekul asam nukleat yang heterogen dan kompleks. Apabila tidak ada satupun  probe atau target yang awalnya beruntai ganda, masing  –  masing untai harus dipisahkan, umumnya dengan cara pemanasan. Setelah menggabungkan  probe  untai tunggal dengan target untai tunggal, untai dengan urutan basa komplementer dapat kembali bergabung.

 B l o t t i n g

Blotting pada dasarnya merupakan sebuah metode yang digunakan untuk melakukan transfer protein, DNA, atau RNA pada carrier . Beberapa jenis metode blotting tampak pada tabel berikut :

Tabel 1.

Beberapa Tipe Blotting

Tipe

B l o t t i n g

Molekul Membran

Molekul

Probe

Southern blotting Northern blotting Western blotting South-Western blotting DNA RNA Protein Protein DNA DNA  Antibodi dsDNA

 Southern blotting merupakan metode yang digunakan untuk mengidentifikasi gen pada

berbagai organisme. Dalam teknik ini, satu sampel DNA dihibridisasi dengan sampel DNA lain.

Gambar 4.

Southern blotting

 Northern blotting   merupakan metode yang mengacu pada teknik hibridisasi yang

menggunakan RNA sebagai molekul target dan DNA sebagai molekul  probe. Sebagai contohnya, probe DNA dapat digunakan untuk menentukan lokasi dari molekul mRNA yang berhubungan dengan gen yang sama. Campuran dari RNA dimasukkan dalam gel (agarosa) dan dipindahkan menuju filter.

 Western blotting  merupakan metode yang tidak melibatkan hibridisasi asam nukleat. Dalam

metode ini, protein dipisahkan dengan medium gel, yang kemudian dipindahkan menuju membran dan dideteksi oleh antibodi maupun dengan metode lainnya.

III. Analisis Kuantitatif

Saat ini, terdapat banyak teknologi yang dapat digunakan dalam proses kuantifikasi DNA dan RNA. Perlu diingat bahwa masing  –  masing teknologi atau metode dikembangkan untuk tujuan yang berbeda. Oleh karena itu, masing  –  masing metode memiliki kekurangan dan kelebihan sehingga tidak dapat dibandingkan satu sama lain.

Real _– Time

PCR

RT-PCR merupakan metode yang umumnya digunakan ketika material awal (sel, jaringan, atau RNA) berada dalam jumlah yang terbatas, atau dibutuhkan hasil analisis dengan tingkat sensitivitas dan akurasi yang tinggi. Proses PCR berlangsung dalam sebuah thermal cycler  yang dapat menerangi masing  –  masing sampel dengan seberkas cahaya yang memiliki panjang gelombang tertentu dan dapat mendeteksi fluoresensi yang dipancarkan oleh fluorofor yang tereksitasi. Thermal cylcer   juga dapat melakukan pemanasan dan pendinginan sampel secara cepat, sehingga sifat fisikokimia dari asam nukleat dan DNA polimerase dapat dimanfaatkan.

Proses PCR umumnya terdiri dari serangkaian perubahan temperatur berulang (25-40 kali). Siklus – siklus tersebut umumnya terdiri dari tiga tahap :

 Tahap pertama berlangsung pada suhu sekitar 95°C, yang memungkinkan adanya proses

pemisahan rantai ganda asam nukleat.

 Tahap kedua berlangsung pada suhu sekitar 50-60°C, yang memungkinkan adanya proses

pengikatan primer dengan DNA template (rantai yang dikodekan).

 Tahap ketiga berlangsung pada suhu sekitar 68 - 72°C, yang memungkinkan terjadinya

proses polimerisasi yang dilakukan oleh DNA polimerase.

Temperatur dan waktu yang dibutuhkan untuk masing  – masing siklus bergantung pada berbagai parameter seperti : enzim yang digunakan untuk mensintesis DNA, konsentrasi dari ion divalen dan dNTP (deoxyribonucleotides ) dalam reaksi, dan suhu ikatan primer.

Polymerase chain reaction (PCR) sejauh ini merupakan teknik paling sensitif yang dapat digunakan untuk mendeteksi asam nukleat ketika primer  –  primer yang tepat dalam proses amplifikasi dapat ditentukan. Sensitivitas PCR disebabkan oleh sifat eksponensial dalam prosedur amplifikasi (dinyatakan dalam Persamaan 1)