ISOLASI DAN IDENTIFIKASI KAPANG ENDOFIT DALAM RIMPANG TEMU GIRING
(Curcuma heyneana Val. & van Zijp) SERTA ANALISIS SECARA KUANTITATIF
TERHADAP METABOLIT SEKUNDER YANG DIHASILKAN
Indriana Rahmawati, Putri Moortiyani Al Asna
Program Studi Biologi, FMIPA, Universitas Negeri MalangJalan Semarang 5 Malang 65145, Indonesia
indrianarahmawati94@gmail.com
ABSTRAK
Tanaman temu giring merupakan tanaman berkhasiat obat. Beberapa spesies kapang endofit hidup dalam jaringan berbagai jenis tanaman. Penelitian ini bertujuan untuk 1) isolasi dan identifikasi kapang endofit dalam rimpang temu giring, 2) mengobservasi secara histologik letak kapang endofit dalam jaringan rimpang temu giring, dan 3) menganalisis secara kuantitatif terhadap metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit dalam rimpang temu giring. Isolasi dan identifikasi dilakukan dengan cara menginokulasikan secara aseptik potongan rimpang temu giring pada
medium Czapek Agar, kemudian diinkubasikan pada suhu 25-27o C selama 7x24 jam, selanjutnya
identifikasi dilakukan dengan pengamatan morfologi dan mikroskopis koloni kemudian dirujukkan pada buku kunci identifikasi jamur. Observasi histologik letak kapang endofit dilakukan dengan pembuatan preparat irisan rimpang temu giring kemudian diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya. Metabolit sekunder diperoleh dari supernatan hasil kultur cair kapang endofit dalam
medium Czapek cair yang diinkubasikan pada suhu ruang (26-27o C) dengan pengocokan
berkecapatan 120 rpm selama 7x24 jam, setelah itu metabolit sekunder dianalisiskan secara kuantitatif dengan menggunakan metode spektrofotometer. Hasil penelitian menunjukkan bahwa, 1) terdapat 5 spesies kapang endofit yang berhasil diisolasi dari rimpang temu giring yaitu Fusarium
sporotrichioides, Aspergillus versicolor, Aspergillus terreus, Fusarium oxysporum, dan Cladosporium sphaerospermum, 2) miselium kapang endofit terletak di sel-sel parenkim pada
jaringan korteks rimpang temu giring, 3) setiap spesies kapang endofit rimpang temu giring mampu menghasilkan metabolit sekunder yang dianalisiskan yaitu kadar alkaloid berkisar antara 0,31-0,84 g/L, flavonoid berkisar antara 0,70 – 2,30 g/L, terpenoid berkisar antara 0,02 - 0,07 g/L, dan fenol berkisar antara 1,97 – 5,75 g/L.
Kata Kunci: kapang endofit, rimpang temu giring, metabolit sekunder PENDAHULUAN
Tanaman dapat berpotensi sebagai obat karena mengandung senyawa aktif hasil metabolisme sekunder seperti alkaloid, steroid, terpenoid, flavonoid, saponin,
glikosida, tanin, dan lain sebagainya (Wink, 2010).Salah
satu jenis tanaman yang telah teridentifikasi dan terbukti berpotensi sebagai tanaman berkhasiat obat adalah temu giring (Curcuma heyneana Val. & van Zijp) dari genera
Curcuma yang tergolong famili Zingiberaceae. Rimpang
temu giring merupakan bagian tanaman temu giring yang biasanya dimanfaatkan untuk obat. Berbagai jenis tanaman khususnya dalam jaringan tanaman dapat dijumpai kapang endofit. Kapang endofit mengambil sedikit nutrisi dari tubuh inangnya, namun tidak bersifat patogen dan tidak menyebabkan kematian inangnya (Deacon, 2006). Beberapa spesies kapang endofit yang telah berhasil diisolasi dari jaringan berbagai jenis tanaman ternyata mampu menghasilkan metabolit sekunder yang dapat dimanfaatkan dalam bidang
kesehatan dan pertanian (Strobel & Daisy, 2003). Ada kemungkinan bahwa di dalam jaringan rimpang temu giring juga terdapat kapang endofit penghasil senyawa-senyawa aktif yang bersifat antimikroba. Spesies-spesies kapang endofit dalam rimpang temu giring masih belum teridentifikasi sehingga perlu diteliti.
Spesies-spesies kapang endofit harus ditumbuhkan pada medium cair yang bersifat spesifik agar dapat tumbuh dan menghasilkan senyawa metabolit sekunder. Fitriyah dkk (2013) menyatakan bahwa kapang endofit dapat ditumbuhkan dalam medium Czapek. Senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam medium Czapek cair sebagai hasil metabolisme sekunder kapang endofit tersebut dapat di analisis secara kuantitatif untuk memastikan kandungan senyawa yang terdapat di dalamnya. Penulis membatasi penelitian ini pada senyawa-senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol. Apabila penelitian ini berhasil mengungkapkan adanya spesies kapang endofit penghasil
senyawa-senyawa aktif yang hidup dalam jaringan rimpang temu giring maka diharapkan dapat membantu bidang Farmasi dalam hal penyiapan bahan alami yang langsung diperoleh melalui kultur kapang endofit penghasil senyawa aktif tersebut. Tujuan penelitian ini adalah 1) mengidentifikasi spesies-spesies kapang endofit yang terdapat dalam rimpang temu giring (Curcuma heyneana Val. & v. Zijp), 2) mengobservasi secara histologik letak kapang endofit dalam jaringan rimpang temu giring, dan 3) menganalisis secara kuantitatif metabolit sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol dalam supernatan hasil kultur cair setiap spesies kapang endofit pada rimpang temu giring.
METODE Jenis Penelitian
Penelitian ini merupakan penelitian deskriptif eksploratif yang bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi spesies-spesies kapang endofit dalam rimpang temu giring, mengobservasi secara histologik letak kapang endofit dalam jaringan rimpang temu giring serta untuk menganalisis secara kuantitatif metabolit sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid dan fenol dari supernatan hasil kultur cair setiap spesies kapang endofit dalam rimpang temu giring.
Populasi dan Sampel
Populasi dalam penelitian ini adalah semua kapang endofit yang ditemukan dalam tanaman temu giring yang terdapat di lahan UPT Materia Medica Batu. Sampel yang digunakan adalah semua spesies kapang endofit rimpang tanaman temu giring.
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dimulai pada bulan September 2014 sampai bulan April 2015, bertempat di Laboratorium
Mikrobiologi, Jurusan Biologi, Fakultas MIPA,
Universitas Negeri Malang dan di Laboratorium Kimia Universitas Muhammadiyah Malang.
Alat dan Bahan
Alat: cawan petri, Erlenmeyer 100 mL,
mikropipet 10 mL, sentrifuge, lampu spiritus, jarum inokulum, Laminar Air Flow (LAF), autoklaf, oven kering, tabung reaksi, skalpel, pinset, cover glass, object
glass, inkubator, shaker, dan mikroskop cahaya.
Bahan: aquades steril, kapas, kasa, komponen
medium Czapek antara lain NaNO3, KCl, MgSO4,
FeSO4.7H2O, K2HPO4, Saccharose, dan agar powder,
aluminium foil, rimpang temu giring sehat, alkohol 70%,
alkohol 95%, NaOCl 1%, kloramfenikol, tisu,
Lactophenol, dan Lactophenol cotton blue.
Prosedur Kerja Isolasi kapang endofit
Rimpang temu giring yang sehat dicuci bersih dengan air kemudian direndam di dalam NaOCl 1% selama 1 menit kemudian dibilas dengan aquades steril, lalu direndam di dalam alkohol 70% selama 1 menit, selanjutnya dibilas lagi dengan aquades steril (Patel dkk., 2013). Rimpang dipotong dengan ketebalan 0,5 cm. Setiap potongan diinokulasikan diatas medium lempeng Czapek agar yang mengandung kloramfenikol (100 mg/L media), kemudian diinkubasikan di dalam inkubator pada
suhu 25-27oC selama kurang lebih 7x24 jam. Setelah
diinkubasi, dilakukan pembuatan biakan murni kapang endofit di medium miring dan medium lempeng untuk pengamatan makroskopis koloni, meliputi: warna koloni, diameter koloni, sifat koloni, dan warna bagian dasar koloni.
Pembuatan preparat dan identifikasi kapang endofit
Identifikasi kapang endofit dilakukan dengan membuat preparat kapang endofit melalui metode Slide
culture. Setelah preparat siap digunakan, dilakukan
pengamatan ciri mikroskopis pada setiap isolat kapang
endofit kemudian dirujukkan pada buku kunci
identifikasi fungi.
Pembuatan kultur cair spesies kapang endofit
Menurut (Sharma dan Kumar, 2013), isolat murni kapang endofit yang tumbuh di medium lempeng
dipotong dengan ukuran 5 cm2 kemudian diinokulasikan
ke dalam 80 mL medium Czapek cair, lalu diinkubasikan dengan pengocokan berkecepatan 120 rpm selama 7x24 jam pada suhu ruang. Hasil pengocokan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit pada suhu ruang. Supernatan hasil sentrifugasi digunakan untuk menganalisis kadar beberapa metabolit sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol.
Observasi secara histologik letak kapang endofit dalam jaringan rimpang Temu Giring
Rimpang temu giring yang sehat dan telah disterilisasikan permukaannya selanjutnya diiris setipis mungkin secara melintang kemudian hasil irisan diletakkan pada kaca benda yang ditetesi aquades steril lalu ditutup dengan kaca penutup. Preparat diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya kemudian hasil pengamatan di foto dengan menggunakan kamera digital.
Analisis secara kuantitatif metabolit sekunder yang terkandung dalam supernatan hasil kultur cair kapang endofit
Kandungan metabolit sekunder pada supernatan hasil kultur cair kapang endofit diujikan di Laboratorium Kimia, Universitas Muhammadiyah Malang dengan menggunakan metode spektrofotometer.
Teknik Analisis Data
Data ciri-ciri makroskopis dan mikroskopis kapang endofit yang diperoleh selanjutnya dideskripsikan kemudian dirujukkan pada buku kunci identifikasi fungi untuk menentukan nama spesies kapang endofit. Analisis letak kapang endofit dilakukan melalui pengamatan pada preparat irisan melintang rimpang temu giring. Hasil uji secara kuantitatif metabolit sekunder dianalisis secara
kimia dengan metode spektrofotometer untuk
menentukan kadar metabolit sekunder alkaloid,
flavonoid, terpenoid, dan fenol yang dihasilkan oleh setiap spesies kapang endofit yang ditemukan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil Isolasi dan Identifikasi Kapang Endofit dalam Rimpang Temu Giring
Hasil penelitian menunjukkan bahwa terdapat lima spesies kapang endofit yang berhasil diisolasi dari rimpang temu giring yaitu Fusarium sporotrichioides,
Aspergillus versicolor, Aspergillus terreus, Fusarium oxysporum, dan Cladosporium sphaerospermum (lihat
Gambar 1).
Gambar 1. Ciri Mikroskopis Isolat Kapang Endofit dari
Rimpang Temu Giring.
Keterangan: a. Fusarium sporotrichioides, b.
Aspergillus versicolor, c. Aspergillus terreus,
d. Fusarium oxysporum, dan e.
Cladosporium sphaerospermum
Spesies-spesies kapang yang berhasil
diidentifikasi dalam penelitian ini adalah spesies-spesies kapang endofit pada rimpang temu giring yang tidak dapat menyebabkan kerugian atau penyakit bagi tanaman temu giring. Adapun Doolotkeldieva dan Bobusheva (2014) menyatakan berdasarkan hasil penelitiannya bahwa Fusarium, Aspergillus, dan Cladosporium merupakan genus-genus kapang yang sering ditemukan sebagai endofit dalam jaringan sistem perakaran tanaman inang. Berdasarkan beberapa laporan hasil penelitian
sebelumnya, spesies-spesies kapang endofit yang
ditemukan dalam rimpang temu giring dalam penelitian ini ternyata juga ditemukan sebagai kapang endofit pada tanaman lainnya.
Beberapa hasil penelitian menyebutkan bahwa spesies kapang Fusarium sporotrichioides diantaranya ditemukan sebagai kapang endofit daun Dioscorea
pentaphylla (Shankar & Shashikala, 2010). Aspergillus versicolor ditemukan sebagai kapang endofit diantaranya
pada daun Ocimum sanctum,dan akar tanaman tomat (Sharma & Kumar, 2013; Chadha dkk.,2015). Aspergillus
terreus juga ditemukan sebagai kapang endofit pada daun
dan akar tumbuhan Jatropha curcas, dan daun Ocimum
sanctum (Singh, 2013; Sharma & Kumar, 2013). F.oxysporum ditemukan pada daun dan ranting tanaman
obat Antidesma madagascariense (Jeewon dkk., 2013).
Cladosporium sphaerospermum telah ditemukan sebagai
kapang endofit pada akar tanaman kedelai kultivar Daemangkong (Hamayun dkk.,2009) dan akar tanaman
Dendrobium crumenatum (Mangunwardoyo dkk., 2012).
Berdasarkan informasi mengenai spesies-spesies kapang endofit yang juga ditemukan pada beberapa jenis tanaman lainnya tersebut maka hasil penelitian ini memperkuat pembuktian tentang adanya beberapa spesies kapang endofit yang terdapat juga dalam rimpang temu giring.
Hasil Observasi Histologik Letak Kapang Endofit dalam Jaringan Rimpang Temu Giring
Hasil pengamatan histologik mengenai letak kapang endofit dalam jaringan rimpang temu giring menunjukkan bahwa miselium kapang endofit terletak diruang antar sel pada jaringan korteks (lihat Gambar 2a). Miselium kapang endofit tidak dijumpai dalam jaringan vaskular, namun kadang-kadang miselium kapang endofit dapat menembus dinding sel parenkim pada jaringan korteks (lihat Gambar 2b).
Gambar 2. Pengamatan Mikroskopis Letak Kapang
Endofit dalam Jaringan Rimpang Temu Giring. Keterangan: a. Bagian yang di tunjuk adalah miselium kapang endofit yang terletak di ruang antar sel parenkim pada jaringan korteks, b. Bagian yang ditunjuk adalah miselium kapang endofit menembus dinding sel parenkim
Jaringan korteks yang digunakan sebagai tempat hidup miselium kapang endofit berisi sel-sel parenkima berdinding tipis yang mempunyai ruang antar sel yang berisi udara dan air. Miselium kapang endofit yang dapat menembus dinding sel parenkim akan berada dalam sitoplasma sel yang berisi air (85-90%), garam, karbohidrat, protein, dan lemak (Setjo dkk., 2004). Adanya kandungan air, substansi organik dan anorganik yang tersedia dalam jaringan rimpang temu giring dapat menjadi sumber nutrisi yang dibutuhkan oleh kapang untuk menjaga kelangsungan hidupnya. Hal tersebut merupakan manfaat yang diperoleh oleh kapang endofit dalam bersimbiosis dengan tanaman inangnya. Kapang endofit hanya mengambil sedikit nutrisi sehingga tidak sampai menyebabkan kematian inangnya (Deacon, 2006). Adapun tanaman inang yang ditempati oleh kapang endofit juga mendapat manfaat, misalnya; perlindungan dari serangan mikroba patogen dan serangga predator melalui beberapa macam senyawa metabolit sekunder
yang dihasilkan oleh kapang endofit. Hal ini
menunjukkan adanya hubungan simbiosis mutualisme antara kapang endofit dengan tanaman inangnya.
Analisis secara Kuantitatif Metabolit Sekunder dari Supernatan Hasil Kultur Cair Kapang Endofit
Setiap spesies kapang endofit rimpang temu giring mampu menghasilkan metabolit sekunder yang diujikan yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol. Kadar kandungan metabolit sekunder pada supernatan hasil kultur cair setiap spesies kapang endofit dalam rimpang temu giring dapat dilihat pada Tabel 1
Tabel 1. Hasil Analisis secara Kuantitatif Metabolit
Sekunder pada Supernatan Hasil Kultur Cair Kapang Endofit Rimpang Temu Giring
Kode
Isolat Nama spesies kapang
Metabolit sekunder (g/L) Alka-loid Flavo-noid Terpe-noid Fenol A Fusarium sporotrichioides 0,52 1,34 0,04 3,76 B Aspergillus versicolor 0,39 0,94 0,03 2,37 C Aspergillus terreus 0,84 2,30 0,07 5,75 D Fusarium oxysporum 0,34 0,79 0,03 2,19 E Cladosporium sphaerospermum 0,31 0,70 0,02 1,97
Berdasarkan data uji kuantitatif metabolit sekunder dapat diketahui bahwa kapang endofit rimpang
temu giring A.terreus paling berpotensi dalam
menghasilkan senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol dengan kadar yang lebih tinggi dibandingkan senyawa alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol yang dihasilkan oleh kapang endofit rimpang temu giring
F.sporotrichioides, A.versicolor, F.oxysporum, dan
C.sphaerospermum. Kapang endofit A.terreus mampu
menghasilkan fenol dengan kadar 5,75 g/L dan flavonoid
dengan kadar 2,30 g/L. Hasil tersebut lebih tinggi daripada hasil yang diperoleh dari penelitian Sharma dan Kumar (2013) yang melaporkan bahwa ekstrak etil asetat miselium kapang endofit A.terreus yang diisolasi dari daun Ocimum sanctum menghasilkan fenol dengan kadar 0,01 g/100 mL dan flavonoid dengan kadar 0,002 g/100mL. Adanya kemampuan tertinggi dari A.terreus
dalam menghasilkan senyawa-senyawa metabolit
sekunder yaitu alkaloid, flavonoid, terpenoid, dan fenol
mengindikasikan bahwa spesies kapang tersebut
mempunyai peranan yang lebih tinggi dalam hal
perlindungan terhadap mikroorganisme yang
menyebabkan peyakit pada rimpang temu giring dibandingkan dengan keempat spesies kapang endofit lainnya.
Hasil penelitian ini menjelaskan bahwa spesies-spesies kapang endofit yang berhasil diidentifikasi dari rimpang temu giring berpotensi sebagai sumber penghasil keempat senyawa metabolit sekunder yang di deteksi. Senyawa-senyawa tersebut sangat dibutuhkan dalam bidang farmasi maupun pertanian, khususnya sebagai senyawa-senyawa yang bersifat antimikroba. Hasil penelitian ini dapat menjadi dasar atas saran dalam hal penyediaan senyawa-senyawa metabolit sekunder melalui pembiakkan spesies-spesies kapang penghasilnya, selain dengan mengekstraksi rimpang temu giring sebagai tanaman penghasil seyawa berkhasiat obat. Penelitian ini juga dapat digunakan sebagai dasar atas saran untuk
penelitian lebih lanjut yang bertujuan untuk
mengeksplorasi spesies-spesies kapang endofit yang berasal dari berbagai jenis tanaman khususnya tanaman berkhasiat obat. Penelitian lain juga dapat dilakukan misalnya penelitian terapan yang bertujuan untuk menguji efektivitas senyawa-senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit terhadap serangga hama pada tanaman, sehingga dapat membantu dalam upaya pengendalian hayati serangga hama.
SIMPULAN
Kesimpulan dalam penelitian ini ialah 1) kapang endofit yang berhasil diisolasi dari rimpang temu giring yaitu Fusarium sporotrichioides, Aspergillus versicolor,
Aspergillus terreus, Fusarium oxysporum, dan
Cladosporium sphaerospermum, 2) kapang endofit dalam
jaringan rimpang temu giring terletak di sel-sel parenkim pada jaringan korteks dan terdapat juga di ruang antar sel parenkim, dan 3) spesies- spesies kapang endofit dalam rimpang temu giring mampu menghasilkan alkaloid dengan kadar yang berkisar antara 0,31-0,84 g/L, flavonoid berkisar antara 0,70 – 2,30 g/L, terpenoid berkisar antara 0,02 - 0,07 g/L, dan fenol berkisar antara 1,97 – 5,75 g/L. Saran yang dapat diberikan ialah 1) perlu dilakukan penelitian sejenis yang bertujuan untuk
mengeksplorasi spesies-spesies kapang endofit yang berasal dari berbagai jenis tanaman berkhasiat obat, 2) perlu dilakukan penelitian terapan yang bertujuan untuk menguji efektivitas senyawa-senyawa metabolit sekunder yang dihasilkan oleh kapang endofit terhadap serangga hama pada tanaman sebagai upaya pengendalian hayati serangga hama.
DAFTAR PUSTAKA
Chadha, N., Prasad, R.,& Varma, A. 2015. Plant Promoting Activities of Fungal Endophyte Associated with Tomato Roots From Central Himalaya, India, and Their Interaction with
Piriformospora indica. Indternational Journal of Pharma and Bio Sciences.6(1):333-343.
Deacon, J.W. 2006. Fungal Biologi 4th Edition. Australia
: Blackwell Publishing.
Doolotkeldieva, T & Bobusheva, S. 2014. Endophytic Fungi Diversity of Wild Terrestrial Plants in
Kyrgyzstan.Global Advanced Research
Journal of Microbiology 3(9):163-176.
Fitriyah, D., Christine, & Saryono.2013. Skrining Aktivitas Antimikroba dan Uji Fitokimia dari Kapang Endofit Tanaman Dahlia (Dahlia
variabilis). Journal Indonesian Chemistry Acta 3 (2) : 50-55.
Hamayun, M., Khan, SA., Ahmad, N., Sheng Tang, D., Mo kang, S., In Na, C., Young Sohn, E., Hyun Hwang, Y., Hyun Shin, D., Hyun Lee, B., Guk Kim, J., & Jung Lee, In. 2009.
Cladosporium sphaerospermum as a new
plant growth promoting endophyte from the roots of glycine max (L.)Merr.World Journal
Microbiology Biotechnology Springer
25:627-632.
Jeewon, R., Itto, J., Mahadeb, D., Jaufeerally, Y., Kai Wang, H., & Rong Liu, A. 2013. DNA
Based Identification and Phylogenetic
Characterisation of Endophytic and Saprobic Fungi From Antidesma madagascariense, a Medicinal Plant in Mauritius. Journal of
Mycology : 1-10.
Mangunwardoyo, W., Suciatmih, & Gandjar, I. 2012. Frequency of Endophytic Fungi Isolated From Dendrobium crumenatum (Pigeon
Orchid) and Antimicrobial Activity.
Biodiversitas 13(1):34-39.
Patel, C., Yadav, S., Rahi, S & Dave, A. 2013.Studies on Biodiversity of Fungal Endophytes of Indigenous Monocotaceous and Dicotaceous Plants and Evaluation of their Enzymatic
Potentialities.International Journal of
Scientific and Research Publications 3(7):
1-5.
Setjo,S., Kartini, E., Saptasari, M. &Sulisetijono. 2004.
AnatomiTumbuhan. Malang :Jica.
Shankar, NB & Shashikala, J. 2010.Diversity and Structure of Fungal Endophyte in some
Climbers and Grass Species of Malnand Region, Western Ghats, Southern India.
Mycosphere 1(4):265-274
Sharma, R & Kumar, V. 2013. Isolation Characterization and Antioxidant Potential of Endophytic Fungi of Ocimum sanctum Linn. Lamiaceae.
Indian Journal of Applied Research
3(7):5-10.
Strobel, G & Daisy, B. 2003.Bioprospecting for Microbial Endophyte and Their Natural Products. Microbiology and Molecular
Biology Reviews 67(4): 491-502.
Wink, M. 2010. Biochemistry of Plant Secondary
