Deteksi FcyRIIa Pada Stem Cell Yang Diisolasi Dari Darah Tepi.

ABSTRAK

DETEKSI FcγRIIa PADA STEM CELL YANG DIISOLASI DARI DARAH TEPI

Jessie Theresia Caroline, 2008.

Pembimbing Utama : dr. Caroline Tan Sardjono, Ph.D Pembimbing Pendamping : dr. Lusiana Darsono, M.kes

Latar belakang: Untuk memberikan pemahaman yang lebih terhadap imunogenisitas stem cell, maka perlu diketahui ada atau tidaknya Fc-gamma receptor, dalam hal ini FcγRIIa pada stem cell yang diisolasi dari darah tepi. Tujuan: Ingin mengetahui ada atau tidaknya FcγRIIa pada stem cell yang diisolasi dari darah tepi.

Metode Penelitian: Penelitian laboratorium eksperimental dengan objek penelitian adalah hematopoietic stem cell yang diisolasi dari darah tepi.

Hasil: Pada visualisasi amplicon Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) dengan menggunakan primer yang mentarget mRNA FcγRIIa, didapatkan band dengan ukuran antara 300 bp dan 400 bp. Hal ini sesuai dengan ukuran primer FcγRIIa yaitu 346 bp.

Kesimpulan: Berdasarkan hasil RT-PCR pada mRNA darah tepi stem cell terdeteksi adanya ekspresi FcγRIIa. Hal ini merupakan informasi yang mengindikasikan adanya interaksi antara stem cell yang diisolasi dari darah tepi dengan Imunoglobulin G melalui reseptornya yaitu FcγRIIa.

Saran: Penting dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui interaksi antara Imunoglobulin G dengan FcγRIIa pada stem cell, dengan FcγRIIa pada stem cell yang diisolasi dari darah tepi.

v ABSTRACT

DETECTION OF FcγRIIa AT STEM CELL WHICH IS ISOLATED FROM PERIPHERAL BLOOD

Jessie Theresia Caroline, 2008.

Supervisor I : dr. Caroline Tan Sardjono, Ph.D Co-supervisor : dr. Lusiana Darsono, M.kes

Backgrounds: Immunogenicity of stem cell has not been fully characterized. A better understanding of stem cell immunogenicity can be obtained through detection of Immunoglobulin Receptor i.e. Fc

γ

R. This study explored the detection of Fc

γ

RIIa on peripheral blood stem cell.

Objectives: To detect the expression of FcγRIIa on peripheral blood stem cell. Research Methods: This study was conducted as an experimental research of laboratory using stem cell isolated from peripheral blood.

Results: A band sized between 300 bp and 400 bp was visualized after the Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR) using primer set targeting. This result was in accordance to the expected size of Fc

γ

RIIa amplicon i.e. 346 bp.

Conclusions: Based on the result from RT-PCR on mRNA from peripheral blood stem cell, Fc

γ

RIIa expression was detected. This finding informed there is an indication of interaction between stem cell and Immunoglobulin G through one of it’s receptors, Fc

γ

RIIa.

Suggestion: It will be important to conduct further assays to characterize the interaction between Immunoglobulin G and FcγRIIa on peripheral blood stem cell.

DAFTAR ISI

1.2Identifikasi Masalah ... 2

1.3Maksud dan Tujuan Penelitian... 3

1.4Manfaat Penelitian ... 3

1.5Metode Penelitian... 3

1.6Lokasi dan Waktu ... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Stem Cell... 4

2.1.1 Klasifikasi Stem Cell... 4

2.1.1.1 Embryonic Stem Cell... 5

2.1.1.2 Adult Stem Cell ... 7

2.1.2 Hematopoietic Stem Cell (HSC)... 9

2.1.2.1 Marker HSC... 10

2.1.2.2 Sumber HSC ... 11

2.1.2.3 Peran HSC ... 11

2.1.3 HSC yang diisolasi dari darah tepi ... 12

2.2 Fc Receptor (FcR)... 12

2.2.1 Fungsi Fc Receptor... 14

2.2.2 Fc-gamma receptors (FcγR) ... 14

2.2.3 Mekanisme Sinyal Fcγ Receptor ... 16

2.2.4 Fc-gamma receptors IIa (FcγRIIa)... 17

2.3 Ficoll-Paque PLUS ... 18

2.5 Magnetic-Activated Cell Sorting (MACS) ... 19

2.6 Flow cytometry... 20

2.7 Polymerase Chain Reaction (PCR)... 22

ix

3.3.1 Alat ... 27

3.3.2 Bahan ... 28

3.4 Diagram Penelitian... 30

3.5 Cara Kerja ... 31

3.5.1 Isolasi Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) ... 31

3.5.2 Magnetic Activating Cell Sorting (MACS) dengan miniMACS... 31

3.5.2.1 Magnetic Labeling ... 31

3.5.2.2 Magnetic Separation ... 32

3.5.3 Analisis dengan Flow cytometry menggunakan FACS ... 32

3.5.4 Isolasi mRNA ... 33

3.5.5 One step RT-PCR ... 35

3.5.6 Elektroforesis ... 36

BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN 4.1 Isolasi PBMCs (Peripheral Blood Mononuclear Cells)... 37

4.2 Separasi Sel CD34+ dan Konfirmasi Kemurnian CD34+... 38

4.3 One step RT-PCR... 39

4.3.1 Deteksi ekspresi mRNA FcγRIIa pada Peripheral Blood ... 41

4.3.2 Deteksi kontaminan terhadap mRNA ... 42

BAB V KESIMPULAN dan SARAN 5.1 Kesimpulan ... 46

5.2 Saran... 46

DAFTAR PUSTAKA ... 47

LAMPIRAN ... 50

DAFTAR GAMBAR

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Gambar 2.1 Human Embryonic Stem Cell Colony ... 5

Gambar 2.2 Pluripotent Embryonic Stem Cell ... 6

Gambar 2.3 Proses Kultur Human Embryonic Stem Cell ... 7

Gambar 2.4 Adult Stem Cell ... 8

Gambar 2.5 Kemampuan Diferensiasi Hematopoietic Stem Cell... 9

Gambar 2.6 Fragmen Antibodi ... 13

Gambar 2.7 Fc Receptor ... 13

Gambar 2.8 Mekanisme Sinyal Fcγ Receptor ... 17

Gambar 2.9 miniMACS Separator ... 20

Gambar 2.10 Flow cytometry ... 21

Gambar 2.11 PCR ... 22

Gambar 2.12 Tahap-Tahap PCR... 24

Gambar 2.13 Penggandaan Gen Secara Eksponensial Dengan PCR... 25

BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN Gambar 4.1 Isolasi sel mononuklear (interfase) dari darah tepi menggunakan Ficoll-Paque ... 37

Gambar 4.2 Hasil PBMC sebelum MACS dan setelah MACS ... 38

Gambar 4.3 Hasil produk one step RT-PCR dengan primer β actin, FcγRIIa dan DNA ladder ... 42

xi

DAFTAR TABEL

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Tabel 2.1 Pembagian Fc-gamma Receptors ... 15

BAB III BAHAN dan METODE PENELITIAN

Tabel 3.1 Master Mix one step PCR yang digunakan dalam reaksi RT-PCR dengan primer

β

-actin dan FcγRIIa... 35

BAB IV HASIL dan PEMBAHASAN

LAMPIRAN Foto Alat

Timbangan mikro (Precisa) Mesin elektroforesis (BioRad)

51

Gel documentation tools G-Box Sentrifuge (Eppendorf)

(Syngene)

Vortexer (BioRad) Pipet mikro (BioRad)

RIWAYAT HIDUP

Nama : Jessie Theresia Caroline

NRP : 0510070

Tempat dan tanggal lahir : Bandung, 17 Maret 1987

Alamat : Jl. Holis Permai V no. 1

Riwayat Pendidikan :

• 1999, lulus SD Maria Bintang Laut, Bandung • 2002, lulus SLTP Santo Aloysius 2, Bandung • 2002-2004, siswa SMU Santo Aloysius 2, Bandung • 2005, lulus SMAK Trimulia, Bandung

1 menjanjikan untuk terapi berbagai penyakit seperti penyakit autoimun, penyakit keganasan, dan lain-lain. Oleh karena itu, dengan adanya stem cell menimbulkan harapan baru dalam pengobatan berbagai penyakit.

Stem cell adalah sel yang mempunyai kemampuan untuk membelah diri tanpa terspesialisasi. Dengan kata lain, stem cell mempunyai kemampuan untuk mereplikasikan diri dalam waktu yang tak terbatas dengan tetap tidak terspesialisasi untuk menjadi sel tertentu, dengan rangsangan dan kondisi tertentu, stem cell bisa menumbuhkan sel yang terspesialisasi. Ini berbeda dengan sel manusia lainnya di mana sel-sel itu sudah terspesialisasi sehingga sel-sel itu hanya bisa menjadi jaringan yang menjadi bagiannya dan tidak bisa menjadi sel lainnya (Wikipedia, 2008).

Sampai sekarang yang banyak diteliti oleh para ahli ialah stem cell yang diambil dari embrio (embryonic stem cell) yang terdapat pada blastosit dan stem cell yang diambil dari antara sel-sel somatis (somatic stem cell atau juga disebut adult stem cell) yang terdapat pada sumsum tulang, darah tali pusat, dan darah tepi. Namun tidak seperti embryonic stem cell, penelitian dan terapi pada adult stem cell tidak menimbulkan kontroversi. Hal ini dikarenakan pada adult stem cell, sampel diambil dari jaringan dewasa, bukan dari embrio manusia seperti pada embryonic stem cell (Wikipedia, 2008).

2

menghasilkan sel yang baik. Sampai saat ini, hematopoietic stem cell telah digunakan sebagai cell-based therapy berbagai penyakit (National Institute of Health, 2008).

Walaupun stem cell memiliki peranan yang penting dalam terapi berbagai penyakit, namun pengetahuan mengenai imunogenisitas dari stem cell, yakni Imunoglobulin G (IgG) masih perlu dikembangkan, juga hubungannya dengan Fc-gamma receptor (FcγR), dalam hal ini Fc-gamma receptor IIa (FcγRIIa).

Seperti telah kita ketahui sebelumnya bahwa FcγRIIa merupakan reseptor yang unik yang hanya terdapat pada manusia (Sardjono Caroline Tan, Mottram Patricia L., Hogarth P. Mark, 2003). FcγRIIa bersifat low affinity, karena memiliki afinitas yang rendah terhadap monomer IgG, namun berikatan kuat dengan kompleks IgG (van de Winkel J.G, Hogarth P. Mark, 1998).

Oleh karena itu, sangat penting untuk diketahui apakah FcγRIIa terdeteksi pada stem cell yang diisolasi dari darah tepi. Hal ini akan sangat menarik karena apabila FcγRIIa yang memiliki ikatan kuat dengan kompleks IgG terdeteksi pada stem cell yang diisolasi dari darah tepi, kita dapat mengetahui informasi yang sangat penting mengenai imunogenisitas dari stem cell, yaitu apakah dengan terapi dengan stem cell yang diisolasi dari darah tepi menyebabkan kompleks IgG dibersihkan sehingga menyembuhkan penyakit, atau malah menambah proliferasi dari sel-sel yang terinfeksi patogen sehingga memperberat suatu penyakit.

Berdasarkan latar belakang tersebut, diharapkan dalam penelitian ini dapat menyediakan pemahaman yang lebih terhadap gambaran imunogenisitas dari stem cell sehingga dapat digunakan untuk penelitian selanjutnya untuk kemajuan dalam bidang terapi dengan stem cell.

3

1.3 Maksud dan Tujuan Penelitian

Maksud Penelitian adalah untuk mengetahui imunogenisitas dari stem cell, yakni Imunoglobulin G (IgG), juga hubungannya dengan FcγRIIa.

Tujuan Penelitian adalah untuk mengetahui ada atau tidaknya FcγRIIa pada stem cell yang diisolasi dari darah tepi.

1.4 Manfaat Penelitian

Manfaat penelitian ini adalah sebagai dasar untuk penelitian selanjutnya yang berguna dalam terapi dengan stem cell yang diisolasi dari darah tepi.

1.5 Metode Penelitian

Desain penelitian ini adalah penelitian laboratorium eksperimental. Data yang digunakan dalam penelitian ini adalah data primer.

1.6 Lokasi dan Waktu

Lokasi Penelitian :

SCI (Stem Cell and Cancer Institute), Jakarta.

Laboratorium Mikrobiologi FK UKM (Fakultas Kedokteran Universitas Kristen Maranatha), Bandung.

Waktu Penelitian :

BAB V

KESIMPULAN dan SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil RT-PCR, terdeteksi adanya ekspresi FcγRIIa pada stem cell yang diisolasi dari darah tepi. Hal ini merupakan informasi yang mengindikasikan adanya interaksi antara stem cell yang diisolasi dari darah tepi dengan Imunoglobulin G melalui reseptornya yaitu FcγRIIa.

5.2 Saran

1.Penting dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui imunogenisitas dari stem cell, yakni interaksi antara Imunoglobulin G dengan FcγRIIa pada stem cell dari darah tepi.

47

DAFTAR PUSTAKA

Abbas, A.K., Lichtman, A.H., Pillai, S. 2007. Cellular & Molecular Immunology. 6th edition. Philadelphia: Saunders Lsevier.

Amersham Biosciences. 2001. Ficoll-Paque Plus: a learning guide. Fachschaft.biochemtech.uni-halle.de/downloads/chromatographyficoll.pdf. December 3rd, 2008. p. 5-7.

Anderson R. 2003. Manipulation of cell surface macromolecules by flaviviruses. Adv. Virus Res. 59: 229–74. http://en.wikipedia.org/wiki/Fc_receptor. February 13rd, 2008.

Bartlett & Stirling. 2003. A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: MethodsMolBiol.226:3-6. http://en.wikipedia.org/wiki/PCR. Desember 30rd, 2008.

BD Biosciences. 2000. Introduction of Flow cytometry: a learning guide. USA: BD Biosciences. p. 1.

Goebel S.U., Iwamoto M., Raffeld M., Gibril F., Hou W., Serrano J. et al. 2002. HER-2/new expression and gene amplification in gastrinoma: correlation with tumor biology, growth, aggressiveness. Cancer Research.

Hans R. Schöler. 2007. The Potential of Stem Cells: an inventory. England: Ashgate Publishing.

Joseph Sambrook and David W. Russel. 2001. Molecular Cloning: In vitro Amplification of DNA by the Polymerase Chain Reaction. 3rd edition. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Miltenyi Biotec. 2006. MACS Technology: Gold Standard in Cell Separation. http://www.miltenyibiotec.com/download.pdf. Oktober 17th, 2008.

National Academy of Sciences. 2003. Stem Cells and The Future of Regenerative Medicine. Washington DC: National Academy Press. p. 13, 16-17. 19-20.

48

Promega. 2006. Nucleic Acid Amplification. http://promega.com/download.pdf. November 15th, 2008. p. 1-3.

R&D systems. 2008. Stem Cell Markers. USA: R&D System.

Sardjono Caroline Tan, Mottram Patricia L., Hogarth P. Mark. 2003. The Role of FcγRIIa as an Inflammatory Mediator in Rheumatoid Arthritis and Systemic Lupus Erythematosus. Melbourne: Austin Research Institute. p. 374.

Sun P. 2003. Structure and function of natural-killer-cell receptors. Immunol Res 27 (2-3): 539–48. http://en.wikipedia.org/wiki/Fc_receptor. February 13rd, 2008.

Swanson J, Hoppe A. 2004. The coordination of signaling during Fc receptor-mediated phagocytosis. J Leukoc Biol 76 (6): 1093–103. http://en.wikipedia.org/wiki/Fc_receptor. February 13rd, 2008.

Van de Winkel J.G., Hogarth P. Mark. 1998. The Immunoglobulin Receptors and Their Physiological and Pathological Roles in Immunity. Boston: Kluwer Academic Publishers. p. 11, 13, 16-17, 95, 99-102, 159-160, 233, 267-271, 291-292.

Wynter E.A., Emmerson A.J.B., Testa N.G. 1999. Properties of Peripheral Blood and Cord Blood Stem Cells. Bailliere’s Clinical Haematology. p. 2.

http://cmgm.stanford.edu/biochem118/images/StemCellSlide/BlastocystsContainS tem.jpg. Oktober 24th, 2008.

http://en.wikipedia.org/wiki/Adult_stem_cell. Desember 17th, 2008.

http://en.wikipedia.org/wiki/Embryonic_stem_cell. Desember 17th, 2008.

http://en.wikipedia.org/wiki/Fluorescent-activated_cell_sorting#Fluorescence-49

http://users.ugent.be/avierstr/principles/pcr.html. July 15th, 2008.

http://www.nature.com/nrc/journal/v2/n11/images/nrc928-f1.jpg. Oktober 23rd, 2008.

http://www.pubmed.com/BLAST NCBI M90723. August 19th, 2008.