iv ABSTRAK
EKSPRESI FC γ RIIB YANG DIISOLASI DARI SEL PUNCA DARAH TALI PUSAT
Elvine, 2009 Pembimbing I : Caroline Tan Sardjono,dr., PhD Pembimbing II: DR. Susi Tjahjani,dr., M.Kes
Penggunaan sel punca sebagai cell based therapy akhir – akhir ini mulai banyak dilakukan. Sel punca merupakan sel yang mampu mereplikasi dirinya dengan cara beregenerasi, mempertahankan, dan menggantikan sel yang mengalami kerusakan. Sel punca dapat diperoleh dari berbagai sumber antara lain adalah dari darah tali pusat. Sel punca darah tali pusat memiliki beberapa keistimewaan, diantaranya yaitu daya imunogenisitas yang lebih rendah bila dibandingkan dengan sel punca sumsum tulang maupun sel punca dari darah perifer. Hal ini menyebabkan sel punca darah tali pusat memiliki tingkat risiko yang relatif rendah terhadap rejeksi pada tranplantasi secara alogenik. Namun sayangnya masih sedikit pengetahuan mengenai sifat imunogenitas dari sel punca darah tali pusat ini. Karakterisasi imunogenisitas sel punca akan menjadi informasi yang penting dalam menyusun strategi terapi dengan sel punca dalam mencegah reaksi rejeksi maupun pada pengobatan terapi penyakit auto imun.
Sistem imun merupakan suatu rangkaian yang terdiri dari banyak faktor. Dalam penelitian ini akan dideteksi adanya ekspresi reseptor antibodi imunoglobulin G yaitu FcγRIIb dari sel punca yang diisolasi dari darah tali pusat.
Sampel yang digunakan adalah mRNA dari sel punca darah tali pusat yang telah diseleksi terlebih dahulu dengan molekul penanda CD34. Amplikasi dilakukan dengan RT-PCR lalu dianalisa dengan elektroforesis.
Hasil penelitian dalam studi ini menunjukkan adanya amplikon FcγRIIb berupa band berukuran 541 bp pada analisis dengan elektroforesis yang mengindikasikan adanya ekspresi Fc γ RIIb pada sel punca darah tali pusat.
v ABSTRACT
EXPRESSION OF FcγRIIB ON UMBILICAL CORD BLOOD STEM CELLS
Elvine, 2009 Supervisor I : Caroline Tan Sardjono,dr., PhD Co-Supervisor: DR. Susi Tjahjani,dr., M.Kes
Utilization of stem cell as a cell-based therapy has been increasing lately. Stem cells are cells with a capability to replicate, regenerate, conserve, and to replenish damaged cells.
Stem cells can be isolated from several sources including umbilical cord blood. Umbilical cord blood stem cells have several advantages compared to stem cells from bone marrow or from peripheral blood. This, results in the less risk of rejection in the allogenic transplantation.
However, there has been very little known about the background of umbilical cord blood immunogenicity. Characterizations of stem cell immunogenicity will be important in determining a strategy to prevent rejection and also in the treatment of autoimmune diseases.
Immune system works as a network that involves many components. In this study, detection of the FcγRIIb expression a receptor for Immunoglobulin G, was conducted on umbilical cord blood stem cell.
Pre-selected stem cells from umbilical cord blood using CD34 as a marker was used to detect the presence of FcγRIIb mRNA. Amplification was done using RT_PCR assay and the analysis was done after the electrophoresis.
This study shown that there was FcγRIIb amplicon present as a band with size of 541bp after an analysis using electrophoresis. This result indicates the expression of FcγRIIb on umbilical cord blood stem cells.
Key words :
viii DAFTAR ISI
JUDUL i
LEMBAR PERSETUJUAN ii
SURAT PERNYATAAN iii
ABSTRAK iv
ABSTRACT v
KATA PENGANTAR vi
DAFTAR ISI viii
DAFTAR GAMBAR xi
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar belakang 1
1.2 Identifikasi Masalah 2
1.3 Maksud dan Tujuan 3
1.4 Manfaat karya tulis ilmiah 3
1.5 Kerangka Pemikiran dan Hipotesis Penelitian
1.5.1 Kerangka Pemikiran 3
1.5.2 Hipotesis penelitian 5
1.6 Metodologi penelitian 5
1.7 Lokasi dan Waktu 5
BAB II Tinjauan Pustaka
2.1 Sel Punca 6
ix
2.1.2 Sel Punca Dewasa 8
2.2 Sel punca dari darah tali pusat (Umbilical Cord Blood -UCB) 10
2.2.1 Pengambilan sampel UCB 12
2.3 FcR (Fc Receptor) 13
2.3.1 FcγRII (CD 32) 15
2.3.2 FcγRIIB 15
2.4 ITAM (Immunoreceptor Tyrosine based Activation Motif) 18 2.5 ITIM (Immunoreceptor Tyrosine based Inhibitory Motif) 19
2.6 CD 34+ 20
2.7 Ficoll 22
2.8 MACS 23
2.9 Flow cytometry 23
2.10 PCR (Polymerase Chain Reaction) 24
2.11 RT-PCR (Reverse Transcription- Polymerase Chain Reaction) 28
BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Objek penelitian 31
3.2 Metode penelitian 31
3.3 Alat dan Bahan
3.3.1 Alat 31
3.3.2 Bahan 32
3.4 Cara Kerja
3.4.1 Isolasi sel MN darah tali pusat 34 3.4.2 Pemisahan sel CD 34+ dengan MACS 34
3.4.2.1 Proses Magnetic Labeling 34
x
3.4.3 Flowcytometry Assay 35
3.4.4 Isolasi mRNA 36
3.4.5 Amplifikasi cDNA dnegan primer FcγRIIB dan β Actin 37 3.4.6 Elektroforesis dan visualisasi 38
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Isolasi MNC 39
4.2 Seleksi sel dengan Mini MACS 40
4.3 Isolasi mRNA 41
4.3.1 Deteksi ekspresi mRNA FcγRIIB pada UCB 42
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan 46
5.2 Saran 46
DAFTAR PUSTAKA 47
xi DAFTAR GAMBAR
GAMBAR 2.1 Proses pengkulturan sel punca embrionik...6
GAMBAR 2.2 Gambar struktur FcγRIIB manusia secara keseluruhan...16
GAMBAR 2.3 Gambar dari komplek FcγR-IgG...17
GAMBAR 3.1. Perangkat MACS... 34
GAMBAR 3.2. Perangkat FACS...36
GAMBAR 4.1. Isolasi MNC dengan menggunakan metode densitas gradient...40
GAMBAR 4.2. UCB sebelum dan sesudah MACS...41
GAMBAR 4.3 Visualisasi hasil one step RT-PCR pada gel agarosa 2.5%...43
GAMBAR 4.4 Visualisasi hasil one step RT-PCR primer β actin... 44
GAMBAR 4.5 Visualisasi hasil PCR DNA yg dirun dengan primer FcγRIIA dan hasil one step PCR primer RNA UCB dan PB ...45
RIWAYAT HIDUP
Nama : Elvine
Nomor Pokok Mahasiswa : 0510145
Tempat dan Tanggal Lahir : Bandung, 14 April 1986
Alamat : Komplek Banceuy Permai Bp 16
Riwayat Pendidikan :
SD Santo Yusuf I, Bandung, 1999
SMP Santo Aloysius, Bandung, 2002
SMA Santo Aloysius, Bandung, 2005
Karya Tulis Yang Pernah Dibuat :
o Perbandingn Prevalensi DHF ( Dengue Hemorrhagic Fever) di Kota
1 BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Sel punca sendiri merupakan sel yang mampu mereplikasi dirinya dengan cara beregenerasi, mempertahankan, dan replacing akhir diferensiasi sel. (Perin, 2006). Penelitian mengenai sel punca meningkat ketika kultur sel punca embrionik pertama kali berhasil dilakukan oleh James Thomson dari Universitas Wisconsin – Madison pada tahun 1998. SemEnjak itulah berbagai penelitian mengenai sel punca yang potensial untuk mengobati berbagai penyakit degeneratif dan luka banyak dilakukan (Thomson et al., 1998).
Berbagai jenis penyakit dan luka dapat menjadi target potensial untuk pengobatan dengan menggunakan sel punca. Penyakit – penyakit tersebut antara lain penyakit kardiovaskuler, penyakit auto imun, diabetes, osteoporosis, kanker, penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson, luka bakar berat, cedera tulang, defek lahir (Perry,2000).
Sumber sel punca yang sering digunakan dalam terapi adalah sel punca dewasa yaitu yang berasal dari sumsum tulang, darah, otak, kulit, jaringan mesodermal, hati atau pun dari sel punca fetus yaitu sel punca saraf (neural stem cells), sel punca hematopoietik, dan pancreatic islet progenitors (National Research Council, 2002).
Selama lebih dari 30 tahun penggunaan Umbilical Cord Blood (UCB) allogenik sebagai alternatif transplantasi hematopoietik. Sebelumnya UCB merupakan bagian dari proses melahirkan yang dianggap tidak berguna dan biasanya dibuang. Tetapi sekarang UCB secara rutin disimpan untuk transplantasi. UCB memiliki berbagai keuntungan, di antaranya mudah didapatkan , tidak ada resiko terhadap donor transplantasi, tidak ada attrition terhadap donor, kemungkinan transmisi infeksi yang lebih kecil. (Storms, 2007) .
5
pro infalmasi sel T-helper1 (Th1), meningkatkan respon anti inflamasi T-helper2 (Th2) (Vendrame, 2004).
FcR(Fc receptor) adalah protein yang ditemukan pada permukaan sel tertentu dan pada beberapa sel yang memiliki sifat protektif dari sistem imun. FcR terikat pada antibodi yang akan menempel pada sel yang terinfeksi atau mengandung patogen Reseptor Fcγ terekspresi pada sel hematopoietik (contoh : neutrofil, makrofag, sel mast, limfosit B, maupun platelet) dan sering kali FcγRII adalah satu-satunya reseptor Fcγ yang terekspresi pada sel hematopoietik
Sejumlah penelitian menunjukkan bahwa FcγRIIB yang terdapat pada sel B dapat menghambat produksi antibodi pada peristiwa respon imun in vivo. Pada penelitian in vitro ditemukan bahwa FcγRIIB tidak hanya memberikan efek negatif terhadap B cell Receptor (BCR) yang memediasi pengaktifan sel B tetapi juga T cell Receptor (TCR) yang memediasi aktivasi sel T dan FcR yang memediasi aktivasi sel T. FcγRIIB muncul sebagai general negative corereceptor untuk semua reseptor yang proses pengaktifan sel nya tergantung pada ITAMs (Daero et al, 1998).
Pengetahuan mengenai sifat imunogenitas dari sel punca darah tali pusat ini masih sangat kurang, padahal karakterisasi imunogenisitas sel punca akan menjadi informasi yang penting dalam menyusun strategi terapi dengan sel punca dalam mencegah reaksi rejeksi maupun pada pengobatan terapi penyakit auto imun.
1.2 Identifikasi Masalah
Apakah sel punca pada Umbilical Cord Blood mengekspresikan molekul
5
1.3 Maksud dan Tujuan
1.3.1 Maksud
Maksud dari penelitian ini adalah untuk melihat adanya interaksi antara sel punca darah tali pusat dengan IgG melalui reseptornya,
1.3.2 Tujuan
Tujuan dari karya tulis ilmiah ini adalah untuk mendeteksi ekspresi reseptor IgG dengan fungsi inhibisi yaitu FcγRIIb pada sel punca yang diambil dari darah tali pusat.
1.4 Manfaat Karya Tulis Ilmiah
Karya tulis ini diharapkan dapat dijadikan penelitian pendahuluan bagi para peneliti selanjutnya dalam melakukan penelitian lebih lanjut mengenai interaksi antara sel punca dengan antibodi (Immunoglobulin G- IgG) melalui reseptor Fc γ yang dapat memberikan pengetahuan lebih lanjut mengenai karakteristik imunogenisitas darah tali pusat sehingga dapat membantu dalam penyusunan strategi cell-based therapy.
1.5 Kerangka pemikiran dan hipotesis
1.5.1 Kerangka pemikiran
5
Penggunaan klinis sel punca yang sekarang ini sering digunakan adalah penggunaan sel punca yang berasal dari darah darah tali pusat sebagai terapi penyakit autoimun. Penyakit autoimun disebabkan oleh pembentukan antibodi yang menyerang komponen seluler sendiri (NIH, 2008). Darah tali pusatmemiliki beberapa keuntungan dalam penggunaannya. Di antaranya adalah minimnya resiko dari GvHd (Graft versus Host Dissease) ( Storms 2007).
Sistem imun merupakan suatu rangkaian yang terdiri dari banyak faktor. IgG adalah antibodi yang yang muncul dalam jumlah banyak pada serum serta bekerja pada beberapa tipe sel. Reseptor IgG memiliki 2 kelas fungsional yaitu reseptor yang memiliki sifat mengaktifkan (Activated receptor) dan reseptor yang memiliki sifat menghambat (Inhibitor receptor).
Pengetahuan mengetahui mekanisme yang memberikan feed back negatif terhadap produksi antibodi atau immunotherapy untuk orang yang menderita penyakit alergi mengarah kepada daerah intra seluler dari FcγRIIb yaitu ITIM (Immunoreceptor tyrosine-based Inhibitory Motif) yang diperlukan untuk pengaturan negatif reseptor yang mengandung ITAM ( Immunoreceptor tyrosine-based Activation Motif ) (Fridman, 1998). Penelitian Chan menunjukkan bahwa
molekul FcγRIIb pada sel B terikat di bagian Fc antibodi dan membentuk co-crosslinking antara reseptor antigen dan FcγRIIb melalui anti-antibodi IgG. Dari peneliitian ini Chan menyatakan bahwa FcγRIIb dapat menghambat produksi antibodi in vivo ( (Takai, 1998)
5
1.5.2 Hipotesis
Ditemukan adanya ekspresi FcγRIIb pada sel punca yang diisolasi dari darah tali pusat.
1.6 Metodologi penelitian
Desain penelitian ini adalah penelitian eksperimental.
Data yang digunakan dalam penelitian ini adalah data primer.
1.7 Lokasi dan Waktu
Lokasi Penelitian :
SCI (Stem Cell and Cancer Institute), Jakarta. Waktu Penelitian :
BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa sel punca yang diisolasi dari darah tali pusat mengekspresikan FcγRIIB.
5.2 Saran
Setelah ditemukan adanya ekspresi FcγRIIB yang bersifat inhibisi pada darah tali pusat, perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang interaksi antara hematopoietic stem cell (HSC) yang disolasi dari darah tali pusat dengan
immunoglobulin G. Walaupun telah ditemukan adanya ekspresi FcγRIIB,
pengetahuan mengetahui jalur inhibisi counter balancing masih kurang. Dengan adanya penelitian ini diharapkan akan memberikan informasi yang penting mengenai imunogenisitas sel punca terutama dalam pemilihan strategi cell-based
therapy yang berhubungan dengan imunitas tubuh ( aitu terapi penyakit auto imun
47
DAFTAR PUSTAKA
Ballen K.K. (2005) New trends in umbilical cord blood transplantation. Blood. 105. 3786-3792
Barker J.N, Weisdorf D.J, De T.E.F, Blazar B.R, Miller, J.S, Wagner J.E. (2003). Rapid and complete donor chimerism in adult recipients of unrelated donor umbilical cord blood transplantation after – reduced – intensity conditioning. Blood. 102. 1915 – 1919. inflammatory mediator in rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus. Immunology and Cell Biology. 81. 374- 381.
Fridman W,H. (1998) Introduction to the field. The immunoglobulin Receptors and their Physiological an Pathological Rolesin immunity. 1-6.
Fridman W. (1991) Fc receptors and immunoglobulin inding factors. FASEB Journal.5. 2684-90.
Geng Y. J. (2006) The basics of embryonic stem cells in comparison to adult stem cells. An essential guide to cardiac cell therapy. 13-21.
Gluckman E., Rocha V., Arcese W., Michel G., Sanz G., Chan K.W., Takahashi T. A.,Ortega J., Filipovich A., Locatelli F., Asano S., Fagioli F., et al. (2004). Factorsassociated with outcomes of unrelated cord blood transplant: Guidelines for donor choice. Exp. Hematol. 32, 397–407.
48
Matsuda M, Park J.G, Wang D.C, Hunter S, Chien P, Schreiber A.D. (1996). Abrogation of the Fcγ Receptor IIA-mediated phagocytic signal by stem-loop Syk antisense oligonucleotides. Molecular Biology of the Cell, 7, 1095-1106.
Miltenyl Biotec ( 2006). HandBook of CD 34 MicroBead Kit. 1-4.
Moise K.J. (2005).Umbilical cord stem cells. American college of obstreticans and gynecologists. 106. 1393 – 1407.
Montarras, D., Pinset, P., Chelly, J., Kahn. A, ( 1994). RT-PCR and Gene expression The polymerase chain reaction. Blood. 25.277 - 313 .
Perin E.C, Silva,G.V. (2006). What are stem cells and what do they do. An essential guide to cardiac cell therapy. 1-12.
Repp R, Winkel J,G,G ( 1998) FcR and autoimmunity. The immunoglobulin Receptors and their Physiological an Pathological Roles in immunity. 233-246.
SIGMA ( 2005) . One step RedTaq TM RT-PCR Kit. 1-3.
SIGMA. HandBook of GenElute TM Direct mRNA Miniprep Kit. 1-6
Sondermann P. ,Huber R. ,Jacob U. (1999). Crystal structure of the soluble form of the human Fcγ-receptor IIb: a new member of the immunoglobulin superfamily at 1.7 Å resolution. The EMBO Journal. 18;5, 1095–1103.
Storms R.W. (2007) Defining Progenitors Based on Their Expression of Aldehyde Dehydrogenase. Imperial Colllege Press.2. 1-15.
Storms W.R. (2007) Defining progenitors based on thier expression of aldehyde dehydogenase. Stem cell repair and regeneration.ed.2. 1-17.
Takai T, Ravetch J.V (1998) Fc Recceptor genetics and the manipulation of Genes in the study of FcR biology. The immunoglobulin Receptors and their Physiological an Pathological Roles in immunity. 37-45.
