BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Kimia Hasil Hutan Fakultas Kehutanan Institut Pertanian Bogor, Pusat Studi Biofarmaka Institut Pertanian Bogor dan Unit Kandang Hewan Coba Departemen Biokimia Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor. Penelitian dilaksanakan selama enam bulan dimulai dari bulan Desember 2011 sampai dengan bulan Mei 2012.
3.2 Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan adalah daun, kayu teras, kayu gubal dan kulit bagian dalam (inner bark) pohon Surian (Toona sinensis Roemoer) berumur ± 7 tahun dengan tinggi ± 8 m dan diameter 21 cm yang diperoleh dari daerah Ciapus, Bogor, Jawa Barat. Untuk memastikan kebenaran jenis pohon yang digunakan, bagian daunnya diidentifikasi di Herbarium Bogoriense LIPI Cibinong. Hewan coba yang digunakan adalah mencit galur DDY jantan umur 2 bulan. Bahan lain yang digunakan adalah aquades, etanol, DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil), asam askorbat (vitamin C), pakan mencit dan agar-agar.
Alat-alat yang digunakan adalah alat penyulingan minyak atsiri, alat serut kayu, golok, alat timbang, oven, panci, spektrofotometer UV-vis, plat uji antioksidan, peralatan gelas (gelas piala, gelas ukur, pipet, cawan petri, pot kecil), baskom, kompor gas, sonde, kandang mencit dan toples.
3.3 Rancangan Percobaan dan Analisis Data 3.3.1 Kadar Ekstrak dan Aktivitas Antioksidan
Rancangan percobaan dalam penelitian ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) faktorial dengan 2 faktor, yaitu faktor A (bagian pohon Surian dengan 4 taraf yaitu kayu teras, kayu gubal, daun, dan kulit) dan faktor B (metode ekstraksi dengan 2 taraf yaitu penyulingan dan perebusan) dengan 3 kali ulangan untuk rendemen dan 7 kali ulangan (konsentrasi) untuk nilai inhibisi. Model
rancangan percobaan statistik yang akan digunakan dalam penelitian adalah sebagai berikut :
Yijk = μ + αi + βj + (αβ)ij+ εijk
Dimana : i = kayu teras, kayu gubal, daun, kulit; j = penyulingan, perebusan; k = 1, 2, 3, dst
Yijk = Nilai pengamatan pada bagian Surian ke-i, metode ekstraksi ke-j, dan ulangan ke-k.
μ = Rataan umum
αi = Pengaruh utama bagian Surian
βj = Penngaruh utama metode ekstraksi
ε(ijk) = Pengaruh acak yang menyebar normal (0,σε2)
Pengolahan data pada penentuan kadar zat ekstraktif dilakukan dengan Microsoft Excel 2007 dan Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) 16.0 for Windows. Perlakuan yang dinyatakan berpengaruh terhadap respon dalam analisis sidik ragam, kemudian diuji lanjut dengan menggunakan Duncan Multiple Range Test (DMRT).
3.3.2 Sifat Organoleptik
Hasil uji organoleptik diolah dengan menggunakan Kruskal-Wallis Test dan uji lanjut Dunn.
3.4 Metode Penelitian
3.4.1 Persiapan Bahan Baku
Daun dipisahkan dari tangkainya dan dirajang kasar, kemudian ditimbang sebanyak 4,5 kg untuk satu kali penyulingan. Kulit dipisahkan antara kulit luar (outer bark) dan kulit dalam (inner bark). Bagian kulit yang digunakan adalah bagian dalam (inner bark). Kulit dirajang hingga ukuran 1-2 cm, kemudian ditimbang sebanyak 1,5 kg untuk satu kali penyulingan. Teras dan gubal dipisahkan menggunakan mesin serut, sehingga dapat diperoleh hasil berupa kayu serutan dengan panjang 1-4 cm, lebar 1-2 cm dengan tebal 1-5 mm, selanjutnya ditimbang sebanyak 1,5 kg untuk satu kali penyulingan.
3.4.2 Preparasi Contoh Uji berupa Ekstrak
Contoh uji dalam penelitian ini merupakan ekstrak yang berasal dari residu penyulingan, yaitu limbah cair penyulingan dan air rebusan dari ampas padatan penyulingan. Penyulingan dan perebusan pada setiap bagian pohon dilakukan dengan tiga kali ulangan, tetapi untuk pengujian (antioksidan, toksisitas akut dan tingkat kesukaan masyarakat) ketiga ekstrak pada pengulangan di campur, sehingga tidak ada ulangan pada saat pengujian ekstrak.
3.4.2.1 Penyulingan
Bahan baku yang sudah siap selanjutnya dimasukkan dalam alat penyulingan. Proses penyulingan menggunakan metode air dan uap, yaitu menggunakan air kemudian dipanaskan sehingga menghasilkan uap air yang panas dilakukan selama 12 jam. Residu hasil penyulingan berupa cairan berwarna merah kecoklatan (kayu), hijau kecoklatan (daun) dan coklat kehitaman (kulit kayu) yang terdapat di dalam ketel suling diukur volumenya dan dikeringkan di dalam oven hingga diperoleh padatan. Padatan ini kemudian diuji aktivitas antioksidannya, toksisitas akut dan tingkat kesukaan masyarakat.
3.4.2.2 Perebusan
Residu penyulingan berupa ampas (daun, kulit, gubal dan teras) direbus menggunakan air aquades selama dua jam. Air rebusan diukur volumenya dan dikeringkan di dalam oven hingga diperoleh padatan.
3.4.3 Penentuan Rendemen
Rendemen ekstrak yang dihasilkan dari proses penyulingan dan perebusan yang telah dikeringkan dengan oven dihitung dengan menggunakan rumus:
Keterangan: Output = berat ekstrak (g)
Input = berat kering tanur bahan baku (g) Rendemen = (Output/Input) x 100%
3.4.4 Uji Antioksidan
Uji antioksidan menggunakan metode DPPH (Leu et al. 2006). Ekstrak dilarutkan dalam etanol (1mg ml-1) dan larutan yang diperoleh dijadikan sebagai larutan induk (konsentrasi 1.000 μg ml-1). Larutan ekstrak dibuat dengan mengencerkan larutan induk dengan etanol. Banyaknya larutan induk yang digunakan bergantung pada konsentrasi larutan ekstrak yang diinginkan. Nisbah larutan ekstrak dengan larutan DPPH dalam pengujian ini adalah 1:1.
Gambar 1 Plat uji antioksidan.
Total larutan dalam wadah uji adalah 200 μl yang terdiri atas larutan ekstrak sebanyak 100 μl dan 100 μl larutan DPPH (125 μM dalam etanol). Pemberian larutan ekstrak 1.000 μg ml-1 akan menghasilkan konsentrasi ekstrak dalam wadah uji sebesar 500 μg ml-1. Kontrol negatif dibuat dengan mencampurkan 100 μl etanol dengan 100 μl larutan DPPH. Asam askorbat (vitamin C) digunakan sebagai kontrol positif antioksidan dengan konsentrasi perlakuan yang sama dengan ekstrak uji. Setelah homogen, wadah uji yang berisi larutan tersebut diinkubasi dalam tempat gelap selama 30 menit dan diukur serapan cahayanya dengan spektrofotometer UV-vis pada λmaks 517 nm. Aktivitas antioksidan ditentukan dengan menghitung persen penangkapan radikal bebas DPPH oleh ekstrak dengan rumus :
Keterangan : A : serapan kontrol negatif (DPPH + etanol)
B : serapan ekstrak uji (DPPH +etanol+ ekstrak uji). % Penangkapan radikal = {(A-B)/A} x 100%
Korelasi antara persen penangkapan radikal dan konsentrasi ekstrak diplotkan dan nilai IC50 dihitung melalui persamaan regresi hasil interpolasinya. IC50 adalah konsentrasi efektif ekstrak yang mampu menangkap (menurunkan) konsentarsi radikal bebas DPPH sebesar 50%, sehingga nilai IC50 (inhibition concentration) yang semakin rendah berarti aktivitas antioksidan ekstrak semakin tinggi.
3.4.5 Uji Toksisitas Akut (OECD 2001)
Mencit percobaan diadaptasikan selama dua minggu (untuk menghindari resiko timbulnya gangguan stress) dan ditimbang bobot badannya (BB). Dalam penentuan LD50 akan digunakan 3 kelompok dosis, yaitu kontrol (hanya di cekok aquades), 2.000 mg/kg BB dan 5.000 mg/kg BB. Satu kelompok dosis menggunakan 10 ekor mencit. Semua hewan pada setiap kelompok hanya menerima ekstrak satu kali untuk setiap dosis yang telah ditentukan (dosis tunggal), lalu hewan diamati dan dicatat tingkat kematiannya pada 24 jam pertama untuk memperoleh LD50. Pengamatan dilanjutkan hingga hari ke 7 (Lu & Kacew 2006), pengamatan meliputi gejala klinis seperti nafsu makan, bobot badan, keadaan mata dan bulu serta tingkah laku.
(a) (b) Gambar 2 (a) pencekokan ekstrak, (b) kandang sekat.
Penentuan LD50 (metode Reed-Muench) didapatkan berdasarkan rumus-rumus berikut :
Keterangan : P.D (Proportional Distance) = jarak proporsional
P (Propotional) = proporsionasi peningkatan dosis
3.4.6 Uji Tingkat Kesukaan Masyarakat
Uji tingkat kesukaan masyarakat (organoleptik) meliputi uji mutu hedonik dan uji hedonik (kesukaan). Uji organoleptik meliputi warna, aroma, rasa dan tekstur. Uji hedonik dan mutu hedonik dilakukan dengan 7 skala kesukaan dengan 17 orang panelis agak terlatih yaitu mahasiswa dan pegawai yang dipilih secara acak (Soekarto 1985 dalam Weningytyas 2009, Kartika 1988, Askar 2005). Sample uji organoleptik berupa agar-agar yang telah diberi ekstrak. Jumlah sample per panelis yaitu 4 buah, terdiri dari kontrol, ekstrak ST, SD dan RD. Penilaian terhadap kesukaan berdasarkan skor (1) sangat suka, (2) suka, (3) agak suka, (4) netral, (5) agak tidak suka, (6) tidak suka, (7) sangat tidak suka. Data yang dihasilkan selanjutnya akan diolah secara statistik (Purba 2003).
Gambar 3 Uji organoleptik.
P.D = % %
% %
P = log
Dosis
