UJI KUALITATIF PROTEIN
NAMA
:
NIM
:
KELAS
:
KELOMPOK
:
ASISTEN
:
JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
BAB IV
UJI KUALITATIF PROTEIN
TUJUAN :
Mengetahui prinsip dasar uji kualitatif protein
Mengetahui perbedaan prinsip dari masing-masing metode
A. Pre-lab
1. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode ninhidrin?
Prinsip analisis protein dengan ninhidrin yaitu mengidentifikasi adanya protein dalam suatu bahan dimana asam amino bebas (asam amino dimana gugus aminonya tidak terikat) akan bereaksi dengan ninhidrin dan membentuk senyawa kompleks berwarna ungu. Reaksi dinyatakan positif jika terjadi perubahan warna larutan sampel menjadi ungu, dan reaksi dinyatakan negatif jika tidak terjadi perubahan warna. Reaksi ninhidrin harus didahului oleh reaksi hidrolisis protein, ninhidrin ditambahkan pada dalam larutan dan kemudian larutan tersebut dipanaskan. Terjadi 2 tahap yaitu reaksi pembentukan warna dan reaksi pembentukan ninhidrin tereduksi. Warna yang terbentuk adalah warna ungu sampai biru yang dikenal dengan kompleks ruhemann (Wallace, 2008).
2. Bagaimana prinsip analisis protein dengan metode biuret?
Prinsip penentuan kadar protein dengan metode biuret adalah menganalisis adanya ikatan peptida dengan cara menambahkan reagen biuret kedalam sampel yang kemudian diukur absorbansinya. Ion Cu2+ pada reagen akan bereaksi dengan ikatan peptida yang berada pada sampel suasana basa membentuk senyawa kompleks yang memiliki warna ungu. Reaksi akan menunjukan hasil positif apabila sampel mengandulng 2 ikatan peptida atau lebih, dan akan menunjukan hasil negatif jika diujukan pada asam amino bebas. Intensitas warna yang terbentuk bergantung pada jumlah iktan peptida yang terdapat pada sampel, jika semakin banyak jumlah ikatan peptida maka warna senyawa kompleks yang dihasilkan akan semakin gelap/pekat (Nigam, 2007).
3. Mengapa pengujian protein selalu dilakukan pada kondisi alkali/basa?
B. Tinjauan Pustaka 1. Protein
Protein merupakan persenyawaan kompleks yang dihasilkan dari polimerisasi asam asam amino yang terikat satu sama lain melalui ikatan peptide(-CO-NH-). Protein merupakan senyawa yang sangat penting dalam sistem kehidupan karena protein memainkan peran yang sangat vital dalam semua aktivitas sel-sel tubuh makhluk hidup. Protein tersusun beberapa atas asam amino yang terikat dalam rantai lurus yang disebut ikatan peptida. Ada dua jenis protein yaitu protein sederhana dan protein kompleks. Protein memiliki karakteristik sebagai katalis biokimia, pengukur pergerakan, penunjang mekanisme tubuh dan pengendali pertumbuhan (Ash, 2010).
2. Uji ninhidrin
4. Fungsi reagen: 4.1 Reagen ninhidrin
Semua asam amino dan peptida yagn mengandung gugus α-amino bebeas memberikan reaksi ninhidrin positif dengan menunjukkan reaksi terbentuknya warna biru sampai ungu. Khusus untuk asam amino prolin dan hidroksi prolin akan terbentuk warna kuning. Senyawa ninhidrin bersifat korosif sehingga bahaya jika tertelan, menyebabkan iritasi kulit, mata, serta pernafasan Reagen ninhidrin berfungsi sebagai suatu oksidator yang sangat kuat sehingga menyebabkan terjadinya dekarboksilasi oksidatif asam α-amino yang menghasilkan senyawa aldehid (Ishanda, 2014).
(Kristianti, 2009).
4.2 Reagen biuret
Reagen biuret yang mengandungCuSO4 yang terurai menjadi ion Cu2+. Ion tersebut kemudian akan bereaksi dengan ikatan peptida membentuk senyawa kompleks. Jadi, secara garis besar reagen biuret berfungsi sebagai membentuk senyawa kompleks sehingga kandungan dalam sampel dapat diidentifikasi (Machin, 2012).
(Machin, 2012).
5. Tinjauan bahan: 5.1 Gelatin
Gelatin tinggi akan kadar protein khususnya asam amino dan rendahnya kadar lemak. Gelatin kering mengandung kira-kira 84 – 86 % protein, 8 – 12 % air dan 2 – 4 % mineral. Gelatin mengandung 9 asam amino essensial, satu asam amino essensial yang hampir tidak terkandung dalam gelatin yaitu triptofan (Chapman, 2007). .
5.2 Susu skim
Susu skim atau biasa disebut dengan susu non fat. Susu skim adalah susu yang memiliki kadar lemak yang telah dikurangi hingga batas maksimal. Susu skim mengandung semua kandungan susu murni kecuali lemak dan vitamin yang larut dalam lemak (Ishanda, 2014).
(Kristianti, 2009).
5.3 MSG
MSG adalah garam sodium dari glutamat. Komposisi monosodium glutamate adalah natrium 12 %, glutamate 78 % dan air 10 %. Sehingga MSG adalah unsur nutrisi bukan unsur kimia berbahaya. MSG diperoleh melalui proses fermentasi dari bahan tetes tebu atau pati-patian (Arisman, 2008).
(Arisman, 2008).
5.4 Aspartam
Aspartam memiliki rumus struktur C14H18N2O5 tergolong pada zat pemanis buatan. Tingkat kemanisan yang dimiliki aspartam 200 kali lebih manis dari pada sukrosa. Aspartam mudah terhidrolisis dan mengalami reaksi kimia. Bila terhidrolisis maka aspartam akan kehilangan rasa manisnya (Kristianti, 2009).
C. Diagram Alir
1. Uji Ninhidrin
Dimasukkan dalam air mendidih selama 15-20 detik
Diamati warna larutan
2. Uji Biuret
Dimasukkan dalam tabung reaksi
Dikocok
Diamati perubahan warna Tabung Reaksi
2ml larutan sampel 2ml larutan ninhidrin
Hasil
3ml larutan sampel
1ml NaOH 10%
1-3 tetes Cu2SO4 0,1%
D. Hasil Percobaan Dan Pengamatan
1. Uji Ninhidrin
No. Sampel Sebelum Pemanasan Sesudah Pemanasan Hasil uji 1 Susu Skim Putih keruh Terjadi perubahan warna
menjadi keunguan di bagian
atas larutan +
2 MSG Bening agak keruh susu Terjadi perubahan warna
menjadi ungu pekat +++ 3 Aspartam Keruh kekuningan Terjadi perubahan warna ungu
pekat, di bawah terdapat
endapan ++ 4 Gelatin Putih susu, ada endapan Tidak terjadi perubahan warna
-Tujuan pada uji ninhidrin adalah mengetahui adanya asam amino bebas dalam sampel dapat diketahui dari terbentuknya kompleks warna ungu.
Prinsip pada uji ninhidrin ini adalah menguji ada tidaknya protein dalam suatu senyawa dengan menambahkan reagen ninhidrin untuk mengetahui jumlah asam amino bebas yang terkandung dalam suatu zat. Adanya reaksi antara ninhidrin dengan asam amino sehingga membentuk CO2, H2O, aldehid dan kompleks warna ungu (Harmata, 2009).
Mekanisme reaksi ninhidrin jika ditambah asam amino mengakibatkan ninhidrin tereduksi serta menghasilkan NH3. Sedangkan karbondioksida dan gugus aldehidnya lepas ke lingkungan. Kemudian ninhidrin tereduksi dan NH3 ditambah ninhidrin baru diproses secara kondensasi menghasilkan garam diketo-hydrihalide-diketo-hydramine yang membentuk senyawa kompleks warna ungu (Bruckner, 2012).
Analisis Hasil
Berdasarkan data hasil pengamatan, pada sampel pertama, susu skim, warna yang teramati sebelum pemanasan adalah putih keruh. Setelah dilakukan pemanasan selama 20 detik, warna yang terbentuk menjadi keunguan di bagian atas larutan, sehingga dapat dikatakan sampel hasil uji positif. Pada sampel MSG, sebelum pemanasan warna sampel bening agak keruh susu, tetapi setelah pemanasan sampel berubah warna menjadi ungu pekat, sehingga dapat dikatakan sampel hasil uji positif. Pada sampel aspartam, sebelum pemanasan, sampel berwarna keruh kekuningan, tetapi setelah pemanasan warna berubah menjadi ungu pekat dan terdapat endapan sehingga hasil uji sampel positif. Pada sampel keempat, gelatin, warna yang teramati sebelum pemanasan adalah putih susu dan terdapat endapan setelah pemanasan tidak terjadi perubahan warna. Sehingga dapat dikatakan hasil uji sampel negatif.
Pada sampel pertama, susu skim, hasil ujinya positif. Hal ini tidak sesuai dengan literatur. Susu skim mengandung protein yang sedikit kompleks, sehingga tidak lagi mengandung asam amino bebas (Lundblad, 2014). Tetapi pada percobaan kali ini diperoleh warna ungu yang menandakan bahwa larutan tersebut positif. Pada literatur lain mengatakan bahwa pada susu skim yang semula berwarna putih keruh setelah dipanaskan terdapat berwarna keunguan. Protein yang dikandung oleh susu skim adalah kasein, albumin dan globulin. Asam amino bebas berasal dari protein albumin yaitu glutamin dan trisin (Krull, 2007).
Pada sampel kedua, MSG, hasil uji ninhidrinnya positif yang ditunjukkan dengan terbentuknya kompleks warna ungu pekat. Hasil uji yang didapat juga sudah sesuai dengan literatur. MSG hanya mengandung satu asam amino yang terkristalisasi yaitu asam glutamat. Sehingga hasil uji sangat positif dan warna yang dihasilkan juga sangat pekat (Krull, 2007).
Berbeda dengan sampel ketiga, aspartam, aspartam juga menunjukkan hasil positif, namun kompleks warna ungu yang terbentuk tidak sepekat pada MSG. Hasil yang didapat juga sudah sesuai dengan literatur. Aspartam tersusun dari 2 macam asam amino yaitu asam aspartat dan fenilalanin. Gugus amina yang bebas terdapat pada salah satu gugus asam aspartat. Namun karena kandungan asam aminonya lebih banyak dibanding MSG, kompleks warnanya juga berupa ungu muda (Simanjutak, 2009).
2. Uji Biuret
No. Sampel Sebelum ditambah reagen Sesudah ditambah reagen
Hasil uji 1 Susu skim Putih keruh Terdapat perubahan
warna menyerupai cincin
ungu +
2 MSG Bening agak keruh susu Tidak terjadi perubahan
warna
-3 Gelatin Keruh kekuningan Terdapat cincin ungu
++ 4 Aspartam Putih susu, ada endapan Tidak terjadi perubahan
warna
-Tujuan pada uji biuret ini adalah mengetahui adanya ikatan peptida dalam suatu protein tertentu
Prinsip dari uji biuret ini adalah mengetahui adanya protein berdasarkan ikatan peptida di dalam suatu senyawa dengan menambahkan reagen CuSO4 ke dalam senyawa yang sudah diberi suasana basa oleh NaOH
Mekanisme reaksi pada uji biuret adalah senyawa yang mengandung gugus amina asam (–CONH2) yang bersama gugus amida asam yang lain terbentuk dari larutan protein yang dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Reaksi biuret merupakan reaksi warna untuk peptida dan protein. Suatu peptida yang mempunyai dua buah ikatan peptida atau lebih dapat bereaksi dengan ion Cu2+ dalam suasana basa membentuk senyawa kompleks berwarna ungu (Poedjiadi, 2011).
Analisa Hasil
Berdasarkan data hasil pengamatan, pada sampel pertama, susu skim, warna sebelum ditambahkan reagen biuret dan setelah ditambahkan berbeda. Sebelum ditambahkan reagen biuret, sampel berwarna putih keruh, namun setelah ditambahkan biuret, terbentuk cincin ungu sehingga ujinya positif. Pada sampel kedua, MSG, sebelum ditambahkan reagen biuret, sampel berwarna bening, namun setelah ditambahkan reagen biuret, tidak terjadi perubahan warna. Pada sampel ketiga gelatin, sebelum ditambahkan reagen sampel berwarna keruh kekuningan. Setelah ditambahkan reagen biuret, terbentuk cincin berwarna biru ungu. Pada sampel keempat aspartam, sebelum ditambahkan reagen berwarna putih susu dan terdapat endapan. Namun setelah ditambahkan reagen biuret hasil yang ditunjukkan negatif. Ditandai dengan tidak ada perubahan warna.
Pada sampel pertama dan ketiga susu skim dan gelatin hasil yang ditunjukkan positif, berupa terbentuknya cincin berwarna ungu. Hal ini sudah sesuai dengan literatur. Susu skim dan gelatin merupakan salah satu jenis protein kompleks, sehingga di dalamnya terdapat lebih dari 2 ikatan peptida. Karena memiliki lebih dari dua ikatan peptida, maka dihasilkan cincin berwarna ungu pada permukaan larutan. Semakin panjang ikatan peptida maka semakin pekat pula warna ungu yang dihasilkan (Poedjiadi, 2009).
Pada sampel kedua, MSG, hasil yang ditunjukkan negatif, berupa terbentuknya cincin berwarna biru. Hal ini juga sudah sesuai dengan literatur. Pada MSG, hanya terdapat satu asam amino terkristalisasi, sehingga tidak mengandung ikatan peptida sama sekali. Karena MSG hanya mengandung satu asam amino bebas terkristalisasi (Harmata, 2009).
E. ANALISA PROSEDUR
a. Uji Ninhidrin
Pada uji ninhidrin ini, alat yang dibutuhkan di antaranya tabung reaksi sebanyak 4 buah, penjepit tabung reaksi, pipet ukur, rak tabung reaksi, gelas ukur, bulb, serta label. Sedangkan bahan yang dibutuhkan adalah reagen ninhidrin dan 4 buah sampel, yaitu susu skim, aspartam, MSG, dan gelatin.
Label digunakan untuk menandai sampel dan pipet agar tidak sampai tertukar, penjepit tabung reaksi untuk menjepit tabung reaksi ketika dipanaskan, rak tabung reaksi untuk tempat tabung reaksi, tabung reaksi untuk mereaksikan sampel dengan reagen ninhidrin, bulb dan pipet ukur untuk mengambil sampel dan reagen.
Langkah pertama, tandai tabung reaksi dan pipet ukur dengan label untuk sampel yang akan digunakan. Selanjutnya setelah semua sudah ditandai, ambil sampel sebanyak 2 ml dengan menggunakan pipet ukur, lalu masukkan ke dalam tabung reaksi. Tambahkan 2 ml reagen ninhidrin. Untuk susu skim jangan langsung diambil dengan menggunakan pipet ukur, tetapi gunakan gelas ukur dulu dan ambil susu skim menggunakan pipet tetes. Baru kemudian pindahkan ke tabung reaksi.
Langkah selanjutnya, siapkan beaker glass berisi air. Panaskan hingga mendidih. Masukkan tabung reaksi berisi reagen dan sampel ke dalam beaker glass berisi air mendidih, panaskan hingga 20 detik. Amati perubahan warna yang terjadi, lalu catat hasilnya pada tabel. Lakukan hal yang sama pada keempat sampel, lalu catat hasilnya pada tabel.
b. Uji Biuret
Pada uji biuret ini, alat yang dibutuhkan di antaranya tabung reaksi sebanyak 4 buah, penjepit tabung reaksi, pipet ukur, rak tabung reaksi, gelas ukur, bulb, serta label. Sedangkan bahan yang dibutuhkan adalah reagen biuret berupa larutan CuSO4 5 %, larutan NaOH 10 % dan 4 buah sampel, yaitu susu skim, aspartam, MSG, dan gelatin.
Label digunakan untuk menandai sampel dan pipet agar tidak sampai tertukar, penjepit tabung reaksi untuk menjepit tabung reaksi ketika dipanaskan, rak tabung reaksi untuk tempat tabung reaksi, tabung reaksi untuk mereaksikan sampel dengan reagen ninhidrin, bulb dan pipet ukur untuk mengambil sampel dan reagen.
F. PERTANYAAN
1. Bagaimana mengidentifikasi adanya gugus amino pada sampel dengan menggunakan uji Ninhidrin?
Identifikasi gugus asam amino bebas pada suatu sampel dapat dilihat dengan cara menambahkan reagen ninhidrin pada sampel. Reagen ninhidrin akan bereaksi dengan gugus amino yang terdapat pada sampel kemudian perubahan warna larutan sampel setelah penambahan reagen ninhidrin dan pemanasan selama kira kira 20 detik. Sampel yang mengandung gugus asam amino akan berubah warna menjadi ungu muda hingga tua. Kompleks warna ungu terbentuk karena reaksi antara asam amino dan ninhidrin dengan hasil samping lainnya berupa H2O dan aldehid (Winarno, 2012).
2. Bagaimana reaksi yang terjadi antara sampel dengan reagen pada uji Biuret?
G. KESIMPULAN
Praktikum analisis kualitatif protein yang telah dilakukan bertujuan untuk mengetahui prinsip dasar uji protein dan mengetahui prinsip dari masing masing metode.
Prinsip uji ninhidrin adalah menguji ada atau tidaknya protein dalam suatu sampel dengan menambahkan reagen ninhidrin untuk mengetahui jumlah kadar asam amino bebas yang terkandung di dalamnya, dimana asam amino bebas akan bereaksi dengan ninhidrin membentuk kompleks warna ungu.
Prinsip uji biuret adalah menguji ada atau tidaknya protein dalam suatu sampel dengan penambahan NaOH dan CuSO4, dimana ion Cu2+ dalam pereaksi biuret akan bereaksi dengan polipeptida dan membentuk cincin warna ungu.
Pada uji ninhidrin, hasil uji sampel positif ditunjukkan oleh MSG, susu skim dan aspartam dengan perubahan warna setelah pemanasan menjadi ungu dibagian atas larutan, sedangkan hasil uji sampel negatif ditunjukkan gelatin.
Sebelum direaksikan sesudah di reaksikan
Uji ninhidrin
Sons
Chapman, Hall. 2007. Food Science and Nutrition Second Edition. London: Elsiever Falk, Ian. 2011. Managing Biosecurity Across Borders. Heidelberg: Springer
Ishanda, Lanang. 2014. Prinsip Kimia OrganikEdisi III. Jakarta: Erlangga
Kristianti, Elizabeth. 2009. Struktur Kimia Pangan dan Gizi untuk Mahasiswa. Jakarta: Pustaka Aksara
Machin, Troy. 2012. Remington of Chemistry Structure. Philadephia: Wolters Kluwer Health Nigam, William. 2007. Chemistry: Principles and Reaction. Washington DC: ASM
International
Scopes, Robert K. 2013. Protein Purification: Principles and Practice. Pennsylvania: Cengage Learning
Harmata, Michael. 2009. Food Chemistry Third Edition. California: Elsiever
Krull, Ira S. 2007. Reaction Detection in Liquid Chromatography. California: Deepublish Inc Lundblad, Roger L. 2014. Biochemistry and MolecularBiology Compendium. New York:
Elsiever
Poedjiadi, Anna. 2011. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: Universitas Indonesia
Simanjutak, Tiurma P. 2009. Komponen Gizi dan Terapi Pangan Masyarakat. Medan: Pustaka Baca
Soedarmadji, dkk. 2013. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta: Liberty Yogyakarta
