i TESIS
DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DENGAN PRIMER
PROMOTER inhA DARI DNA METAGENOMIK SPUTUM
PASIEN TUBERKULOSIS
NI MADE YUSTIKARINI
PROGRAM PASCA SARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
2015
ii TESIS
DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DENGAN PRIMER
PROMOTER inhA DARI DNA METAGENOMIK SPUTUM
PASIEN TUBERKULOSIS
NI MADE YUSTIKARINI NIM 1292061011
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN
PROGRAM PASCA SARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
iii
DETEKSI Mycobacterium tuberculosis DENGAN PRIMER
PROMOTER inhA DARI DNA METAGENOMIK SPUTUM
PASIEN TUBERKULOSIS
Tesis ini untuk Memperoleh Gelar Magister pada Program Magister, Program Studi Kimia Terapan,
Program Pasasarjana Universitas Udayana
NI MADE YUSTIKARINI NIM 1292061011
PROGRAM MAGISTER
PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN
PROGRAM PASCA SARJANA
UNIVERSITAS UDAYANA
DENPASAR
iv
Lembar Pengesahan
TESIS INI DISETUJUI TANGGAL 26 AGUSTUS 2015Pembimbing I Pembimbing II
Mengetahui
PENETAPAN PANITIA PENGUJI TESIS
Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si. Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si NIP. 19710210 199702 2 001 NIP. 19710219 199702 1 001
Ketua Program Magister Kimia Terapan Direktur
Program Pascasarjana Program Pascasarjana Universitas Udayana, Universitas Udayana
Prof. Dr. I Made Dira Swantara, M.Si Prof.Dr.dr.A.A Raka Sudewi,Sp.S(K). NIP. 19540101 198603 1 001 NIP.19590215 198510 2 001
v
PENETAPAN PANITIA PENGUJI TESIS
Tesis ini diuji pada Tanggal 26 Agustus 2015
Panitia Penguji Tesis berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No : 2715/UN14.4/HK/2015, Tanggal 25 Agustus 2015
Ketua : Dr.Sagung Chandra Yowani,S.Si,Apt., M.Si Anggota
1. Dr. I Nengah Wirajana,S.Si, M.Si 2. Prof. Dr. I Made Dira Swantara,M.Si 3. Prof. Dr. Ir. I Gede Mahardika, M.S 4. Dr. Dra. Retno Kawuri, M.Phil
vi
SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT
Saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama : Ni Made Yustikarini
NIM : 1292061011
Program Studi : Kimia Terapan
Judul Tesis : Deteksi Mycobacterium tuberculosis dengan Primer Promoter inhA dari DNA Metagenomik Sputum Pasien Tuberkulosis
Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah ini bebas plagiat.
Apabila di kemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI N0. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundang-undangan yang berlaku.
Denpasar, 26 Agustus 2015 Yang membuat pernyataan
xi
UCAPAN TERIMA KASIH
Puji syukur penulis panjatkan ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa / Tuhan Yang Maha Esa, karena hanya atas asung kerta wara nugraha-Nya, tesis yang berjudul “Deteksi Mycobacterium tuberculosis dengan Primer Promoter inhA
dari DNA Metagenomik Sputum Pasien Tuberkulosis” ini dapat diselesaikan.
Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada: Dr. Sagung Chandra Yowani, S.Si., Apt., M.Si., sebagai pembimbing I yang telah banyak membantu dan tak hentinya memberikan semangat, bimbingan serta dukungan dalam penyelesaian tesis ini. Ucapan terimakasih yang sebesar-besarnya juga penulis sampaikan kepada Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., sebagai pembimbing II yang juga telah banyak membimbing dan memberikan saran, semangat, serta dukungan untuk menyelesaikan tesis ini.
Ucapan terima kasih juga ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana Prof. Dr. dr. I Ketut Suastika, Sp.PD-KEMD atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan Program Magister di Universitas Udayana. Ucapan terimakasih penulis ucapkan kepada Direktur Program Pasca Sarjana Universitas Udayana yang dijabat oleh Prof. Dr. Dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S (K) atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pasca Sarjana Universitas Udayana. Pada kesempatan ini juga penulis menyampaikan rasa terimakasih kepada ketua Program Studi Kimia Terapan Program Pasca Sarjana Universitas Udayana, Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pasca Sarjana Universitas Udayana. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Kepala UPT Laboratorium Forensik Universitas Udayana, Dr.rer.nat. I Made Agus Gelgel Wirasuta, M.Si.,Apt atas ijin yang diberikan kepada penulis untuk menggunakan fasilitas laboratorium. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada para penguji tesis yaitu : Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si, Prof. Dr. Ir. I Gede
xii
Mahardika, M.S, Dr. Dra. Retno Kawuri, M.Phil, yang telah memberikan masukan, saran, sanggahan dan koreksi sehingga tesis ini dapat terwujud. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Bapak, Ibu dosen dan segenap karyawan di lingkungan Magister Kimia Terapan yang telah memberikan banyak bekal ilmu pengetahuan dan kerja sama selama penulis menimba ilmu. Terimakasih yang sebesar-besarnya juga penulis sampaikan kepada staff laboratorium Biologi Molekuler Fakultas Kedokteran Universitas Udayana diantaranya Nanik, Mbok Mang Handayani, Ecik, Mbak Wahyu dan Pak Ketut atas bantuannya selama penulis melakukan penelitian.
Pada kesempatan ini ijinkanlah penulis menyampaikan terima kasih yang tulus kepada suami yang telah banyak memberikan bimbingan dan dukungan semangat, moral serta finansial, anak-anak tercinta Luh Muni Wiraswari, Made Parama Wiryasentana dan Ketut Saita Wiryaparami. Ucapan terimakasih yang tulus juga penulis sampaikan kepada orang tua penulis yang sudah dengan sabar memberikan bimbingan moral dan dukungan semangat yang tiada hentinya. Terima kasih yang tulus juga ingin penulis sampaikan kepada teman-teman satu team penelitian, Maitri dan Indra yang sudah banyak membantu dan menjadi teman diskusi yang baik selama penelitian. Akhirnya penulis mengucapkan terima kasih kepada teman-teman seperjuangan di Magister Kimia Terapan Universitas Udayana diantaranya Rahayu, Bu Rini, Diani, Nining, Eva, Bu Trisna, Gusti, Bu Sagung, Agus, Widya, Fika dan Lia.
Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa / Tuhan Yang Maha Esa selalu melimpahkan rahmat dan anugerah-Nya kepada semua pihak yang telah membantu pelaksanaan penyelesaian tesis ini. Semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi pembaca dan perkembangan ilmu pengetahuan.
Denpasar, Agustus 2015 Penulis
xiii DAFTAR ISI
Halaman
SAMPUL DALAM ... ii
PRASYARAT GELAR. ... iii
LEMBAR PENGESAHAN. ... iv
PENETAPAN PANITIA PENGUJI ... v
PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT ... vi
UCAPAN TERIMA KASIH ... vii
ABSTRAK ... viii
ABSTRACT ... ix
RINGKASAN ... x
DAFTAR ISI ... xi
DAFTAR TABEL ... xiv
DAFTAR GAMBAR ... xv
DAFTAR SINGKATAN ... xvi
DAFTAR ISTILAH ... xvii
DAFTAR LAMPIRAN ... xix
BAB I PENDAHULUAN ... 1
1.1. Latar Belakang ... 1
1.2. Rumusan Masalah ... 5
1.3. Tujuan Penelitian ... 6
1.4. Manfaat Penelitian ... 6
BAB II KAJIAN PUSTAKA ... 7
2.1. Tuberkulosis ... 7
2.2. Penegakan Diagnosis Tuberkulosis ... 10
2.3. Metagenomik ... 13
xiv
2.5. Polymerase Chain Reaction ... 15
2.6. Elektroforesis ... 18
2.7. Sekuensing DNA ... 20
2.8. Analisis Homologi ... 21
BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS... 23
3.1. Kerangka Berpikir ... 23
3.2. Hipotesis ... 26
BAB IV METODE PENELITIAN ... 28
4.1. Rancangan Penelitian ... 28
4.2. Lokasi dan Waktu Penelitian ... 28
4.3. Bahan Penelitian ... 28
4.4. Alat Penelitian ... 29
4.5. Prosedur Penelitian ... 29
4.5.1. Isolasi DNA dari Kultur Isolat MDR-TB ... 29
4.5.2. Isolasi DNA Metagenomik dari Sputum Pasien MDR-TB ... 30
4.5.3. Amplifikasi DNA dengan PCR ... 33
4.5.4. Deteksi DNA dengan Elektroforesis ... 34
4.5.5. Sekuensing DNA... 34
4.5.6. Analisis Data Penelitian ... 34
BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN ... 35
5.1. Hasil Isolasi DNA Metagenomik ... 35
5.2. Amplifikasi DNA Metagenomik dengan Teknik PCR ... 38
5.2.1. Optimasi Suhu Annealing Primer Pomoter inhA M. tuberculosis ... 38
5.2.2. Amplifikasi DNA Metagenomik dengan Primer Promoter inhA ... 43
xv
5.4. Analisis Homolog dan Mutasi Nukleotida ... 48
BAB VI KESIMPULAN DAN SARAN ... 53
6.1. Kesimpulan ... 53 6.2. Saran ... 53 DAFTAR PUSTAKA ... 54 LAMPIRAN-LAMPIRAN ... 59
xvi
DAFTAR TABEL
Halaman
5.1 Hasil Analisis homologi sekuens fragmen promoter inhA DNA
Metagenomik P.48B……….. 47
5.2 Hasil Analisis homologi sekuen fragmen promoter inhA DNA
Metagenomik P.47B………. 47 5.3 Hasil Analisis homologi sekuen fragmen promoter inhA DNA
Metagenomik P.48B dengan Kit………... 47 5.4 Hasil Analisis homologi sekuen fragmen promoter inhA DNA
xvii
DAFTAR GAMBAR
Halaman 2.1 Bakteri Mycobacterium tuberculosis pada sputum dengan teknik
pewarnaan tahan asam…... 8
2.2 Dinding sel mikobakteri…... 9
3.1 Kerangka Konseptual Penelitian... 25
4.1 Skema Rancangan penelitian ... 28
5.1 Elektoforegram DNA metagenomik sebelum amplifikasi dengan PCR……….. 36
5.2 Elektroforegram PCR dengan suhu annealing 56ºC,57ºC, 58ºC………... 39
5.3 Elektroforegram PCR dengan suhu annealing 59º……... 40
5.4 Elektroforegram dari produk PCR pertama dari DNA Metagenomik……….……… 41
5.5 Elektroforegram dari produk PCR kedua dari DNA Metagenomik………..…………... 43
5.6 Elektroforegram amplifikasi lima sampel DNA metagenomik pengulangan pertama………... 44
5.7 Elektroforegram amplifikasi lima sampel DNA metagenomik pengulangan kedua……….. 44
xviii
DAFTAR SINGKATAN
BLASTn : Basic Local Alignment Search Tool nucleotide
Bp : base pairs
C : sitosin
DNA : Deoxyribonucleic acid
dATP : deoksiadenosin trifosfat
dCTP : deoksisitidin trifosfat
dGTP : deoksiguanosin trifosfat
dTTP : deoksitimidin trifosfat
dNTPs : Deoxynucleotide triphosphates
EDTA : Ethylene diamine tetraacetic acid
GuSCN : Guanidinium thiocyanate
INH : isoniazid
inhA : pengkode enoyl-acyl carrier protein (ACP) reductase
MDR : Multi-drug resistant
MEGA4 : Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 4.0
PCR : Polymerase Chain Reaction
T : timin
TB : tuberkulosis
TAE : Tris-Asetat EDTA
xix
DAFTAR ISTILAH
Alignment :
proses pensejajaran sekuen DNA berdasarkan homologi sekuen tersebut dengan subjek untuk mengidentifikasi sekuen yang memiliki kesamaan
Amplikon : produk PCR
Asam amino : unit monomer penyusun protein yang dihubungkan
melalui ikatan peptida
Comb : alat menyerupai sisir yang digunakan untuk membentuk
kolom (well) pada gel agarosa
Chamber wadah untuk meletakkan gel agarosa
DNA polymerase : enzim yang diperlukan sebagai katalis dalam proses polimerisasi DNA
DNA templat : DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen atau gen yang akan digandakan
Elektroforegram : pita hasil analisis elektroforesis gel Elektroferogram : grafik hasil analisis sekuensing
Gen : urutan DNA yang menyandi suatu protein
GenBank : database utama dalam biologi molekuler yang dikelola
oleh NCBI
H37Rv : galur standar yang dijadikan wild type
In silico : dilakukan pada komputer
Kodon : deret nukleotida pada mRNA yang terdiri atas kombinasi
tiga nukleotida berurutan yang menyandi suatu asam amino tertentu
xx
Mutasi : terjadinya perubahan basa dari urutan nukleotida yang
lazim dari suatu sekuen DNA organisme yang dapat menyebabkan perubahan sifat fenotip
Nukleotida : unit monomer pembentuk DNA
PCR : teknik perbanyakan urutan DNA dengan menggunakan
reaksi enzimatis
Pelet : gumpalan DNA berwarna putih pada dasar tabung setelah
proses sentrifugasi
Primer : oligonukleotida pendek yang mempunyai urutan
nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida DNA templat
Polimerisasi : reaksi pembentukan polimer
Promoter : suatu sekuen DNA spesifik yang berperan dalam
mengendalikan transkripsi gen struktural xiii xiii
Sekuen : urutan DNA
Sekuensing : proses penentuan urutan basa nukleotida pada suatu
molekul DNA
Tray : alat yang digunakan sebagai cetakan gel agarosa
Well : kolom-kolom tempat diletakkannya zat yang akan
dielektroforesis
Tray : alat yang digunakan sebagai cetakan gel agarosa
Well : kolom-kolom tempat diletakkannya zat yang akan
dielektroforesis
xxi
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman 1. Skema Kerja Isolasi DNA dari isolat M. tuberculosis dan sputum pasien
Tuberkulosis dengan metode Boom Modifikasi ... 59 2. Skema Kerja Isolasi DNA Metagenomik dari Sputum pasien
Tuberkulosis ... 60 3. Skema kerja isolasi DNA metagenomik menggunakan DNA Isolation kit
……… 61
4 Pembuatan Larutan……… 62
5. Elektroferogram Hasil Sekuensing Promoter inhA terhadap DNA
Metagenomik Sputum P. 48B……… 64
6. Elektroferogram Hasil Sekuensing Promoter inhA terhadap DNA
Metagenomik Sputum P. 47B………... 65 7. Elektroferogram Hasil Sekuensing Promoter inhA terhadap DNA
Metagenomik Sputum P. 48B dengan kit……….. 66
8. Elektroferogram Hasil Sekuensing Promoter inhA terhadap DNA
Metagenomik Sputum P. 46B dengan Kit……….. 67
9. Hasil Alignment Sekuens Nukleotida DNA Metagenomik A Sputum MDR-
TB Promoter inhA dengan Data Base M.Tuberculosis (U66801.1)... 68 10. Hasil Alignment Sekuens Nukleotida DNA Metagenomik C Sputum MDR-
TB Promoter inhA dengan Data Base M.Tuberculosis (U66801.1)…... 70 11. Hasil Alignment Sekuens Nukleotida DNA Metagenomik Sputum MDR- TB
P.48B Kit Promoter inhA dengan Data Base M.Tuberculosis (U66801.1)… 72 12. Hasil Alignment Sekuens Nukleotida DNA Metagenomik Sputum MDR- TB
xxii
13. Hasil Alignment Sekuens Nukleotida Isolat P.11 , P.16, DNA Metagenomik P.48B, P.47B, P.48B Kit dan P. 46B Kit Sputum MDR- TB Promoter inhA dengan Data Base M. tuberculosis (U66801.1)………....
76 14 Hasil Alignment Sekuens Nukleotida Isolat P.11 , P.16, DNA Metagenomik
P.48B, P.47B, P.48B Kit dan P. 46B Kit Sputum MDR- TB Promoter inhA
