SINTESIS ANTIGEN AFLATOKSIN M
1-OVA ALBUMIN (Ova) SEBAGAI
PEREAKSI
AGAR GEL PRECIPITATION TEST
(AGPT)
Angriani Fusvita
Akademi Analis Kesehatan Kendari Email : angrianif@yahoo.com
ABSTRACT
Synthesis aflatoksin M1 -Ova albumin (Ova) antigen used as Agar Gel Precipitation Test
(AGPT) reagent. The AFM1-Ova antigen was synthesized by reacting AFM1 standard and
Ova albumin using carboxymethoxylamine hemihydrochloride (CMO) as intermediate reactions. The component of Reagent were AFM1-Ova antigen and antibody G (Ig G/serum)
used for AGPT. The result of AFM1-Ova Antigen synthesis were 3,45 mg/ml. AGPT result
showed bond precipitation reaction beetween specific antibody with AFM1-Ova antigen.
Therefore synthesis of AFM1-Ova antigen can be used to serology reagent test as AGPT.
PENDAHULUAN
Aflatoksin adalah sekelompok
senyawa yang terdiri dari kumarin dan
cincin furan rangkap dua, yang
mikotoksinnya terjadi secara alamiah dan
diproduksi oleh banyak spesies
Aspergillus, diantaranya adalah
Aspergillus flavus Aspergillus parasiticus
dan Aspergillus nomius. A.flavus hanya
menghasilkan aflatoksin B, sedangkan
A.parasiticus dan A. nomius menghasilkan
aflatoksin B dan G (Lunggani,
2007;Tekinsen dan Tekinsen, 2005).
Aflatoksin M1 (AFM1) merupakan
hasil hidroksilasi metabolit aflatoksin B1
(AFB1). Ketika hewan ruminansia diberi
makan dengan pakan yang mengandung
AFB1, metabolit ini dapat diubah menjadi
AFM1. Dengan demikian, konsentrasi
AFM1 dalam susu dan hasil olahannya
tergantung pada tingkat paparan dan
jumlah AFB1 yang tertelan (Pei et al.,
2009). AFB1 dikenal sebagai
hepatokarsinogen paling kuat pada
mamalia (Virdis et al., 2008). Meskipun
toksisitas AFM1 kurang dari senyawa
induknya AFB1, akan tetapi senyawa ini
dikenal juga bersifat hepatotoksik dan
karsinogenik (Lee et al., 2009).
Sintesis AFM1-Ova diperlukan
sebagai pereaksi dalam pengujian
serologi. Gholib (2005) menyatakan salah
satu uji serologi adalah dengan
menggunakan Agar Gel Precipitation Test
(AGPT). Agar Gel Precipitation Test lebih
dikenal sebagai double immunodifution
test atau ouchterlony´s double difution
yang paling sering digunakan untuk
menganalisis antigen dan antibodi. Prinsip
dari uji ini yaitu adanya ikatan antibodi
spesifik dengan antigen.
Antigen merupakan dua makna
yang berbeda yaitu sebagai imunogen jika
digunakan untuk memproduksi antibodi
dan sebagai antigen penangkap antibodi
dalam teknik immunoassai (Maryam
2007). AFM1 memiliki bobot molekul
rendah (BM=328) atau disebut senyawa
hapten sehingga harus dikonjugasikan
dengan protein pembawa seperti Ova
albumin (Ova) untuk dapat menangkap
antibodi dalam uji serologi. Tujuan
penelitian ini adalah mensintesis antigen
AFM1- Ova sebagai pereaksi Agar Gel
Precipitation Test (AGPT).
METODE PENELITIAN
Bahan dan Alat
Bahan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah standar AFM1 dari
Aspergillus flavus yang dikonjugasi
dengan Ova albumin sebagai antigen dan
antibodi G (Ig G) kelinci . Bahan kimia lain
yang digunakan adalah
carboxymethoxylamine hemihydrochloride
(CMO), larutan refluks (piridin, methanol
dan air suling), asam asetat glasial,
kloroform, carbodiimide (EDC), Phospate
Buffer Saline (PBS) dan
N-hydroxysuccinimide (NHS). EDC dan
larutan NHS. Alat-alat yang digunakan
khoromatografi lapis tipis (TLC),
Evaporator, kaca preparat, cawan petri,
Hot plate, pengaduk magnet (magnetic
stirrer, sentrifuge dan spektrofotometer.
Antigen yang disintesis dari AFM1
-Ova dan Antibodi G (Ig G) digunakan
sebagai pereaksi untuk Agar Gel
Precipitation Test (AGPT). Pengujian ini
dilakukan dengan berdasarkan teknik
presipitasi (pengendapan) antigen oleh
antibodi yang sesuai (spesifik).
a. Persiapan aflatoksin M
1- CMO
Metode yang digunakan oleh
Wang et al. (2011) yang telah dimodifikasi
dengan mempersiapkan AFM1-CMO
memungkinkan konjugasi pembawa
protein atau enzim. Percobaan dimulai
dengan 0,5 mg aflatoksin M1
menambahkan 1,5 mg
carboxymethoxylamine hemihydrochloride
(CMO), yang dilarutkan dalam 6 ml larutan
refluks (1,0 ml piridin, 4,0 ml methanol
dan 1,0 ml air suling) dalam labu ukur.
Setelah itu reaksi campuran direflux
dengan lembut selama 2,5 jam secara
terus-menerus dengan magnetik stirer,
labu ukur dibungkus dalam aluminium foil
dan disimpan pada suhu 30oC semalam.
Menggunakan Evaporator untuk reaksi
campuran sampai hasil akhir 1 ml, dari
sisa campuran 1 ml tersebut dan
aflatoksin M1 standar diamati dengan TLC
plate. TLC Plate dilarutkan dalam
kloroform : metanol (9: 1) ditambah 1,5%
asam asetat glasial, dan diamati di bawah
sinar UV pada panjang gelombang 365
nm. Hasil reaksi AFM1-CMO diambil
dengan dikeruk silika gel dari TLC plate
dan dilarutkan ulang dengan kloroform,
kemudian disentrifuge selama 5 menit
untuk menghilangkan residu silika gel.
AFM1-CMO dikering anginkan untuk
tahap sintesis dengan Ova.
b. Sintesis AFM
1-Ova
AFM1-CMO disintesis dengan
mengkonjugasikan Ova dan
menambahkan larutan carbodiimide
(EDC) dan N-hydroxysuccinimide (NHS).
EDC disiapkan (1,0 mg EDC dalam 0,01
ml DMF) dan larutan NHS (0.8 mg dari
NHS di 0.01 ml DMF) setelah itu
ditambahkan ke aflatoksin M1-CMO (0,5
mg aflatoksin M1-CMO dalam 0,13 ml
DMF). Hasil reaksi disimpan di suhu 300C
selama 2 jam dengan pengadukan
magnetik stirer secara terus menerus.
Dari campuran tersebut berisi 150 µl. Ova
(1.5 mg Ova dalam 1,0 ml 0,1 M NaHCO3,
pH 8,3) yang telah disiapkan
ditambahkan bertetes-tetes ke botol
tersebut, dan disimpan pada suhu 30oC.
Setelah reaksi, campuran dalam botol di
dialisis dengan larutan 0,01 M buffer
fosfat mengandung 0,15 NaCl M
[phosphate buffered saline (PBS) pH 7,5]
selama 72 jam dengan dua kali pertukaran
buffer. Setelah dialisis, campuran
dikumpulkan untuk di diamati dengan TLC
plate dan dilanjutkan Agar Gel
c. Agar Gel Precipitation Test (AGPT)
warna larutan menjadi bening. Kemudian
larutan dipipet sebanyak 3,75 ml, dicetak
pada gelas obyek dan ditunggu sampai
memadat. Kemudian dibuat sumur-sumur
dengan puncher diameter 2-3 mm, satu
sumur di tengah dimasukkan 25 µl antigen
AFM1-Ova dan 6 sumur dimasukkan 25 µl
antibodi G (IgG/serum). Gelas obyek
diletakkan di atas kertas yang basah agar
terjaga kelembabannya. Reaksi dibaca
setelah 24 jam. Reaksi positif ditunjukkan
dengan adanya pita presipitasi di antara
sumur antigen dan serum.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Sintesis AFM
1–
Ova
Konjugat AFMl-CMO yang diamati
dengan kromatografi lapis tipis memiliki Rf
= 0,9. Hasil pengukuran Ova pada
konjugasi AFM1-Ova menggunakan
larutan standar Ova dengan konsentrasi 0,
0,25, 0,5, 1,0 dan 2,0 ng/mL dan diukur
dengan menggunakan spektrofotometer.
Hasil pengukuran absorbansi dan
penghitungan Ova terpapar pada Gambar
1 dan Tabel 1. Dengan menggunakan
persamaan linier regresi y = ax + b dari
kurva larutan standar Ova, maka diperoleh
konsentrasi Ova dalam antigen AFMl-Ova
sebesar 3,45 mg/mL (Tabel 1). Jumlah ini
cukup banyak untuk digunakan pada
imunisasi mencit (sebagai imunogen) dan
sebagai antigen penangkap untuk AGPT .
Tabel 1. Hasil pengukuran spektrofotometer standar Ova dan antigen AFM1-Ova
Bahan yang dipakai Absorbansi (280 nm)
Gambar 1 Kurva standar Ova dalam
antigen AFM1-Ova
Agar Gel Precipitation Test (AGPT)
Pada percobaan ini, antigen
AFM1-Ova yang diperoleh dengan
mereaksikan AFM1 dan Ova
menghasilkan senyawa yang dapat
bereaksi positif dengan antobodi yang
terlihat pada Gambar 2. Reaksi positif
tersebut ditandai dengan terbentuknya
berisi Antigen AFM1-Ova dan antibodi G
(Ig G/serum). Hal ini menunjukkan adanya
homologi antara antigen dan antibodi yang
dicerminkan oleh adanya garis presipitasi.
Angi et al., 2009 menyatakan pada uji
presipitasi, pengikatan antara antigen dan
antibodi memerlukan struktur yang cocok
antara keduanya. Ketika suatu antibodi
yang berdifusi ke agar memiliki kecocokan
atau homolog dengan antigen maka akan
terlihat garis presipitasi.
Gambar 2. 1Reaksi positif dari uji AGPT (a) antigen AFM1-Ova (b) antibodi G (IgG/serum) (p) garis presipitasi 2Reaksi negatif uji AGPT (a) antigen
reaksi pembentukan pita presipitasi
ikatan antibodi spesifik dengan antigen
AFM1-Ova.
SARAN
Perlu dilakukan penelitian lanjutan dengan
membandingkan pengujian yang bersifat
kuantitatif seperti High performance liquid
chromatography (HPLC) atau
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
UCAPAN TERIMAH KASIH
Terima kasih kepada Balai Besar
Penelitian Veteriner bogor Jawa Barat dan
kepada Akademi Analis Kesehatan
Kendari sebagai institusi asal Peneliti
yang telah memberikan dukungan
sehingga penelitian dapat berjalan dengan
baik.
DAFTAR PUSTAKA
Angi, A.H., Wibawan, I.W.T., Murtini, S. 2009. Kemampuan netralisasi
antibodi spesifik Avian
Influenza H5 terhadap beberapa virus H5N1 Isolat lapang. Forum
pascasarjana. 32 (1): 55-66.
Gholib, D. 2005. Pengembangan teknik
serologi untuk pemeriksaan
Aspergillosis ayam. JITV. 10
(2): 143-149.
Lee, J. E., Kwak, B. M., Ahn, J. H., & Jeon, T. H. 2009. Occurrence of aflatoxin M1 in raw milk in South Korea using an immunoaffinity
column and liquid
chromatography. J Food
Control. 20: 136–138.
Lunggani AT. 2007. Kemampuan Bakteri
Asam Laktat Dalam
Menghambat Pertumbuhan dan
Produksi Aflatoksin B2
Aspergilllus flavus BIOMA
ISSN: 1410-8801. 9 (2): 45 – 51.
Maryam, R. 2007. Produksi antibodi
monoklonal menggunakan
konjugat fumonisin
Pei, S.C. Zhang, Y.Y. Eremin, S.G. Lee,
W.J. 2009. Detection of
aflatoxin M1 in milk products from China by ELISA using monoclonal antibodies. J Food
Control. 20 :1080–1085.
Tekinsen, K.K. dan Tekinsen, O.C. 2005.Aflatoxin M1 in white pickle
and van otlu (herb) cheeses consumed in southeastern in Turkey. Food Control.7:565– 568.
Virdis, S. Corgiolu, G. Scarano, C. Pilo, A.L. De Santis E.P L. 2008. Occurrence of aflatoxin M1, in tank bulk goat milk and ripened goat cheese. J Food Control.
19: 44–49.
Wang, J.J. Liu, B.H. Hsu, Y.T. Yu, F.Y, 2011. Sensitive Competitive Direct Enzyme-Linked Immunosorbent Assay And Gold Nanoparticle
Immunochromatographic Strip For Detection Aflatoksin M1 In
