Penelusuran Senyawa … (Tri Windono dkk)
96
PENELUSURAN SENYAWA TOKSIK TERHADAP LARVA
Artemia salina
Leach. DARI SUBFRAKSI HEKSANA FRAKSI ETER EKSTRAK METANOL
DAUN TANAMAN DAUN DEWA (
Gynura pseudochina
(L.) DC.
Tri Windono, Renny Haslinda, Fenny V., Alfulalila, Sayekti Palupi, dan Sutarjadi
Fakultas Farmasi Universitas Surabaya
Abstract
n-Hexane sub fraction of ether fraction obtained from methanolic extract of “daun dewa” leaves (Gynura pseudochina (L.) DC.) was evaluated using Brine Shrimp Lethality Test (BST). Column chromatography with silica gel 60 and n-Hexane-ethyl acetate (4:1) as mobile phase has been used for purification and guided by BST as bioassay method. The toxic compound, β-sitosterol was isolated by that toxicity-guided fractionation.
Keywords: Daun dewa, Gynura pseudochina (L.) DC., Artemia salina Leach, β-sitosterol
PENDAHULUAN
Uji toksisitas pada larva Artemia salina Leach (Brine shrimp lethality test) merupakan suatu metode uji yang digunakan sebagai uji pendahuluan untuk senyawa atau ekstrak tumbuhan sebelum dilakukan uji antikanker atau sitotoksik (1,2). Siqueira et al (3) menggunakan metode ini untuk menelusur komponen aktif dari kulit batang Duguetia glabriuscula, dan berhasil mengisolasi senyawa alkaloid oxobufoline dan lanuginosine.
Daun tanaman daun dewa (Gynura
pseudochina (L.) DC.) digunakan oleh masyarakat untuk pengobatan alternatif bagi penyakit kanker (4). Tanaman ini pernah disebut juga dengan nama ilmiah
Gynura procumbens, Gynura procumbens Backer atau Gynura procumbens var Macrophylla (5). Dari daun tanaman ini telah berhasil diisolasi alkaloid golongan pirolizidin (6), dan flavonoid golongan isoflavon (7). Masayu dkk. (8) membuktikan bahwa ekstrak n-heksana daun dewa (Gynura procumbens) menunjukkan efek toksik yang lebih besar dibanding ekstrak metanol maupun kloroform, terhadap larva A. salina Leach. Berdasarkan polaritasnya, alkaloid pirolizidin dan flavonoid tidak larut dalam pelarut n-heksana, oleh karena itu senyawa toksik yang terdapat dalam ekstrak n-heksana kemungkinan bukan kedua golongan senyawa tersebut.
Berdasarkan permasalahan tersebut dilakukan penelitian penelusuran senyawa toksik yang terdapat dalam subfraksi heksana fraksi eter ekstrak metanol daun dewa (G. pseudochina (L.) DC.) terhadap larva
A. salina Leach.
METODOLOGI Bahan
1. Bahan tanaman
Bahan yang digunakan adalah daun tua (mulai daun ke delapan dari pucuk) tanaman daun
dewa (G pseudochina (L.) DC.) yang ditanam dalam pot di kampus Fakultas Farmasi Universitas Surabaya, pada bulan Januari-Agustus. Determinasi tanaman dilakukan oleh Pusat Penelitian dan Pengembangan Biologi-LIPI, Bogor. Daun dicuci, dikeringkan dengan cara diangin-anginkan, ditumbuk dan diayak dengan ayakan tepung.
2. Bahan kimia
Semua bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini berderajat pro analisis (E. Merck).
Alat-alat
Alat-alat yang digunakan adalah: Alat-alat gelas laboratorium, Soxhlet ekstraktor, kolom gelas, penguap putar (Buchi), seperangkat alat kromatografi lapis tipis (Camag), alat pengukur titik leleh (Fisher Johns), Spektrofotometer FT-IR (Jasco FT/IR 5300).
Metode
1. Metode ekstraksi dan fraksinasi
Serbuk daun tanaman daun dewa (1000 g), disoxhletasi dengan metanol (72 jam). Ekstrak metanol dipekatkan dengan penguap putar hingga kental. Ekstrak kental diasamkan dengan HCl 2,5% (400 ml) dan dikocok dengan eter (2,5 l). Fraksi eter diuapkan dengan penguap putar, ditambah air (200 ml) dan amonia sampai pH 7, dikocok dengan n-heksana. Subfraksi heksana dikeringkan dengan Na2SO4 eksikatus dan diuapkan dengan penguap putar, dilanjutkan di atas penangas air pada suhu tidak lebih dari 50°C.
2. Metode uji toksisitas terhadap larva A. salina
Metode uji toksisitas terhadap larva A. salina
seperti yang dilakukan Meyer et al. (1) atau Anderson, Goets and Mc Laughlin (2) yang dimodifikasi. Perhitungan LC50 menggunakan Finney computer Program atau program statistik SPSS.
3. Metode pemurnian
Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol. 2, No. 3, Januari 2003
97
Kromatografi kolom: fase diam silika gel 60 (mesh 230-400), fase gerak n-heksana-etil asetat (4 : 1). Pemantauan bercak secara KLT : fase diam silika gel GF 254 , fase gerak n-heksana-etil asetat (4 : 1), penampak bercak Anisaldehid-asam sulfat. Uji kemurnian secara KLT : fase diam silika gel GF 254 , fase gerak n-heksana-etil asetat (4 : 1), kloroform, kloroform-etil asetat (7 : 3), penampak bercak Anisaldehid-asam sufat.
4. Metode Identifikasi
Identifikasi senyawa dilakukan dengan KLT, penentuan titik leleh dan pengamatan spektrum Inframerah (KBr).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Dari 1000 g serbuk daun tanaman daun dewa diperoleh 32,1 g subfraksi heksana kering. Hasil Uji toksisitas terhadap larva A. salina dari subfraksi heksana memberikan harga LC50 = 97 µg/ml, sehingga dianggap toksik terhadap larva A. salina (2). Hal ini berarti di dalam fraksi tersebut terdapat satu atau lebih senyawa yang toksik terhadap larva A. salina.
Subfraksi heksana (12 g) dimurnikan dengan kromatografi kolom menghasilkan enam fraksi (Fraksi I – VI). Fraksi I (1,92 g); fraksi II (1,56 g); fraksi III (0,43 g); fraksi IV (0,72 g); fraksi V (1,30 g) dan fraksi VI (0,85 g), masing-masing memberikan harga LC50 >1000 µg/ml; >1000 µg/ml; >1000
µg/ml; 287 µg/ml; 211 µg/ml dan 247 µg/ml. Dari ke enam fraksi tersebut fraksi V mempunyai toksisitas
tertinggi, sehingga diperkirakan senyawa yang paling toksik dari subfraksi heksana terdapat dalam fraksi ini. Fraksi V (1 g) dilakukan kromatografi kolom, menghasilkan tiga fraksi (Fraksi A, B dan C). Pada pemantauan dengan KLT, fraksi B (0,18 g) memberikan bercak yang terkuat. Selanjutnya fraksi B dilakukan kromatografi kolom kembali menghasilkan tiga fraksi (Fraksi B1, B2 dan B3). Fraksi B2 (0,10 g) direkristalisasi dengan n-heksana menghasilkan Isolat X (0,03 g) berupa kristal jarum putih.
Hasil identifikasi Isolat X adalah: Titik leleh 141,5 - 142,5 °C. KLT : Fase gerak n-heksana-etil asetat (4 : 1), Rf = 0,42; Fase gerak kloroform, Rf = 0,56; Fase gerak kloroform – etil asetat (7 : 3), Rf = 0,89. Spektrum Inframerah (KBr), memberikan serapan pada bilangan gelombang (cm-1): 3425,9 (regang OH); 2937,8 (regang CH); 2868,4 (CH3), 1464,1; 1381,16 (lentur CH), 1057,1 (C-O; 958,7 (lentur C=C). Gambar spektrum IR dapat dilihat pada gambar 1. Hasil identifikasi tersebut sesuai dengan β-sitosterol pembanding (E. Merck). Berdasarkan hasil identifikasi dengan penentuan titik leleh, KLT dan spektrum infra merah menggunakan pembanding dapat disimpulkan bahwa isolat X adalah β -sitosterol. Hasil pengujian toksisitas dengan larva A. salina memberikan LC50 = 2,36 ug/ml. Berdasarkan data tersebut dapat disimpulkan bahwa senyawa toksik terhadap larva A. salina dari subfraksi heksana fraksi eter ekstrak metanol daun daun dewa (Gynura pseudochina
(L.) DC.) adalah β-sitosterol. Skema penelusuran senyawa toksik terhadap larva A. salina dapat dilihat pada gambar 3.
Penelusuran Senyawa … (Tri Windono dkk)
98
HO
Gambar 2. Struktur β-sitosterol
β-sitosterol merupakan senyawa yang mungkin terdapat pada setiap tumbuhan tinggi (ubiquitous) (9), sehingga ditemukannya senyawa ini pada fraksi yang paling toksik terhadap larva A. salina kurang memberikan prospek yang baik untuk diteliti lebih lanjut pada uji sitotoksik maupun uji antikanker lainnya. Meskipun demikian kemungkinan masih terdapat kandungan lain dalam subfraksi heksana fraksi eter ekstrak metanol yang toksik. Di samping itu adanya senyawa alkaloid dan flavonoid daun daun dewa yang harus dibuktikan toksisitasnya terhadap larva A salina.
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa dari subfraksi heksana fraksi eter ekstrak metanol daun tanaman daun dewa (G. pseudochina (L.) DC.) dapat diisolasi senyawa β-sitosterol, yang toksik terhadap larva A. salina Leach.
DAFTAR PUSTAKA
1. Meyer BN, Ferrigni NR, Putnam JE, Jacobsen LB, Nicholas DE, Mc Laughlin JL. Brine Shrimp: A Convenient General Bioassay for Active Plant Constituent.
Planta Med 1982; 45: 31-4.
2. Anderson JE, Goets CM and Mc Laughlin. A Blind Comparison of Simple Bench-Top
Bioassay and Human Tumor Cell
Cytotoxicities as Antitumor Prescreens.
Phytochem Analysis1991; 2: 107-11. 3. Siqueira JM, Ziminiani MG, Resende UM,
Boaventura MAD, Estudo fitoquimico das cascas do caule de Duguetia glabriuscula
-Annonaceae, Biomonitorado pelo ensaio de toxicidade frente a Artemia salina leach, Quim. Nova 2001; 24 (2) 185-7.
4. Asmino. Pengalaman pribadi dengan pengobatan alternatif, Surabaya: Airlangga University Press, 1995: 22-4.
5. Tri Windono, Sutarjadi. Pentingnya informasi kepada masyarakat tentang keamanan penggunaan tumbuhan obat. Studi kasus daun dewa (Gynura procumbens
Backer) dan daun "dewa" (Gynura procumbens (Lour.) Merr. Makalah poster pada Kongres Ilmu Pengetahuan Nasional
VII, Serpong, 1999.
6. Tri Windono, Ema S, Suastini NKD, Kardono LBS, Isolasi senyawa alkaloid pirolizidin dari daun dewa (Gynura pseudo-china (L.) DC.), Artocarpus 2001; 1(2): 86-91.
7. Tri Windono, Susilowati, Isolasi dan identifikasi suatu senyawa Isoflavon dari
daun tanaman daun dewa (Gynura
procumbens Backer), Warta Tumbuhan Obat Indonesia 2000; 6(1): 1-3.
8. Masayu I, Sutarjadi, Mangestuti A, Noor Cholies Z, Sukardiman. Penelitian pendahuluan aktivitas antikanker dari ekstrak daun dewa (Gynura procumbens) dengan metode brine shrimp lethality test.
Bull ISFI Jatim 1994; 23 (1), 22-31.
Jurnal Bahan Alam Indonesia ISSN 1412-2855 Vol. 2, No. 3, Januari 2003
99
Serbuk daun dewa (1000 g)MeOH
Ampas Ekstrak MeOH
i diuapkan ii HCl 2,5% iii EtOet
Fraksi EtOet Fraksi air
i dipekatkan
ii air, NH4OH (pH 7)
iii n-heksana
Alkaloid
Subfraksi heksana Fraksi air
Diuapkan
Flavonoid
Subfraksi heksana kering (LC50= 97 ug/ml) (Silika gel 60, n-heksana-EtOAc, 4:1)
Fraksi I Fraksi VI
(LC50>1000 ug/ml) Fraksi III Fraksi V (LC50=247 ug/ml) (LC50>1000 ug/ml) (LC50=211 ug/ml)
Fraksi II Fraksi IV
(LC50>1000 ug/ml) (LC50= 287 ug/ml) (Silikagel 60, n-heksana-EtOAc, 4:1)
Fraksi A Fraksi B Fraksi C
(silikagel 60,
n-heksana-EtOAc, 4:1)
Fraksi B1 Fraksi B2 Fraksi B3 Rekristalisasi n-heksana
Isolat X KLT, TL, IR
β-sitosterol (LC50 = 2,36 ug/ml)
