POTENSI CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7: STUDI IN VITRO DAN IN SILICO SKRIPSI

(1)

xi

POTENSI

CITRULLINE

SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI

DOXORUBICIN

PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7:

STUDI

IN VITRO

DAN

IN SILICO

SKRIPSI

Untuk memenuhi sebagian persyaratan Mencapai derajat sarjana S-1

Diajukan Oleh:

Latifah

1008010102

Fakultas Farmasi

Universitas Muhammadiyah Purwokerto Purwokerto

2014

(2)

(3)

(4)

(5)

xv INTISARI

LATIFAH. Potensi Citrulline Sebagai Agen Kokemoterapi Doxorubicin Pada Sel

Kanker Payudara MCF-7: Studi In Vitro dan In Silico

Dibawah bimbingan NUNUK ARIES NURULITA dan ASMIYENTI DJALIASRIN DJALIL

Latar Belakang: Doxorubicin adalah agen kemoterapi kanker payudara pilihan pertama yang masih banyak digunakan. Namun doxorubicin dapat menimbulkan efek

toksik terhadap sel normal tubuh berupa kardiotoksis. Doxorubicin dapat

menghambat endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) yang menyebabkan produksi Nitric oxide (NO) berkurang. Sehingga terjadi vasokontriksi dan toksik pada jantung. Citrulline adalah asam amino non esensial yang merupakan hasil metabolisme arginine. Penambahan citrulline secara eksogen daengan bantuan L – arginosuccinate dapat mengubah citrulline menjadi arginine yang diindikasikan dapat memproduksi NO dengan bantuan NOS. Sehingga terjadi relaksasi otot polos.

Tujuan penelitian: Untuk menentukan potensi sitotoksik antara citrulline tunggal

dan kombinasi yang dikombinasikan dengan doxorubicin terhadap sel kanker

payudara MCF-7 serta mengetahui interaksi antara citrulline dengan arginase secara

in silico.

Metode Penelitian: Uji sitotoksik dilakukan menggunakan metode MTT.

Konsentrasi larutan citrulline yang digunakan untuk sitotoksik tunggal adalah 5, 20,

25, 50, 75, 100 µM dan 25, 50, 100, 250, 500, 750, dan 1000 nM. Sedangkan konsentrasi kombinasi yang digunakan adalah 50, 100, 250, dan 500 nM untuk citrulline dan doxorubicin dengan masa inkubasi 24 jam. Pengamatan apoptosis

dilakukan dengan metode double staining. Sedangkan uji docking dilakukan dengan

metode PLANTS.

Hasil: IC50 citrulline dan doxorubicin masing – masing adalah 744.243 nM dan

2375.688 nM. Kombinasi doxorubicin dan citruline tidak menimbulkan efek

sitotoksik. Uji apoptosis menunjukkan adanya induksi kematian sel secara apoptosis. Uji docking dilakukan dengan metode PLANTS dan diperoleh hasil berupa best score. Best score menyatakan energi interaksi. Energi interaksi protein arginase dengan ligan dan citrulline dengan masing-masing adalah -19,997 dan -17,5506.

Kesimpulan: Citrulline memiliki efek sitotoksik pada sel kanker payudara MCF-7

pada penggunaan tunggal namun tidak pada kombinasi. Ikatan citrulline dengan

protein arginase tidak lebih kuat dibandingkan dengan ligannya.

Kata kunci : citrulline, arginase, sel MCF-7, docking, PLANTS

(6)

ABSTRACT

LATIFAH. Cytotoxicity Potential of Citrulline as a co-Chemotherapy Agent in Breast Cancer Cell MCF-7: In vitro and In silico studies

Under direction NUNUK ARIES NURULITA and ASMIYENTI DJALIASRIN DJALIL.

Background: Doxorubicin is a first line chemotherapy agent that used widely in the world. Doxorubicin has toxic effect in cell normal. Doxorubicin can inhibit endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS) that can reduce production of Nitric Oxide (NO) caused vasoconstriction. Citrulline is a non essential amino acid and product of arginine. Exogenous citrulline with L-arginosuccinate change citrulline to arginine that indicated produce NO caused smooth muscle relaxation.

Objective: This research was aimed to determine the cytotoxic potential of citrulline and combination with doxorubicin in breast cancer MCF-7 and also showed interaction of citrulline and arginase by in silico study.

Methods: Cytotoxiceffect byusingMTTmethod. _{Concentrastiom of citrulline}_{use two}

series. First series are5, 20, 25, 50, 75, 100 µM and second series are 25, 50, 100, 250, 500, 750, dan 1000 nM. Concentration combination of citrulline and doxorubicin use 50, 100, 250, dan 500 nM with an incubation period of 24 hours.

A_{poptosis effect by using}_double _staining _method. _While _docking_test _{was conducted}

usingPLANTS.

Results: IC50 citrulline and doxorubicin, respectively 744.243 nM 2375.688 nM.

Combination of citrulline and doxorubicin did not showed cytotoxic effect. Test showed apoptosis induction of apoptotic cell death. Docking test was conducted using PLANTS and resulted in the best score obtained. Best score interaction energy states. Interaction the energy of arginase with ligand and citrulline, respectively -19,9997 and -17,5506.

Conclusion: Single citrulline has cytotoxic effects better than combinationinbreast

cancercellsMCF-7 _and_citrulline_ties_with_arginase_{is not stronger}_{than the}_ligand.

Key word : citrulline, arginase, sel MCF-7, docking, PLANTS

(7)

xvii

MOTTO

Tujuan hidup adalah menjalani hidup

dengan tujuan

.

(8)

PERSEMBAHAN

Alhamdulillah, Maha suci Allah yang telah melimpahkan ridha dan karuniaNya yang tiada henti dan terima kasih kepada semua yang telah membantu dan membimbingku hingga mencapai tahap ini. Skripsi ini kupersembahkan untuk kalian semua yang menyayangiku.

• Alm. Ayah dan Ibu tercinta, yang selalu menginspirasiku, memberikan doa,

dukungan semangat dan tak pernah lelah memberikan nasehat padaku.

• Adik – adikku tersayang Dzulkifli dan Dzakiyyah yang selalu

memberikan semangat dan dukungan.

• Agung Pratama terima kasih telah mengajariku banyak hal. Terima kasih

untuk segalanya.

• Sahabat-sahabatku, Anis, Via, Tantri, wening, Mutia, dan Prita terima kasih

selalu menghibur dan mememaniku selama ini.

• Teman-teman seperjuangan di kampus, Ayu, Dwi, Dewi, Novi, Wulan,

Richam tetap semangat ya. Terima kasih atas tawa, canda, tangis, harapan yang telah kalian berikan selama ini.

(9)

xix PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat ALLAH SWT atas segala rahmat,

hidayah serta inayahNya, sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian (skripsi) yang berjudul “POTENSI CITRULLINE SEBAGAI AGEN KOKEMOTERAPI

DOXORUBICIN PADA SEL KANKER PAYUDARA MCF-7: STUDI IN VITRO

DAN IN SILICO”. Skripsi ini disusun untuk memenuhi syarat dalam memperoleh

gelar S1 di fakultas farmasi Universitas Muhammadiyah Purwokerto.

Penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari berbagai pihak, penulis tidak

dapat menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Oleh karena itu pada kesempatan ini

penulis mengucapkan terima kasih kepada :

1. Drs. H. Syamsuhadi Irsyad, S.H., M.H. Rektor Universitas Muhammadiyah

Purwokerto

2. Dr. Nunuk Aries Nurulita, M.Si.,Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi dan dosen

pembimbing I, yang telah memberikan bimbingan, arahan dan petunjuk dalam

penyusunan skripsi ini dengan penuh kesabaran, ketekunan, sehingga dapat

diselesaikan dengan baik.

3. Dr. Asmiyenti Djaliasrin Djalil, M.Si. selaku dosen pembimbing II, yang telah

memberikan petunjuk dan motivasi yang tinggi, sehingga penyusunan skripsi ini

dapat terlaksana hingga selesai.

4. Seluruh dosen Fakultas Farmasi UMP yang telah memberikan ilmunya sehingga

dapat membantu penulis dalam menyelesaikan penulisan skripsi ini.

5. Prof. dr. H. Supargiyono, DTMH. S.U., Ph.D., Sp.ParK. yang telah memberikan

perkuliahan mengenai kultur sel kepada penulis sehingga penulis dapat

memahami tentang penelitian ini lebih dari sebelumnya.

6. Ibu Rumbiwati yang telah membimbing dan membantu jalannya penelitian ini.

7. Kedua orang tuaku tercinta yang telah memberikan dukungan moral, material dan

spiritual.

(10)

8. Siti Komerawati dan Agustina Olivia Nezar yang telah berjuang bersama,

terima kasih atas kerjasama, kesabaran serta suka dukanya selama penelitian

berlangsung.

9. Teman-teman seperjuangan Fakultas Farmasi Kelas B angkatan 2010 (Ayu,

Dewi, Dwi, Novi, Wulan, Richam), terima kasih atas kekompakan dan

kebersamaannya selama ini.

10.Kekasihku Agung Pratama dan sahabat – sahabatku Mutia, Anis, Via, Tantri,

Wening, dan Prita terima kasih atas dukungan dan do’a serta waktu yang selama ini telah diberikan.

11.Semua pihak yang telah membantu yang tidak dapat saya sebutkan

satu-persatu.

Penulis telah berusaha semaksimal mungkin agar penyusunan skripsi ini dapat

tersusun dengan sempurna, namun penulis menyadari bahwa tanpa bantuan dari

berbagai pihak penyusunan skripsi ini tidak akan berjalan baik. Dengan segala

kerendahan hati dan lapang dada, penulis menerima kritik dan saran yang

membangun dari para pembaca untuk kesempurnaan di masa datang.

Purwokerto, Maret 2014

Penulis

(11)

xxi

RIWAYAT HIDUP

Nama : Latifah

Tempat, Tanggal Lahir : Jakarta, 13 Januari 1993

Nama Orang Tua:

a. Ayah : Alm. Ismail

b. Ibu : Lulis Praptiwi

Riwayat Pendidikan

a. Sekolah Dasar : SD Negeri 05 Semper Timur tahun 1998 - 2004

b. Sekolah Menengah Pertama : SMP Negeri 8 Purwokerto tahun 2004 – 2007

c. Sekolah Menengah Atas : SMA Negeri 2 Purwokerto tahun 2007 – 2010

d. Perguruan Tinggi : Fakultas Farmasi Universitas Muhammadiyah

Purwokerto

(12)

DAFTAR ISI

(13)

xxiii

• Metode Docking ... 12

BAB III METODE PENELITIAN • Jenis dan Rancangan Penelitian ... 14

• Variabel Penelitian ... 14

• Definisi Variabel Operasional ... 14

• Waktu dan Tempat Penelitian ... 15

• Bahan Uji Sitotoksisitas ... 16

• Bahan Uji Apoptosis ... 16

• Bahan Docking Molecular ... 16

• Alat ... 17

• Cara Penelitian ... 17

• Pembuatan Larutan Uji ... 17

• Uji Sitotoksisitas Citrulline dan Doxorubicin Tunggal dengan Metode MTT ... 17

• Uji Sitotoksisitas Kombinasi Doxorubicin dan Citrulline……. 18

• Uji Apoptosis Tunggal dan Kombinasi ... 18

• Docking ... 18

• Analisis Hasil ... 19

• Uji Sitotoksisitas ... 19

• Analisis Apoptosis ... 19

• Analisis Docking ... 19

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN • Potensi Sitotoksik Citrulline dan Doxorubicin Tunggal ... 21

(14)

• Potensi Sitotoksik Kombinasi Citrulline dan Doxorubicin ... 27 • Potensi Apoptosis Citrulline dan Doxorubicin ... 29 • Docking Molekuler ... 31 BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

• Kesimpulan ... 35 • Saran ... 35 DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN

(15)

xxv

DAFTAR TABEL

Tabel 1. Persen viabilitas citrulline terhadap MCF-7 ... 23

Tabel 2. Persen viabilitas doxorubicin terhadap MCF-7 ... 23

Tabel 3. Persen viabilitas citrulline terhadap MCF-7 ... 26

Tabel 4. Persen viabilitas sel MCF-7 yang diberi perlakuan citrulline dan

doxorubicin ... 28

Tabel 5. Skor docking terhadap protein 4IXV ... 34

(16)

DAFTAR GAMBAR

Gambar 6. Struktur native ligan (Beta-mercaptoethanol ) ... 17

Gambar 7. Reduksi MTT di dalam sel hidup oleh enzim reduktase di dalam mitokondria menghasilkan kristal formazan ... 21

Gambar 8. Morfologi sel MCF-7 diamati di mikroskop cahaya ... 23

Gambar 9. Perbandingan morfologi sel MCF-7 yang digunakan dengan ATCC.. ... 25

Gambar 10. Hubungan % viabilitas dengan konsentrasi doxorubicin dengan citrulline tunggal.. ... 27

Gambar 11. Morfologi sel MCF-7 setelah perlakuan kombinasi doxorubicin dan citrulline ... 28

Gambar 12. Hubungan % viabilitas dengan konsentrasi doxorubicin tunggal dan kombinasi doxorubicin.. ... 28

Gambar 13. Efek perlakuan kombinasi doxorubicin – citrulline terhadap penghambatan pertumbuhan sel MCF-7 pada konsentrasi 50 nM – 500 nM.. ... 29

Gambar 14. Morfologi sel akibat perlakuan citrulline dan doxorubicin setelah pengecatan dengan menggunakan double staining.. ... 31

Gambar 15. Visualisasi protein 4IXV menggunakan aplikasi YASARA. ... 33

Gambar 16. Visualisasi ligan BME menggunakan aplikasi YASARA ... 33

(17)

xxvii

DAFTAR SINGKATAN

FBS (Fetal Bovine Serum)

ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

DMSO (Dimethyl Sulfoxide)

MTT {(3-(4,5-dimethylthyazoyl-2-yl)-2,5 diphenyltetrazolium bromide)

PBS (Phosphate Buffered Saline)

DMEM (Dulbecco’s Modified Ecgle Medium)

SDS (Sodium Duodecyl Sulphate)

NOS (Nitric Oxide Synthase)

nNOS (neural Nitric Oxide Synthase)

eNOS (endhothelial Nitric Oxide Synthase)

iNOS (inducible Nitric Oxide Synthase)

NO (Nitric Oxide)

BME (Beta-mercaptoethanol)

(18)

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran

Lampiran 1. Perhitungan seri konsentrasi pertama citrulline dan doxorubicin

pada uji sitotoksik tunggal... 41

Lampiran 2. Perhitungan seri konsentrasi kedua citrulline dan doxorubicin pada uji sitotoksik tunggal ... 44

Lampiran 3. Perhitungan seri konsentrasi untuk uji sitotoksik kombinasi citrulline dan doxorubicin ... 47

Lampiran 4. Perhitungan seri konsentrasi untuk apoptosis ... 50

Lampiran 5. Pemetaan dan hasil absorbansi seri konsentrasi pertama doxorubicin dan citrulline uji sitotoksik tunggal ... 52

Lampiran 6. Pemetaan dan hasil absorbansi seri konsentrasi kedua doxorubicin dan citrulline uji sitotoksik tunggal ... 53

Lampiran 7. Pemetaan dan hasil absorbansi kombinasi doxorubicin dan citrulline ... 54

Lampiran 8. Perhitungan IC50 doxorubicin ... 55

Lampiran 9. Perhitungan IC50 citrulline ... 59

Lampiran 10. Perhitungan t tabel tak berpasangan . ... 62