UJI EFEK SITOTOKSIK EKSTRAK ETANOL KULIT BUAH ASAM KANDIS (Garcinia cowa Roxb.) TERHADAP SEL KANKER PAYUDARA T47D DENGAN
METODA MTT (MICROTETRAZOLIUM) ASSAY
Fatma Sri Wahyuni, Suci Sutma, Yufri Aldi
Fakultas Farmasi Universitas Andalas
ABSTRACT
The evaluation of cytotoxic effect on ethanolic extract from the fruit rinds of asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) on T47D human breast cancer cells in vitro had been evaluated. The cytotoxic effect was carried out by using MTT assay. Extraction of dried fruit rinds of G. cowa Roxb. was macerated with ethanol 70%. The extract was prepared into 4 concentration groups, 100, 10, 1, and 0,1 µg/ml. Results showed that the IC50 of G. cowa
Roxb. ethanolic extract was 19,33 µg/ml ± 1,15 on breast cancer T47D cells. The percentage of cells viability and concentration were analyzed analyzed by the two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Duncan test. Result showed that the ethanolic extract of G.
cowa Roxb gave a significant effect on T47D breast cancer cells viability (P<0.05).
Keywords: cytotoxic effect, asam kandis, Garcinia cowa Roxb.,T47D, MTT Assay
PENDAHULUAN
Tanaman asam kandis memiliki aktivitas biologis dan farmakologis yang bervariasi, seperti sitotoksik, antiinflamasi, antimikroba, antifungi, dan antioksidan (Mahabusarakam, Chairerk, and Taylor, 2004). Tanaman asam kandis ini telah digunakan oleh masyarakat, baik berupa buah, daun, akar, dan kulit batangnya dalam berbagai bidang. Di Thailand buah dari asam kandis dapat digunakan sebagai ekspektoran, laksatif, dan untuk memperbaiki sirkulasi darah. Akarnya dapat digunakan sebagai penurun panas dan kulit batangnya sebagai antipiretik dan antimikroba, sedangkan ekstrak kasar dari daun asam kandis ini dalam pengobatan tradisional di Thailand sudah digunakan sebagai antitumor (Mahabusarakam, et al., 2004). Di Indonesia, asam kandis
merupakan tanaman yang digunakan sebagai bumbu masak, terutama di Sumatera Barat.
Dari berbagai penelitian diketahui bahwa tanaman asam kandis mengandung santon, santon terprenilasi, maupun santon tertetraoksigenasi pada hampir semua bagiannya seperti pada akar, batang, kulit batang, daun, buah dan getahnya (Wahyuni et al., 2004; Mahabusarakam et al., 2004; Shen and Yang, 2005; Panthong et al., 2006; Darwati et al, 2010). Telah ditemukan bahwa santon dan santon terpenilasi menunjukkan potensi sitotoksik yang kuat sehingga dapat dijadikan sebagai agen sitotoksik baru yang potensial (Jabit et al., 2009).
Insidensi kanker payudara di negara berkembang semakin meningkat dari tahun ke tahun (Yaar et al., 2007). Insidensi kanker payudara di Indonesia
belum diketahui secara pasti karena belum ada registrasi kanker berbasis populasi (Sirait, Oemiati, dan Indrawati, 2009). Menurut data Sistem Informasi Rumah Sakit (SIRS) di Indonesia tahun 2007 diketahui bahwa kanker payudara menempati urutan pertama penyakit keganasan pada pasien rawat inap wanita di rumah sakit (Departemen Kesehatan RI, 2009).
Pengobatan kanker dilakukan dengan empat cara utama yaitu melalui pembedahan, radiasi, kemoterapi dan terapi biologi (Dipiro, et al., 2009). Penggunaan kemoterapi antikanker belum memberikan hasil yang optimal karena bekerja tidak spesifik sehingga dapat merusak sel normal. Pembedahan umumnya tidak efektif lagi untuk sel yang telah mengalami metastasis. Penyinaran sering kali tidak selektif dan tidak aman untuk sel-sel normal (Supardjan dan Meiyanto, 2002).
Obat antikanker yang ideal seharusnya dapat mematikan sel kanker tanpa membahayakan jaringan sehat. Namun, sampai sekarang belum ditemukan obat yang memenuhi kriteria demikian. Karenanya, usaha penelitian terus dilakukan untuk menemukan obat kanker yang ideal. Salah satu sumber obat-obatan kemoterapi yang potensial yaitu tumbuh-tumbuhan sehingga sampai saat ini pencarian obat-obatan kemoterapi dari tumbuh-tumbuhan terus dilakukan (Sukardiman, Ekasari, Hapsari, 2006). METODE PENELITIAN
Alat
Alat-alat yang digunakan untuk uji aktivitas sitotoksik berupa sarung tangan karet, botol semprot, labu Erlenmeyer, gelas piala, flask culture (Iwaki®), botol Duran, mikrotube, pipet mikro
(Ecopipette®), mikrotube, hemasitometer, timbangan analitik, autoklaf (Hirayama®), lemari es (Sharp®), inkubator 370C/5% CO2 (Thermo Scientific®), microbiological safety cabinet air flow kelas II (Thermo
Scientific®), vortex (Ika®), penangas air (Memert®), sentrifus (Thermo Scientific®), tabung sentrifus (Iwaki®), mikroskop
inverted (Zeiss®), microplate 96 well (Iwaki®), dan spektrofotometer microplate
(xMarkTM).
Bahan
Bahan yang digunakan yaitu kulit buah asam kandis yang didapat dari daerah Toboh Ketek, Padang Pariaman, Sumatera Barat. Bahan yang digunakan untuk uji efek sitotoksik yaitu sel kanker payudara manusia T47D diperoleh dari koleksi Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Gajah Mada, dimetil sulfoksida (DMSO), etanol 70%, air ultrapurifikasi, medium Roswell
Park Memorial Institute (RPMI) 1640
(Gibco®), Fetal Bovine Serum (FBS, Gibco®), Penicillin-Streptomycin (Gibco®), Tripsin-EDTA (Gibco®),
Phosphate buffer Saline (PBS, Gibco®), dan reagen MTT [3-(4,5- dimetilthiazol- 2- il)-2,5- difeniltetrazolium bromida] (Sigma®).
Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Asam Kandis
Kulit basah asam kandis dipisahkan dari daging buahnya, dibersihkan dan dikeringkan. Sampel dimasukkan ke dalam beberapa wadah gelas berwarna gelap dan dimaserasi dengan etanol 70% selama 5 hari sambil sekali-sekali diaduk. Maserasi dilakukan sebanyak 3 kali pengulangan. Hasil maserasi diuapkan pelarutnya dengan alat rotari evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental etanol.
Uji Sitotoksisitas Ekstrak (MTT Assay) Dibuat suspensi sel yang mengandung 2x103 sel/180 μl medium kultur. Sebanyak 180 μl suspensi yang berisi sel kanker T47D dimasukkan ke dalam masing-masing sumuran microplate 96 well kemudian diinkubasi selama 24 jam di inkubator 370C/5% CO2 untuk beradaptasi
dan menempel di sumuran.Setelah itu ditambahkan ekstrak etanol kulit buah asam kandis dengan konsentrasi 100, 10, 1 dan 0,1 μg/ml dan diinkubasi selama 24 jam di inkubator 370C/5% CO2.
Selanjutnya, ke dalam setiap well plate ditambahkan 20 µl larutan MTT 5 mg/ml dan microplate diinkubasikan di inkubator 370C/5% CO
2. Setelah 4 jam, larutan
dipipet dan ke dalam sumuran ditambahkan 100 μl DMSO untuk melarutkan kristal formazan. Absorbansi kemudian dibaca dengan menggunakan spektrofotometer microplate pada λ 550 nm. Pengujian masing-masing dengan 3 ulangan kontrol sel dan kontrol media.
Analisis Data
Dengan menggunakan data absorban yang diperoleh dari pengukuran, dapat ditentukan persentase sel yang terhambat dengan menggunakan rumus sebagai berikut:
% Viabilitas= X 100%
Hubungan antara konsentrasi larutan uji dengan viabilitas sel dapat ditampilkan dalam bentuk grafik. Dari grafik tersebut dapat ditentukan harga IC50 (konsentrasi
yang dapat menghambat 50% pertumbuhan sel) larutan uji. Selanjutnya, data hubungan antara konsentrasi sediaan uji dengan absorban dianalisis secara statistik menggunakan analisa varian (ANOVA) satu arah yang dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan (Duncan’s Multiple Range Test).
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil
Berdasarkan uji MTT yang telah dilakukan diketahui bahwa ekstrak etanol kulit buah asam kandis memiliki nilai dengan IC50
19,33 µg/ml. Penurunan persentase viabilitas sel meningkat seiring peningkatan konsentrasi ekstrak etanol kulit buah asam kandis. Pada konsentrasi 0,1 µg/ml diperoleh rata-rata persen viabilitas ± SE dengan nilai 90.0616575 ± 4.8259, konsentrasi 1 µg/ml diperoleh 81.5196925 ± 4.244, konsentrasi 10 µg/ml diperoleh 59.9005692 ± 4.4494, dan konsentrasi 100 µg/ml diperoleh 19.2525442 ± 2.1758. Dari hasil pengolahan data dengan uji Analisa Varian (Anova) satu arah antara persentase viabilitas sel kanker payudara T47D dengan konsentrasi sediaan uji didapat nilai signifikan 0,000 (P < 0,05) dan nilai F hitung 60,725 > F tabel 2,82, sedangkan hasil pengolahan data lanjutan menggunakan uji wilayah berganda duncan menunjukkan tiga subset yang berbeda yaitu kelompok konsentrasi 100 µg/ml, kelompok konsentrasi 10 µg/ml, dan kelompok konsentrasi 1 dan 0,1 µg/ml.
Hasil foto sel memperlihatkan morfologi sel yang berbeda antara sel yang diberi perlakuan dengan ekstrak uji dengan
Absorban kontrol - Absornasi blanko
Absornasi blanko
konsentrasi 100 dan 10 μg/ml dibandingkan dengan sel kontrol. Sedangkan pada sel uji yang diberi perlakuan dengan ekstrak uji dengan konsentrasi 1 dan 0, 1 μg/ml tidak memperlihatkkan morfologi sel yang berbeda.
Pembahasan
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efek sitotoksik ekstrak etanol kulit buah asam kandis secara in-vitro. Keuntungan
pengujian secara in-vitro yaitu senyawa yang digunakan untuk pengujian relatif sedikit, waktu yang diperlukan relatif cepat dan dapat memberi informasi tentang efek secara langsung pada sel manusia. Uji
in-vitro dilakukan terhadap
Gambar 1. Pengaruh ekstrak etanol kulit buah asam kandis terhadap sel kanker payudara T47D. Konsentrasi hambat (IC50) diukur dengan menggunakan metoda MTT. Data
ditampilkan dalam rata-rata ± SD (n=3)
Parameter Pengujian 1 Pengujian 2 Pengujian 3 Rata-rata SD IC50 18 µg/ml 20 µg/ml 20 µg/ml 19,33 µg/ml 1,15
Gambar 2.
Foto mikroskopis sel kanker payudara T47D yang diberi perlakuan dengan ekstrak etanol kulit buah asam kandis dengan konsentrasi A= 100 µg/ml ; B= 10 µg/ml ; C= 1 µg/ml ; D=
0,1 µg/ml pada perbesaran 10x
Gambar 3.
Foto mikroskopis sel kanker payudara T47D yang tidak diberi perlakuan dengan
ekstrak kulit buah asam kandis (kontrol) dengan perbesaran 10x
sel kanker payudara. Sel kanker payudara yang digunakan pada penelitian ini yaitu sel T47D. Sel kanker payudara T47D merupakan sel yang sensitif terhadap agen kemoterapi dan memiliki kemampuan replikasi yang cepat sehingga sangat cocok digunakan untuk uji sitotoksik. Keuntungan penggunaan lini sel pada pengujian yaitu mereka mudah ditangani dan dapat mereplikasi diri tanpa batas.
Selain itu, mereka menunjukkan tingkat homogenitas yang relatif tinggi dan mudah diganti dengan sel yang beku (frozen
stock) jika sel yang digunakan tidak layak
dipakai lagi, misalnya karena kontaminasi.
Metoda uji yang digunakan yaitu uji MTT dimana uji MTT merupakan suatu metoda uji sitotoksik secara kolorimetri untuk menentukan jumlah sel yang hidup berdasarkan perubahan larutan MTT yang berwarna kuning menjadi kristal formazan yang berwarna ungu oleh mitokondria yang aktif pada sel hidup. MTT diabsorpsi ke dalam sel hidup dan dipecah melalui reaksi reduksi oleh enzim reduktase dalam rantai respirasi mitokondria menjadi formazan yang tidak larut dalam air. Intensitas warna ungu yang terbentuk berbanding lurus dengan jumlah sel yang aktif melakukan metabolisme. Semakin tajam warna yang dibentuk, maka akan semakin tinggi nilai absorban, dan semakin banyak sel yang hidup (Mosmann, 1983).
C
D
Metoda MTT memberikan hasil pengujian yang akurat karena dapat memberikan hubungan antara jumlah sel yang aktif dengan absorban yang diperoleh dari pengukuran yang digunakan untuk menentukan nilai IC50. IC50 (Inhibitory
Concentration) merupakan nilai
konsentrasi yang menghasilkan hambatan proliferasi sel sebesar 50%. Nilai IC50
dapat menunjukkan potensi suatu senyawa sebagai sitotoksik (Melannisa, 2004).
Menurut The American National Cancer
Institute, suatu ekstrak dikatakan memiliki
aktivitas sitotoksik apabila nilai IC50 < 20
µg/ml (Lee & Houghton, 2005). Dari hasil uji MTT diketahui bahwa ekstrak etanol kulit buah asam kandis memiliki IC50
19,33 µg/ml. Dengan demikian, ekstrak etanol kulit buah asam kandis dikatakan memiliki aktivitas sitotoksik. Dari uji Analisa Varian (Anova) hubungan antara konsentrasi ekstrak etanol kulit buah asam kandis dengan persentase viabilitas didapatkan nilai P 0,000 < 0,05 dan F hitung 60, 725 > F tabel 2,82. Artinya, pemaparan ekstrak etanol kulit buah asam kandis memberikan pengaruh secara nyata terhadap persentase viabilitas sel kanker payudara T47D.
Untuk mengetahui perbedaan dari setiap variasi konsentrasi terhadap persentase viabilitas, pengolahan data dilanjutkan dengan uji wilayah berganda Duncan. Dari hasil uji wilayah berganda Duncan terdapat tiga kelompok subset yang menunjukkan terdapat tiga kelompok konsentrasi yang memberikan perbedaan yang nyata terhadap persentase viabilitas, yaitu kelompok konsentrasi 100 µg/ml, kelompok konsentrasi 10 µg/ml, dan kelompok konsentrasi 1 dan 0,1 µg/ml.
Namun, tidak terdapat perbedaan persentase viabilitas yang nyata antara variasi konsentrasi 1 dan 0,1 µg/ml.
KESIMPULAN
Ekstrak etanol kulit buah asam kandis (Garcinia cowa Roxb.) memiliki efek sitotoksik terhadap sel kanker payudara T47D dengan IC50 19,33 µg/ml.
Peningkatan konsentrasi ekstrak etanol kulit buah asam kandis dapat mempengaruhi persentase viabilitas sel kanker payudara T47D secara nyata (P < 0,05) pada kelompok konsentrasi 100 µg/ml, kelompok konsentrasi 10 µg/ml, dan kelompok konsentrasi 1 dan 0,1 µg/ml.
DAFTRA PUSTAKA
Darwati, Husen H. Bahti, Dachriyanus, & Supriyatna. (2010). Santon Terpenilasi Aktif Antioksidan dari Kulit Batang Garcinia cowa Roxb. J. bionatura. 11, 129-136.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, (2009). Profil kesehatan Indonesia 2008. Jakarta: Departemen Kesehatan Republik Indonesia.
Dipiro, Joseph., Talbert, Robert L., Yee, Gary C., Matzke, Gary R., Wells, Barbara G. & Posey, L. Michael. (2009).
Pharmacotherapy: A
Pathophysiologic Approach Seventh Edition. The McGraw-Hill Companies: United States of America.
Jabit, Md. Lip, Wahyuni, F.S, Rozida, K., Ahmad, I.D., Khozirah, S., Lajis Nordin H, & Johnson, S. (2009). Cytotoxic and nitric oxide inhibitory activities of methanol extracts of Garcinia species. Pharmaceutical Biology. 47(11): 1019–1026.
Lee, C.C & Houghton, P. (2005). Cytotoxicity of plants from Malaysia and Thailand used traditionally to treat cancer. J Ethnopharmacol, 2005; 100: 237-243. Mahabusarakam, W ., Chairerk, P., & Taylor,
W.C. (2004). Xanthones from Garcinia cowa Roxb. latex. Phytochemistry. 66 (2005) 1148–1153 Melannisa, R. (2004). Pengaruh PGV-1 pada Sel Kanker Payudara T47D yang diinduksi 17β-Estradiol: Kajian Antiproliferasi, Pemacuan Apoptosis dan Antiangiogenesis, (Tesis). Program Pasca Sarjana Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Mosmann, T. (1983). Rapid Colorimetric Assay for Cellular Growth and survival: Application to Proliferation and Cytotoxicity Assays. J. Immunol. Methods, 65 (1-2), 55-63.
Panthong, K., Pongcharoen, W., Phongpaichit, S., & Taylor, W.C. (2006). Tetraoxygenated xanthones from the fruits of Garcinia cowa. Phytochemistry. 67 (2006) 999–1004 Shen, Jie & Yang, Jun-Shan, (2005). Two
New Xanthones from the Stems of Garcinia cowa. Chem. Pharm. Bull. 54(1) 126—128 (2006) Vol. 54, No. 1 Sirait, A.M., Oemiati, R., & Indrawati, L.
(2009). Hubungan Kontrasepsi Pil dengan Tumor/Kanker Payudara di Indonesia. Majalah Kedokteran Indonesia Volum: 59, Nomor: 8, Agustus 2009
Sukardiman, Ekasari, W., & Hapsari, P.P. (2006). Aktivitas Antikanker dan Induksi Apoptosis Fraksi Kloroform Daun Pepaya (Carica papaya L.) terhadap Kultur Sel Kanker Myeloma. Media kedokteran hewan. vol. 22, No. 2, Mei 2006
Supardjan, A.M. & Meiyanto, E., (2002). Efek antiproliferatif pentagamavunon- 0 terhadap beberapa sel kanker. Yogyakarta: Lembaga Penelitian Universitas Gadjah Mada.
Wahyuni, F.S., Byrne, L.T., Dachriyanus, Dianita, R., Jubahar, J., Lajis, N.H., & Sargent, M.V., (2004). A New Ring-Reduced Tetraprenyltoluquinone and a prenylated xanthone from Garcinia cowa. Aust. J. Chem. 57: 223-226. Yaar, Mina, Eller, Mark S., Panova, I.,
Kubera, J., Wee, Lee H., Cowan, Kenneth H., & Gilchrest, B.A. (2007). Telomeric DNA induces apoptosis and senescence of human carcinoma cells. Breast Cancer Research, 9, R13.
