Ringkasan Pengkajian Keamanan Lingkungan Produk Rekayasa Genetik Vaksin Nobilis® rHVT-ND
I. Pendahuluan
Vaksin Nobilis® rHVT-ND merupakan produk rekayasa genetik (PRG) dengan kandungan virus Herpesvirus of Turkey (HVT) strain PB1 yang disisipi gen F dari virus Newcastle Disease Virus (NDV) strain Clone 30. Oleh karena itu, virus rHVT-ND mampu memberikan proteksi terhadapa dua jenis penyakit yang berbeda, yaitu penyakit Marek dan ND. Di samping itu, keunggulan vaksin tersebut mempunyai durasi proteksi yang lebih lama dibandingkan dengan vaksin konvensional sejenis. Secara khusus vaksinasi dengan vaksin Nobilis® r-HVT-ND tidak mengintroduksi virus ND utuh ke tubuh ayam, oleh karena itu timbulnya reaksi pasca vaksinasi yang pada umumnya terjadi pada vaksin ND aktif konvensional dapat dihilangkan.
Vaksin Nobilis® rHVT-ND diproduksi oleh Intervet Inc. (Merck Animal Health) USA, yang di negara lain terdaftar dengan nama Innovax-ND atau Innofusion-ND atau Marek’s Disease – Newcastle Disease Vaccine, Serotype 3, live Marek’s Disease Vector. Vaksin Nobilis® rHVT-ND akan dipasarkan oleh PT Intervet Indonesia untuk pengendalian dan penanggulangan penyakit Marek’s Disease (MD) dan Newcastle Disease (ND) pada ayam di Indonesia.
Sampai saat ini, vaksin Nobilis® rHVT-ND telah terdaftar dan memperoleh
Certificate of Free Sale di 19 negara, yaitu di Amerika Serikat (2010),
Kanada (2010), Costa Rica (2011), Yordania (2011), Thailand (2011), Kuwait (2012), Kolombia (2013), Guatemala (2013), Mexico (2013), Maroko (2013), Panama (2013), Peru (2013), Filipina (2013), Rusia (2013), Trinidad and Tobago (2013), Ukraina (2013), Brazil (2014) dan El Savador (2014).
Berdasarkan Peraturan Pemerintah No.21 Tahun 2005 tentang Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik, dan Peraturan Menteri Lingkungan Hidup No.25 Tahun 2012 tentang Pedoman Penyusunan Analisis Risiko Lingkungan Produk Rekayasa Genetik, maka Tim Teknis Keamanan Hayati Produk Rekayasa Genetik (TTKH PRG) telah melakukan pengkajian keamanan lingkungan vaksin Nobilis® rHVT-ND. Pengkajian didasarkan pada informasi genetik dan informasi keamanan lingkungan yang terdiri atas, sifat genetik yang direkayasa, stabilitas genetik jasad renik PRG,
kemampuan penyebaran jasad renik, hospes alami dari tetua jasad renik PRG dan kemungkinan menimbulkan risiko terhadap lingkungan, sebagaimana diuraikan di bawah ini.
II. Informasi Jasad Renik PRG
II.1 Deskripsi Umum Jasad Renik PRG
Jasad renik PRG yang digunakan untuk memproduksi Nobilis® rHVT-ND adalah virus HVT strain PB1 sebagai inang yang disisipi gen F virus ND strain Clone 30 sebagai gen donor.
II.2 Informasi Sifat Genetik Jasad Renik
Tetua jasad renik PRG adalah virus HVT Serotipe 3 strain PB1 yang merupakan strain virus MD yang tidak patogen dan telah digunakan secara luas sebagai strain vaksin untuk pencegahan penyakit Marek (Calnek et. al.1997)
Donor gen dari vaksin Nobilis® rHVT-ND ini adalah gen F dari virus ND strain Clone 30, yang termasuk dalam strain Lentogenik. Gen F telah biasa digunakan sebagai donor gen dalam produksi jasad renik PRG untuk vaksin hewan. Fungsi protein F adalah sebagai mediator fusi amplop virus dengan membran plasma (Ganar et al., 2014 dan Kapczynski
et al., 2013). Secara detil sekuen gen F virus ND strain Clone 30 ini dapat
dilihat di GenBank www.ncbi.nih.gov/genbank/ dengan nomor akses Y18898.1.
Lokasi penyisipan adalah pada tapak restriksi BglII pada posisi 138.193 di dalam open reading frame (ORF-086) HVT PB 1, yang merupakan bagian non-esensial bagi HVT. Jumlah kopi yang disisipkan adalah satu kopi. Penyisipan tersebut tidak memberikan dampak yang merugikan atau tidak mempengaruhi virulensi virus tetuanya, bahkan memberikan nilai tambah berupa perlindungan terhadap penyakit ND (Sondermeijer, 1993). Kestabilan sisipan gen F NDV dan promotornya pada HVT PB1 ketika di-pasase secara in vitro ditunjukkan pada Report 04R/0238. Sekuens gen F dan daerah HVT pengapit bersifat stabil setelah 11 kali pasase di sel kultur chicken embryo fibroblast (CEF). ditunjukkan dengan Virus PRG HVT/ND-F memiliki kesamaan identitas sekuens 100% dengan virus
Master Seed.Gen NDV-F stabil di dalam genom HVT dan tidak mengubah
HVT/NDV-F menjadi virulen ketika di-pasase secara in vivo (Report 7.
Genetic and phenotypic stability of HVT/NDV-F following back passage through the natural host;).
II.3 Metode Konstruksi Genetik
Virus rekombinan berasal dari rekombinasi klasik homolog vektor rekombinan linear (berisi gen F NDV dengan sekuens promotor yang nantinya diapit oleh sekuens HVT) dan genom HVT lengkap.
Langkah lengkap kloning terdapat pada flow chart “Cloning and
Generation of HVT/NDV-F” serta Sondermeijer et al., 1993. Secara singkat,
metode konstruksi genetik HVT/NDV-F adalah sebagai berikut:
1. Unique short segment (Us) dari DNA HVT yang dibuat dengan melakukan digesti parsial genom HVT dengan enzim Sau3A selanjutnya diligasi dengan vector pGEM3Z untuk menjadi pMD07. Plasmid pMD07 merupakan plasmid rekombinan yang mengandung daerah insersi genom HVT yang non-essential.
2. Konstruksi vektor rekombinan dibuat dengan menyisipkan daerah promoter long terminal repeat (LTR) dari virus Rous sarcoma (RSV) pada plasmid pRSVcat. Di bagian downstream dari promoter RSV LTR, yang merupakan fragmen hasil digesti NdeI-HindIII pada plasmid pRSVcat sebesar 0.6kb, dibuat daerah unik untuk beberapa situs restriksi yang memungkinkan untuk menyisipkan satu atau beberapa gen ke dalam vektor rekombinan. Rekombinasi plasmid pVEC01 yang mengandung LTR yang diapit sekuens genom HVT dari plasmid pMD07 sebesar 0.8 kb dan 0.4 kb selanjutnya merupakan plasmid pVEC04.
3. cDNA dari virus ND Clone 30 dimasukkan ke dalam pustaka λgt10. Filter replika dari pustaka λgt10 ditumbuhkan dalam E coli strain NM514 selanjutnya discreen/diseleksi untuk mendapatkan gen F dari virus NDV. Fragmen gen F tersebut disubklon ke plasmid pGEM4Z dan dimanipulasi dengan pemotongan situs menggunakan enzim Bal-31 untuk menghilangkan beberapa sekuens di bagian upstream dan downstream gen F untuk selanjutnya disebut plasmid pNDV01. Gen F virus ND dalam plasmid pNDV01 diklon pada situs BamHI dari plasmid pVEC04 pada bagian downstream dari promoter LTR untuk membuat plasmid pNDV04. 4. Plasmid pNDV04 dibuat linier dan ko-transfeksi dilakukan bersama
HVT-PB1 ke dalam biakan CEF. Rekombinan virus HVT yang mengandung gen F virus ND dideteksi dengan teknik indirect immunofluorecent menggunakan antibodi anti ND.
II.4 Karakter Modifikasi Genetik
Nobilis® rHVT-ND merupakan rekombinasi Herpesvirus of Turkey (HVT) strain PB-1 yang disipi gen F virus Newcastle Disease (ND) strain Clone 30.
Modifikasi genetik berupa penyisipan gen F virus ND ke genom HVT tidak mempengaruhi virulensi tetuanya (HVT), sebaliknya bahkan memberikan nilai tambah berupa ekspresi protein F virus ND yang berfungsi memberikan perlindungan terhadap infeksi virus ND.
Rekombinan HVT-ND bersifat stabil ketika dipasase 11 kali secara in vitro pada sel kultur CEF dan secara genotip dan fenotip stabil pada studi in
vivo setelah dilakukan back-passage 5 kali pada inang alaminya.
II.5 Kemungkinan terjadinya gen yang disisipkan pada jasad renik PRG untuk vaksin hewan dipindahkan ke organisme lain
Gen F yang disisipkan ke dalam genom HVT bersifat stabil sesuai dengan uraian pada butir II.2. Untuk mengetahui kemungkinan pemindahan gen donor (gen F) ke organisme lain telah dilakukan analisis BLAST pada nukleotida dari gen F virus ND strain Clone 30 dengan nomor akses Y18898.1.
Hasil analisis BLAST menunjukkan bahwa gen F tersebut tidak memiliki homologi dengan sekuen gen organisme lain, oleh karena itu pemindahan gen ke organisme lain tidak dimungkinkan.
II.6 Kesimpulan
Berdasarkan hasil pengkajian informasi genetik dapat disimpulkan bahwa:
a. Ekspresi dari gen interes (gen F dari virus ND) yang disisipkan dalam virus HVT tidak mengubah sifat virulensi HVT bahkan dapat memberikan nilai tambah perlindungan terhadap penyakit Marek dan ND.
b. Virus rekombinan HVT-NDV-F mengandung satu kopi gen F yang bersifat stabil secara genotip dan fenotip.
c. Tidak ada kemungkinan penyebaran/pemindahan gen F yang disisipkan dalam jasad renik PRG (HVT-NDV-F) ke organisme lain.
III. Informasi Keamanan Lingkungan III.1 Kemampuan Penyebaran Jasad Renik
Jasad renik PRG Nobilis® rHVT-ND memiliki sifat yang sama dengan virus HVT tetuanya yaitu tidak patogen dan tidak diekskresikan dalam ekskreta hewan sehingga tidak menimbulkan risiko buruk terhadap lingkungan (Sondermeijer, 1993).
III.2 Informasi Cakupan Inang Organisme Tetua Virus PRG untuk Vaksin Jasad renik tetua vaksin PRG Nobilis® rHVT-ND ini adalah virus HVT strain PB1 (HVT PB1). Inang alami dari virus HVT adalah kalkun (Calnek
et al., 1997).
III.3 Informasi Kajian Molekuler
Modifikasi genetik HVT strain PB-1 dengan penyisipan gen F asal NDV strain Clone 30. Lokasi penyisipan adalah di dalam open reading frame (ORF-086) HVT PB 1, yang merupakan bagian non-esensial bagi HVT. Tujuan dari modifikasi gen ini adalah untuk membuat vaksin PRG yang mengandung virus HVT rekombinan yang mengekspresikan protein F NDV, sehingga penggunaan vaksin Nobilis® rHVT-ND dapat menginduksi kekebalan dan memberikan perlindungan ganda terhadap penyakit Marek dan ND.
Virus rekombinan HVT/NDV-F mengandung satu kopi gen F virus ND yang bersifat stabil secara genotip dan fenotip, serta tidak ada kemungkinan penyebaran/pemindahan gen F yang disisipkan dalam jasad renik PRG (HVT-NDV-F) ke organisme lain sehingga aman terhadap lingkungan.
Penanda yang dapat dipakai untuk mengidentifikasi jasad renik PRG ini adalah sekuens gen F virus ND strain Clone 30. Teknik untuk mengidentifikasi sekuens ini dapat menggunakan teknik Polymerase
Chain Reaction (PCR) dengan menggunakan primer sebagai berikut:
Forward primer F2: TGAACATGTCGCATCCCTGC; dan Reverse primer R7: ATTCTTCATGCAATTGTCGG.
III.4 Kemungkinan dampak negatif jasad renik PRG vaksin terhadap lingkungan
Hasil analisis BLAST nukleotida dari gen F menunjukkan tidak ditemukan homologi sekuen genom organisme lain, sehingga kemungkinan transfer gen ke organisme lain tidak dimungkinkan.
Vaksin PRG Nobilis® rHVT-ND tidak membentuk spora karena tetua dari vaksin ini adalah termasuk dalam golongan virus. Hasil studi menunjukkan bahwa tidak ada penyebaran virus melalui kontak antara ayam yang divaksin dan ayam yang tidak divaksin (Report 5. Test for
Spreading of the Recombinant Herpesviruses of Turkey HVT/NDV-F to Various Avian Species after Intramuscular Inoculation). Hal ini
mengindikasikan bahwa kemungkinan penyebaran virus vaksin rekombinan dari peternakan ayam sangat tidak mungkin terjadi.
Virus vaksin dapat menyebar ke lingkungan kemudian menginfeksi inang alamiahnya yaitu kalkun, namun sebagaimana sifat alami tetuanya virus ini tidak bersifat patogen.
Kesimpulan
1. Vaksin Nobilis® rHVT-ND bersifat aman terhadap lingkungan karena tidak berisiko menyebarkan jasad renik ke lingkungan.
2. Berdasarkan kajian stabilitas genotip dan fenotip jasad renik PRG dalam vaksin Nobilis® rHVT-ND dinyatakan stabil.
3. TTKH PRG Bidang Keamanan Lingkungan menilai bahwa vaksin Nobilis® rHVT-ND yang diajukan adalah aman terhadap lingkungan.
4. Apabila kemudian ditemukan data dan informasi baru yang tidak sesuai dengan data keamanan lingkungan yang diperoleh hingga saat ini, maka status aman lingkungan terhadap vaksin Nobilis® rHVT-ND perlu dikaji ulang.
5. Apabila telah ditetapkan aman lingkungan, kemudian produk tersebut terbukti menimbulkan risiko terhadap kesehatan manusia dan hewan maka pemohon wajib melakukan tindakan pengendalian dan penanggulangan serta memusnahkan vaksin Nobilis® rHVT-ND yang berada di wilayah teritori Indonesia.
6. Vaksin Nobilis® rHVT-ND tidak boleh digunakan sebagai vaksin ayam sebelum memperoleh sertifikat aman lingkungan dari Kementerian Lingkungan Hidup dan Kehutanan
Pustaka
1 Calnek BW, Barnes JH, Beard CW, McDougald LR, Saif YM. 1997.
Disease of Poultry: Marek’s Disease. Iowa State University Press: USA.
Hal. 369 – 413
2 Ganar K, Das M, Sinha S, Kumar S.. 2014. Newcastle disease virus: Current status and our understanding. Virus research (184): 71 – 81. 3 Kapczynski DR, Afonso CL, Miller PJ. 2013. Immune responses of
poultry to Newcastle disease virus. Dev. and Comparative Immun. (41): 447 – 453.
4 Sondermeijer PJA, Claessens JAJ. Jenniskens PE, Mockett APA, Thijssen RAJ, Willemse MJ, Morgan RW. 1993. Avian herpesvirus as a live viral vector for the expression of heterologous antigens. Vaccine 11 (3): 349-358.
5 Laporan No. 04R/0238. Genetic Stability of the HVT-NDV F recombinant
by sequence analysis of the insertion site and flanking regions. Hal. 1 – 8.
6 SID Innovax-ND. Intervet Schering-Plough, 2010. Report 7. Genetic and
Phenotypic Stability of HVT/NDV-F Following Backpassage through the Natural Host. Hal. 141 – 154.
7
Flow Chart Cloning and Generation of Innovax-ND. Internal Documents Global R&D MSD Animal Health.
Schematic representation of pNDV04. Internal Documents Global R&D MSD Animal Health.
Sequence of NDV04. Internal Documents Global R&D MSD Animal Health [Report No. 04R/0238]
8 Blast Result of the NDV-F gene
9 Newcastle disease virus cDNA to complete genomic RNA, clone 30.
