Anti Tirosinase Ppt

(1)

ANTI TIROSINASE

(2)

Pendahuluan

•

Melanin = pigmen atau zat warna alami pada

makhluk hidup

•

Melanin berlebih = Timbul noda coklat pada

kulit, terlalu berlebihan

kulit, terlalu berlebihan dapat menyebabk

dapat menyebabkan

an

hiperpigmentasi

•

Pembentukan

Pembentuk

an melanin:

melanin:

Melanosit

__

Melanin

(Proses ini dikat

(Proses ini dikatalisasi oleh

alisasi oleh sinar UV dan

sinar UV dan enzim

enzim

tirosinase)

(3)

Pendahuluan

•

Melanin = pigmen atau zat warna alami pada

makhluk hidup

•

Melanin berlebih = Timbul noda coklat pada

kulit, terlalu berlebihan

kulit, terlalu berlebihan dapat menyebabk

dapat menyebabkan

an

hiperpigmentasi

•

Pembentukan

Pembentuk

an melanin:

melanin:

Melanosit

__

Melanin

(Proses ini dikat

(Proses ini dikatalisasi oleh

alisasi oleh sinar UV dan

sinar UV dan enzim

enzim

tirosinase)

(4)

•

• Dengan menginhibisi enzim Dengan menginhibisi enzim tirosinasetirosinase  prosesproses

pembentukan melanin melambat

pembentukan melanin melambat __

mencerahkan warna kulit mencerahkan warna kulit

•

• Inhibitor enzim tirosinase antara lain:Inhibitor enzim tirosinase antara lain: •

• Asam askorbatAsam askorbat •

• ArbutinArbutin •

• Kojic acidKojic acid •

• MerkuriMerkuri •

(5)

•

• Penelitian terus berlanjut untuk mendapatkanPenelitian terus berlanjut untuk mendapatkan

senyawa inhibitor tirosinase yang aman dan senyawa inhibitor tirosinase yang aman dan efisien

efisien

•

• Senyawa aktif dalam bahan alam yang berfungsiSenyawa aktif dalam bahan alam yang berfungsi

sebagai inhibitor tirosinase diantaranya adalah sebagai inhibitor tirosinase diantaranya adalah arbutin

arbutin , , asam elagat, oksiresveratrol, kloroforin,asam elagat, oksiresveratrol, kloroforin, dan noratokarpanon, dan artokarpanon.

dan noratokarpanon, dan artokarpanon.

•

• Tanaman Tanaman yang memiliyang memiliki senyawa aktif ski senyawa aktif sebagaiebagai

inhibitor tirosinase biasanya juga memiliki inhibitor tirosinase biasanya juga memiliki

senyawa aktif yang berfungsi sebagai antioksidan senyawa aktif yang berfungsi sebagai antioksidan

(6)

Jurnal 1

POTENSI EKSTRAK Rhizophora sp. SEBAGAI INHIBITOR TIROSINASE

(Potency of Rhizophora sp. Extracts as Tyrosinase Inhibitor) Eti Rohaeti1, Irmanida Batubara1,2, Anastasia Lieke LDN1,

Latifah K Darusman1,2

1 Departemen Kimia FMIPA Institut Pertanian Bogor 2 Pusat Studi Biofarmaka LPPM Institut Pertanian bogor

(7)

Alat dan Bahan

ALAT

lempeng KLT analitik

kertas saring Whatman nomor 1

chamber , gelas piala gelas ukur pipet mohr

pipet volumetrik pelat silika gel tabung reaksi neraca analitik penguap putar vortex . BAHAN R. mucronata R. Stylosa Metanol

(8)

(9)

Preparasi dan Ekstraksi Rhizophora sp.

Pemisahan bagian daun, batang, dan akar yang

kemudian dikeringkan dan direndam dalam larutan metanol

Sampel tanaman kering ini diekstraksi dengan metanol dengan perbandingan 1:10 selama 24 jam sebanyak 3 kali ulangan

Ekstrak yang diperoleh disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman nomor 1 dan dipekatkan

(10)

Sampel daun, batang, dan akar R. mucronata dan batang

R. stylosa yang telah kering selanjutnya diekstraksi menggunakan metode maserasi.

(11)

• Maserasi dilakukan dengan cara merendam sampel ke dalam pelarut

metanol. Rendemen yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 2.

• Berdasarkan hasil ekstraksi sampel Rhizophora sp.dari berbagai daerah,

rendemen tertinggi dari ekstrak metanol daun, batang dan akar Rhizophora sp.berturut-turut terdapat pada daerah Gebang, Cirebon; Pantai Kapuk, Jakarta; dan Gebang, Cirebon, yaitu sebesar 28.33%; 16.06%; dan 14.36%.

(12)

• Berdasarkan Tabel 2, diperoleh bahwa sebagian besar ekstrak daun,

batang, dan akar yang berasal dari pulau Jawa tidak memberikan nilai IC50 pada monofenolase dan difenolase hingga konsentrasi 2000μg/ml.

• Hal ini mengindikasikan bahwa bagian daun, batang, dan akar R.

mucronata dari pulau Jawa tidak memiliki potensi inhibitor tirosinase. Ekstrak daun, batang, dan akar R. mucronata dan R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur memiliki potensi sebagai inhibitor tirosinase pada monofenolase. Ekstrak akar R. mucronata memiliki aktivitas inhibitor tirosinase lebih baik daripada daun dan batang dari segi monofenolase. Jika dibandingkan dengan batang R. mucronata, maka batang R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur memiliki aktivitas inhibitor tirosinase yang lebih baik dalam hal monofenolase

(13)

KESIMPULAN

• Ekstrak R. mucronata yang berasal dari daerah pulau

Jawa tidak memiliki aktivitas inhibitor tirosinase, sedangkan ekstrak R. mucronata dan R. stylosa

daerah Samboja, Kalimantan Timur memiliki aktivitas inhibitor tirosinase. Aktivitas akar R. mucronata dan batang R. stylosa dari Samboja, Kalimantan Timur memberikan daya penginhibisi yang lebih baik, yaitu dari segi monofenolase (IC50: 15.34 μg/ml dan IC50: 38.02 μg/ml).

(14)

(15)

Pendahuluan

• Anti tirosinase menjadi penting karena dapat

menghambat sintesa dari pigmen melanin

• Karena kemampuannya untuk menurunkan

pigmentasi, anti tirosinase penting dalam

beberapa bidang, meliputi industri kosmetik, sebagai obat, dan dalam industri makanan .

• Meskipun melanin menghasilkan zat yang efektif

secara kuat melawan radiasi sinar UV, tetapi akumulasi melanin yang abnormal dapat

menyebabkan masalah dalam bidang kecantikan seperti melasma, bintik-bintik, dan pikun

(16)

• Meskipun anti tirosinase dapat diperoleh dari dua cara yaitu secara

alami dan sintesis, dilakukan upaya pencegahan untuk terjadinya komersialisasi pada inhibitor ini.

• Ada banyak jenis anti tirosinase seperti hidrokinon, derivat asam

askorbat, asam azelat, retinoid, arbutin, dan kojic acid.

• Namun, telah diketahui bahwa beberapa pemutih, seperti

hidrokinon dan kojic acid merupakan bahan yang berbahaya karena memiliki efek samping yang tidak diharapkan seperti sitotoksisitas, kanker kulit, dan dermatitis.

• Telah disintesis senyawa baru yang memiliki struktur berbeda yang

dapat menjadi solusi dalam mengatasi gangguan pada kulit terkait dengan pigmentasi.‘

(17)

Tujuan

• Identifikasi dan karakterisasi antitirosinase baru.

• Efek hambatan dari 3-DBP pada aktivitas tirosinase

murin dan, melanogenesis dievaluasi menggunakan model invitro dengan sel melanoma tikus B16F10.

• Selanjutnya digunakan tikus tanpa rambut HRM2

secara invivo. 3-DBP diidentifikasi sebagai senyawa pemutih kulit yang dapat digunakan dalam mengatasi hiperpigmentasi kullit tanpa senyawa yang bersifat sitotoksik.

(18)

Metode dan bahan

1. Bahan

• 3-DBP mengandung 1 pirolidin-dion telah

disintesis menggunakan reaksi Wittig di dalam laboratorium.

• Mushroom tirosinase L-tyrosine, α-melanocyte

stimulating hormone (α-MSH), dan reagen kimia lain yang dibeli dari Sigma (St.Louis, MO, USA).

• Antibodi terhadap tirosinase,

microphtalmia-associated transcription factor (MITF), dan β -actin dibeli dari laboratorium bioteknologi Santa Cruz ( Santa cruz, CA, USA).

(19)

Sintesis dari

(E)-3-(

2,4-dihydroxybenzylidene)pyrrolidine-2,5-dione

(20)

(21)

Kultur sel

• Sel melanoma murin B16F10 diperoleh dari American

Type Culture Collection (Manassas, VA, USA).

• Sel dikultur dalam media Dulbecco's Modified Eagle

(DMEM), yang mengandung 10% serum janin sapi (FBS, Gibco, NY, USA), dan penisilin / streptomisin (100IU/50µg/mL) dengan kelembaban udara di atmosfer mengandung 5% CO₂ pada suhu 37oC.

• Sel B16F10 dikultur dalam 24 sumuran untuk control

hidup (MTT) dan 60 Π dish untuk uji ketersediaan melanin dan uji aktivitas tirosinase. Semua percobaan dilakukan 3 kali untuk meyakinkan keakuratannya.

(22)

Uji stabilitas sel

• Uji viabilitas sel diperoleh dari

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT; Sigma). Selanjutnya 5 x 104 sel diletakkan pada masing-masing sumuran dari 24 sumuran.

• Setelah sel diberi 3-DBP pada rentang konsentrasi

10-200µM selama 24 jam, larutan MTT ditambahkan dan derivat tidak larut berasal dari sel dehidrogenase yang larut dalam campuran etanol dan dimetilsulfoksida (EtOH-DMSO, larutan 1:1).

• Serapan dari masing-masing sumuran pada 560 nm

(23)

Evaluasi aktivitas mushroom

tyrosinase

• 20 µL larutan cair dari tirosinase jamur (100 unit)

ditambahkan pada 96 sumuran microplate dengan 200 µL campuran reaksi yang mengandung 1mM larutan L-tyrosine, 50 mM dapar fosfat (pH 6,5), dan bahan uji 3-DBP (0.5-10µM).

• Larutan uji diinkubasi pada suhu 25oC selam 30 menit. • Setelaah inkubasi, sejumlah dopachrome yang

dihasilkan oleh larutan pereaksidalam mikroplate reader dideteksi dengan spektrofotometri pada λ 492 nm (OD₄₉₂).

(24)

•

Konsentrasi hambatan -50 (IC

₅₀

) adalah

konsentrasi

dari

senyawa

yang

dapat

menghambat respons standar sebesar 50%.

•

Untuk menghitung mekanisme hambatan dari

3-DBP,dilakukan uji kinetik tirosin. Berbagai

macam konsentrasi L-tyrosine (16, 8, 4, 2,

1mM) digunakan pada uji inhibisi.

•

Sesudah

pengujian,

masing-masing

hasil

dihitung mengikuti plot Lineweaver-Burk.

•

Hasil plot menunjukkan kecepatan reaksi (1/V)

berbanding dengan konsentrasi substrat (1/S).

Berdasarkan pada konvergensi garis pada plot,

maka mekanisme inhibisi dapat ditemuk

(25)

Penentuan kadar melanin

• Pada penelitian ini jumlah melanin digunakan sebagai

indeks dari melanogenesis.

• Secara singkat, sel B-16 diletakkan pada 60Π-dish dan

diinkubasi dengan atau tanpa 100 µM α-MSH, selanjutnya sel diinkubasi selama 48 jam dengan atau tanpa 3-DBP pada rentang konsentrasi dari 10 – 100 µM.

• Setelah dicuci 2X dengan PBS, sampel dilarutkan dalam

500 µL NaOH 1N. Sampel diinkubasi pada 60o C selama 1 jam dan diaduk untuk melarutkan melanin.

• Diukur serapannya pada λ 405 nm dibandingkan dengan

(26)

Evaluasi aktivitas tirosinase sel

• Aktivitas tirosinase pada sel B16F10 diukur

berdasarkan pada laju oksidasi L-DOPA. Sel diletakkan pada 60Π- well dishes dengan kepadatan 5×104 cells/mL..

• Sel B16 diinkubasi dengan atau tanpa 100µM α

-MSH dan diuji selama 48 jam dengan berbagai macam konsentrasi (10-100µM) dari 3-DBP.

• Sel- sel digoreskan pada 500µL dari 50 µM dapar

Na₃PO₄ (pH6.8) mengandung 25 µL dari 1% Triton X-100 dan 25 µL dari 0,1 µM fenilmetil-sulfonil florida dan dibekukan pada -80oC selama 30 menit

(27)

•

Setelah diencerkan dan diaduk, ekstrak

seluler diklarifikasi dengan cara sampel

disentrifugasi pada 12000 X g selama 30

menit pada 4

o

C.

•

Supernatan (80µL) dan 20 µL dari L-DOPA

(2mg/ml) diletakkan pada p96-well palte,

dan diukur serapannya pada

λ

492 nm dan

dibaca setiap 10 menit selama 1 jam pada

37

o

_{C menggunakan ELISA plate reader.}

(28)

Uji dengan western blot

•

Sel hasil penggoresan /sel lisat (20µg dari

masing-masing protein) dimasak selama 5

menit dalam gel- mengandung dapar (0,125

M Tris-HCl, pH6,8, 4% SDS, 10%

2-merkaptoetanol, dan 0,2 % biru bromfenol).

Pada perbandingan 1:1, total protein setara

dengan

masing-masing

sampel

secara

terpisah menggunakan SDS-PAGE pada 10%

dan dipindahkan ke membran polivinilidin

fluorida (PVDF).

(29)

• Membran secara cepat ditempatkan pada blocking buffer (5%

susu nonfat) dalam 10 mM Tris, pH 7,5, 100mM NaCl, dan 0,1% Tween 20. Bercak disimpan pada suhu ruang selam 1 jam.

• Membran diinkubasi dengan antibody spesifik primer pada 4oC

selama 24 jam, diikuti dengan inkubasi horseradish peroxidase conjugated anti-mouse antibody (Santa Cruz, 1:10,000), anti rabbit antibody (Santa Cruz, 1:10,000), atau anti-goat antibody (Santa Cruz, 1:10,000) pada 25 °C selama 1 jam .

• Pelabelan antibody dideteksi menggunakan West-zol Plus dan

chemiluminescence Fluorchem TMSP (Alpha Innotech Corporation, San Leandro, CA, USA). Protein penanda bercak digunakan untuk menemukan bobot molekul.

(30)

Evaluasi aktivitas depigmentasi pada

mencit tanpa bulu hmr2

• Efikasi depigmentasi secara in vivo dari 3-DBP

diujicobakan pada hewan telah dilakukan oleh Universitas Nasional Pusan.

• Mencit tanpa bulu jantan berusia 6 minggu HRM-2

yang mengandung melanin diperoleh dari Laboratorium Hewan Hosino (Yasino, Saitama, Jepang) dan ditempatkan dalam ruang kontrol (23o _{C ±}

1o C, kelembaban 55 ± 5%, 12 jam pencahayaan / ruang gelap) dengan pemberian air dan diet standar lab seperlunya.

• Setelah periode aklimasi (2 minggu), mencit dibagi

(31)

• 3-DBP disiapkan dalam 3 konsentrasi (0,4 ; 2; dan

10µM) dalam larutan propilen glikol dan etanol (3:7).

• Larutan kontrol dan larutan 3-DBP terlarut (200µL)

dioleskan secara topikal pada tempat yang ditandai (3 cm X 3 cm) pada bagian kulit dorsal hewan sekali sehari.

• Hewan dipaparkan dengan UVB dalam sebuah

CROSSLINKER (BEX-800, Ultra-Lum, Inc.,

Claremont, CA, USA) pada 150mJ/cm2_.

• Warna kulit diukur menggunakan

spektrofotometer CR-10 (Konica Minolta Sensing, Inc., Sakai, Osaka. Jepang) dimana warna dijelaskan berdasarkan nilai L*, a*, dan b* menurut sistem warna dari komisi internasional l’Edairage.

(32)

Pewarnaan fontana-masson

•

Kulit yang telah diberi 4% paraformoldehid

selama 1 malam pada suhu ruang dan diuji

warna untuk melanin menggunakan kit

pewarnaan Fontana-Masson dari American

Mastertech, Inc (Lodi, CA, USA) mengikuti

instruksi manufaktur.

•

Secara singkat, lembaran kulit yang telah

diwarnai dengan larutan Ag ammoniacal

selama 60 menit pada 60

o

C diikuti dengan

inkubasi dalam AuCl

₂

0,1% dan kemudian

dalam Na

₂

S

₂

O

₃

5%

(33)

Hasil

• 3-DBP didesain dengan kombinasi karakter struktur dari

resorsinol dan pirolidin-2,5-dion menjadi 1 senyawa. 3-DBP (gambar. 1a) disiapkan dengan reaksi Wittig antara 2,4-dihidroksibenzaldehid dan trifenilfosforidenil suksinamid, yang telah disintesis dari reaksi adisi Michael dari trifenilfosfin menjadi maleimid (gambar 1b).

• Proses reaksi Wittig dilakukan dalam refluk perlahan

dengan metanol akan dihasilkan 3-DBP sebanyak 82 % yang padat dan berwarna coklat pucat. Isomer dengan konfigurasi (E) diperoleh dari filtrasi dari pengendapan dalam reaksi Wittig.

• Struktur 3-DBP diperoleh dengan 1H dan 13C NMR dan

(34)

(35)

Penemuan efek anti melanogenesis

dalam mushroom tyrosinase

•

Dalam gambar 2a, tergambar aktivitas

hambatan tirosinase

•

Nilai IC

₅₀

dari 3-DBP dan faktor pembanding

(reservatrol dan asam kojat) ditunjukkan

dalam gambar 2b. Nilai IC

₅₀

yang rendah dari

3-DBP mengindikasi bahwa memiliki nilai

potensial dibandingkan reservatrol dan asam

kojat yang digunakan sebagai kontrol positif

(36)

(37)

(38)

(39)

Evaluasi aktivitas depigmentasi 3-dbp

dalam klutur sel

• Digunakan sistem sel melanoma B16F10 untuk mengevaluasi aktivitas depigmentasi dari 3-DBP • Hasil uji invitro dari sel B16F10 dengan 3-DBP

untuk pertahanan sel , aktivitas tirosinase dan keberadaan melanin ditunjukkan pada gambar 3 • Hasil uji viabilitas menggunakan MTT untuk sel B16F10 (gambar. 3a) menunjjukkan bahwa 3-DBP relatif tidak bersifat sitotoksik pada sel

(40)

(41)

(42)

(43)

Efek 3-dbp dalam pigmentasi kulit

secara invivo

•

Efek hambatan dari 3-DBP dalam pigmentasi

kulit secara in vivo yang diuji pada kandungan

melanin dari mencit tanpa bulu ditunjukkan

dalam gambar. 4a

•

Hewan yang diberi larutan 3-DBP selama 3

hari

dan

diberi

paparan

UVB

tidak

menunjukkan adanya iritasi kulit

•

Paparan UVB mengurangi pigmentasi yang

(44)

(45)

(46)

(47)