ISOLASI DAN IDENTIFIKASI STAPHYLOCOCCUS SP
I. PENDAHULUAN
Isolasi adalah mengambil mikroorganisme yang terdapt di alam dan menumbuhkannya dalam suatu media buatan. Proses pemisahan atau pemurnian dari mikroorgnanisme lain perlu dilakukan karena semua pekerjaan mikrobiologis, misalnya telaah dan identifikasi mikroorganisme, memerlukan suatu populasi yang hanya terdiri dari satu jenis mikroorganisme saja.
Proses isolasi dapat dilakukan dengan menumbuhkan pada media padat, selanjutnya sel – sel microorganism akan membentuk suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya.
Staphylococcus sp merupakan gram positif berbentuk bulat, biasanya bergerombol seperti buah anggur. Saat ini terdapt kurang lebih 32 spesies Staphylococcus sp namun yang penting secara klinik bagi manusia yaitu Staphylococcus aureus, Stapylococcus epidermidis, dan Staphylococcus saprophyticus.
II. PRINSIP
Prinsip Isolasi : memisahkan satu jenis mikroorganisme dengan mikroorganisme lainnya yang berasal dari campuran bermacam – macam mikroorgnanisme tersebut
Prinsip Kerja : pemeriksaan dilakukan dengan melakukan identifikasi berdasarkan pada pemeriksaan mikroskopik dengan pewarnaan gram, pembiakan (morfologi dan sifat koloni), uji katalase dan uji biokimia, uji plasma koagulase dan DNase, dan uji resistensi terhadap antibotik novobiosin.
III. TUJUAN
Untuk mengisolasi Staphylococcus sp sehingga dapat mengidentifikasi jenis spesies dari Staphylococcus sp ( mengidentifikasi Staphylococcus aureus, Stapylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus ).
IV. TINJAUAN PUSTAKA
Staphylococcus berasal dari kata staphylos berarti kelompok buah anggur dan coccus berarti bulat. Kuman ini sering ditemukan sebagai flora normal pada kulit dan selaput lendir manusia.Pada tahun 1880 Pasteur mengenal mengisolir micrococcu yang membentuk kelompok. Pada tahun 1881 Oyston berhasil mengisolir micrococci dari abces. Pada tahun 1884 Rosenbach untuk pertama kalinya mempelajari Staphylococcus secara mendalam sehingga berhasil mengenal varietas aureus, albus dari micrococcus pyogenes.
A. Kalasifikasi Staphylococcus
Genus Staphylococcus mencakup 32 spesies. Kebanyakan tidak berbahaya dan tinggal di atas kulit dan selaput lendir manusia dan organisme lainnya. Mereka juga menjadi mikroba tanah. Genus ini dapat ditemui di seluruh dunia.
Kingdom : monerA Divisio : Firmicutes Class : Bacilli Order : Bacillales Family : Sthapylococcacae Genus : Staphyloccocus Spesies : Staphylococcus aureus
Staphylococcus citerus Staphylococcus albus Staphylococcus epidermidis
B. Morfologi dan Fisiologi Morfologi
Bentuk : bulat, ukuran 1 mikron. Tidak membentuk spora. Tidak mempunyai flagela. Letak sel satu sama lain yang karakteristik bergerombol seperti buah anggur. Sifat karakteristik ini dipakai sebagai pemberian nama Staphylococcus. Tetapi kadang-kadang ada yang letaknya tersebar atau terpencar. Pengelompokan ini akan terlihat baik pada pengamatan penanaman dalam media padat. Pasangan atau rantai pendek lebih sering terlihat dalam smear nanah dan kultur dalam kaldu. Sifat pewarnaan : pada kultur muda bersifat Gram (+), sedang pada kultur tua bersifat Gram (-).
Koloni micrococci tumbuh cepat pada media agar pada suhu normal (370), dan biasanya bergaris tengah 1-2 mm setelah inkubasi 24 jam. Koloni tadi halus, basah, menonjol dengan tepi bulat dan berwarna, yaitu pada varietas albus berwarna putih, varietas citreus berwarna kuning jernih dan varietas aureus berwarna kuning emas. (Jawtez, 1996)
Fisiologi
Micrococci tumbuh paling baik pada suhu 220 – 370. Umumnya dapat tumbuh dalam lingkungan aerob maupun anaerob. Produksi warna terlihat baik pada situasi aerob dan terlihat paling baik pada kultur yang tumbuh pada suhu rendah.
Produksi toksin pada semua strain terlihat pada penanaman dalam media sederhana yang berisi asam-asam amino, garam glukosa dan faktor pertumbuhan yaitu thiamin dan asam nicotinat. Dalam garis besarnya strain aureus lebih aktif metabolismenya dari pada strain albus. Dalam media kaldu yang berisi dekstrosa, sukrosa, maltosa, dan manitol akan terjadi pemecahan karbohidrat menjadi asam tanpa gas. (Jawetz, 1996)
C. Patogenitas
Staphylococcus merupakan penyebab terjadinya infeksi yang bersifat poogenik. Untuk pembuatan kultur dapat diambil bahan dari pernanahan kecil, bisul kecil, bisul besar, dan abces diberbagai bagian tubuh. Bakteri ini dapat masuk ke dalam kulit melalui folikel-folikel rambut, muara kelenjar keringat dan luka-luka kecil. Kemampuan yang menyebabkan penyakit dari staphylococcus adalah gabungan dari efek yang ditimbulkan oleh produk-produk ekstraseluler, daya infasi kuman dan kemampuan untuk berkembang biak.
Staphylococcus patogen mempunyai sifat sebagai berikut: Dapat menghemolisa eritrosit
Menghasilkan koagulasi’dapat membentuk pigmen (kuning keemasan)
Dapat memecah manitol menjadi asam
Diantara staphylococcus yang mempunyai kemampuan besar untuk menimbulkan penyakit ialah Staphylococcus aureus. Staphylococcus nonpatogen bersifat:
Non hemolitik
Tidak menghasilkan koagulasi Koloni berwarna putih
Tidak memecah manitol
Infeksi yang ditimbulkan oleh Staphylococcus dapat meluas ke jaringan sekitarnya, perluasannya dapat melalui darah atau limfe, sehingga pernanahan disitu bersifat menahun, misalnya sampai pada sumsum sehingga terjadi radang sumsum tulang (osteomyelitis). Perluasan ini dapat sampai ke paru-paru, selaput otak dan sebagainya.
D. Toksin dan Enzim
Staphylococcus dapat menyebabkan penyakit karena kemampuannya berkembang biak dan menyebarluas dalam jaringan tubuh serta adanya beberapa zat yang dapat diproduksi olehnya, zat tersebut ialah:
1) Eksotoksin
Bahan ini dapat diketemukan di dalam filtrat hasil pemisahan dari kuman dengan jalan menyaring kultur. Bahan ini bersifat tidak tahan pemanasan dan bila disuntikkan kepada hewan percobaan dapat menimbulkan kematian dan nekrose kulit. Eksotoksin ini mengandung hemolisin, yang dikenal dalam beberapa jenis:
a) Alfa hemolisin : ialah putih telur yang dapat menghancurkan eritrosit kelinci dan dapat mempengaruhi otot polos pembuluh darah.
b) Beta hemolisin : ialah suatu putih telur yang dapat menghancurkan eritrosit kambing (tetapi tidak pada eritrosit kelinci) dalam 1 jam pada suhu 37o
c) Gama hemolisin : bersifat antigen.
Eksotoksin ini bila ditambah formalin akan kehilangan sifat toksinnya dan terbentuk toksoid yang dapat digunakan untuk imunisasi, walaupun akhirnya tidak dipakai karena nilai imunitasnya tidak ternilai. (Lowy, F. 2003)
2) Leukosidin
Yaitu suatu suspensi yang dihasilkan oleh Staphylococcus yang bersifat membinasakan atau mematikan leukosit dari berbagai macam spesies binatang. Leukosidin juga suatu antigen tetapi lebih termolabil daripada eksotoksin. (Lowy, F. 2003)
3) Enterotoksin
Yaitu suatu suspensi yang dihasilkan oleh jenis Staphylococcus tertentu, terutama bila ditanam pada media setengah padat dengan konsentrasi CO2 yang tinggi (30 %). Sifat-sifat enterotoksin: bersifat antigen Termostabil, tidak mengalami perubahan pada perebusan selama 30 menit.
Merupakan salah satu penyebab gejala keracunan makanan dengan gejala berupa: lesu, kejang perut, berak-berak
(diare), muntah-muntah, yang terjadi 1-6 jam setelah makan makanan yang mengandung enterotoksin. (Lowy, F. 2003)
4) Koagulase
Yaitu suspensi seperti enzim yang terdiri atas putih telur yang dapat mengendapkan plasma sitrat atau plasma oksalat. Staphylococcus patogen kebanyakan menghasilkan bahan ini. (Lowy, F. 2003)
5) Lain-lain produk ekstra seluler dari Staphylococcus :
a) Stafilokinase yang dapat dengan lambat melarutkan fibrin seperti streptokinase.
b) Penisilinase, yang dapat merusak penisilin G. c) Hialuronidase
d) Proteinase
e) Lipase (Lowy, F. 2003)
E. Pemeriksaan Laboratorium
Untuk pemeriksaan staphylococcus secara laboratorium dapat dilakukan dengan bermacam-macam cara.
Bahan pemeriksaannya dapat berupa: Nanah
Darah Cairan otak Usapan luka
Pengambilan sampel untuk pemeriksaan mikrobiologi berneda dengan pemeriksaan laboratorium lainya. Pengambilan sampel untuk mikrobiologi harus dilakukan secar aseftik unuk mengindari adanya kuman bakteri lain yang tumbuh pada saat pembiakan pada media.
Pengambilan sampel darah untuk mikrobiologi harus dilakukan dengan cara :
1. Tindakan asepsis kulit secara melingkar dengan iodophor dan alkohol 70%
2. Darah diambil dengan spuit secara steril
3. Tanpa antikoagulan atau dengan sodium polyanetholsulfonate (SPS) (Yellow-capped tube) dan pindahkan darah ke botol media kultur
Pengambila sampel dari luka atau usapan luka :
Cara : biopsi(jar. Luka diambil sedikit) (terbaik), aspirasi(disedot)(ex, bisul yg tertutup), dan swab
Anaerob : biopsi dan aspirasi Aspirasi untuk :
Abses tertutup
Luka bergaung dengan cairan di dalamnya yang tertutup debris superfisial
Swab :
Pus diluar dibersihkan terlebih dahulu dengan swab yang telah dicelupkan dengan NaCl steril dengan swab baru buat usapan dari dasar ulkus
Tidak dianjurkan untuk mengambil pus yang berasal dari drain (Wahid, M. H. 2007)
V. CARA KERJA
Identifikasi dilakukan berdasarkan pada :
1. Pemeriksaan mikroskopik dengan pewarnaan gram Alat dan bahan :
Alat : - Kaca obejek - ose - Lampu spirtus - Mikroskop Bahan :
suspensi bakteri Staphylococcus sp
Cara kerja :
1) Buat apusan kering dari suspense bakteri yang tealh disediakan 2) Sedian yang telah difiksasi di bubuhi Kristal violet (1 menit)
3) Cuci dengan air mengalir, tetesi lugol (1 menit)
4) Cuci dengan air mengalir, tetesi alkolhol 96 % (20 – 30 detik) 5) Cuci dengan air mengalir, tetesi safranin (30 detik)
6) Cuci dengan iar mengalir, keringkan 7) Amati dengan mikroskop perbesaran 100X 2. Pembiakan (morfologi dan sifat koloni)
Bahan pemeriksaan ditanam pada perbenihan media agar darah dan MSA (manitol salt agar), inkubasi pada suhu 37℃ selama 18 – 24 jam. Kemudian hari berikutnya lakukan pengamatan koloni pada media tersebut. Kemudian dilakukan kembali pewarnaan gram dari koloni yang tumbuh untuk di identifikasi jenis spesies Staphylococcus nya. 3. Uji katalase dan uji biokimia
Uji katale untuk membedakan Staphylococcus dengan Streptococcus. Alat dan bahan :
Alat :
- Objek glass - Ose
- Lampu spirtus
Bahan :
- Koloni bakteri tersangka - Larutan 2H2O
Cara kerja :
1) Siapkan objek galss, ambil 1 ose koloni bakteri 2) Tetesi dengan 2H2O aduk dengan ose
3) Amati terbentuknya gelembung gas
Uji bikomia dengan manitol untuk membedakan spesies dari bakteri Staphylocccus sp.
Alat dan bahan : Alat :
- Ose
- Lampu spirtus
Bahan :
- Koloni bakteri tersangka - Media manitol
Cara kerja :
1) 1 ose koloni ditanam pada media manitol 2) Inkubasi pada suhu 37℃ selama 24 jam 3) Amati perubahan waran pada media 4. Uji plasma koagulase
Uji plasma koagulase digunakan untuk mengetahui bakteri Staphylococcus yang pathogen.
Alat dan bahan : Alat : - Ose - Lampu spirtus - Objek glass Bahan : - Plasma - Koloni bakteri Cara kerja :
1) 1 ose koloni bakteri di tempatkan pada objek glass 2) Tambahkan 1 tetes plasma sitrat manusia
3) Campur dan baca hasilnya, hasil positif akan di tandai dengan gumpalan putih.
5. Uji resistensi terhadap novobiosin Cara kerja :
1) Sediakan lempeng agar Mueller hinton, buat suspense kuman pada NaCl fisiologis sampai didapat kekeruhan 1 Mc farland
2) Tanam suspense kuman pada agar 3) Letakkan cakram antibiotic novobiosin 4) Inkubasi pada suhu 37 ℃ selama 24 jam.
VI. HASIL DAN PEMBAHASAN A. Hasil pengamatan
Hari I :
1. Hasil direct preparat dengan pewarnaan Gram
Sampel : se Bentuk : coccus
Susunan : bergerombol, satu kokus, diplokokus
Sifat : Gram positif Tersangka :Staphylococcus sp
Sampel : sa Bentuk : coccus
Susunan : bergerombol Sifat : gram positif
Tersangka : Staphylococcus sp
Hari II :
1. Morfologi koloni
Cirri-ciri koloni
Media
Agar Darah MSA
Koloni : se Koloni : sa Koloni : se Bentuk koloni Bulat Bulat Bulat
Diameter(mm) 3 mm 3 mm 0.1 mm
Warna Putih Putih Putih
Elevasi Convex / cembung Convex / cembung Convex / cembung Permukaan Molst / basah Molst / basah Molst / basah
Pinggiran Rata Rata Rata
Sifat hemolisis* - hemolisis - Mempermentasi
manitol
- - Tidak
memfermentasi manitol
2. Hasil pewarnaan Gram dari koloni tersangka media AD
Sampel : se Bentuk : coccus
Susunan : bergerombol, satu kokus, diplokokus
Sifat : Gram positif Tersangka :Staphylococcus sp
Sampel : sa Bentuk : coccus
Susunan : bergerombol, satu kokus, diplokokus
Sifat : Gram positif Tersangka :Staphylococcus sp
3. Hasil uji katalase : koloni + H2O2 → bergelembung, katalase positif (+)
Hari III :
No. Parameter pemeriksaan Hasil
1. Plasma koagulase Negatif (-)
2. Gula manitol Negatif (-)
3. Gula glukosa Positif (+)
4. Resistensi terhadap novobiosin Sensitif (diameter 20 mm)
B. Pembahsan
Cara pemeriksaan bakteri tersangka dapat dilakukan dengan car : 1. Pemeriksaan langsung
Dari bahan dibuat sediaan/preparat, kemudian diadakan pewarnaan. Dapat dipakai zat warna sederhana, tetapi lebih baik dengan zat warna Gram. Umumnya bersifat gram positif. Secara mikroskopis tidak dapat dibedakan antara staphylococcus patogen dan yang non patogen.
2. Penanaman
Kalau ditanam pada media agar darah selama 18 jam suhu 37O C akan tumbuh koloni. Untuk melihat ada tidaknya hemolisin, atau terbentuknya pigmen. Pengeraman harus lebih lama lagi. Pada infeksi campuran penanaman pada media ditambah 75 % NaCl agar flora lain sukar tumbuh.
3. Tes Koagulase
Plasma sitrat yang telah diencerkan 1:5 dicampur dengan pertumbuhan Staphylococcus dalam media cair dalam jumlah yang sama. Kemudian ditunggu selama 3 jam, apabila terjadi perjendelan berarti bahwa Staphylococcus tersebut menghasilkan
koagulase. Semua staphylococcus aureus yang tes koagulase positif adalah bersifat patogen terhadap manusia, kecuali staphylococcus albus yang dapat menyebabkan endocarditis (radang selaput dalam jantung).
4. Tes Manitol
Staphylococcus ditanam pada media cair (air pepton) + 5 % manitol + phenol merah (sebagai indikator). Setelah dieramkan 18-24 jam akan terjadi perubahan warna menjadi kuning; karena terbentuk asam.( Juuti, K. 2004)
Sama halnya dengan pemeriksaan bakteri tersangka pada praktikum kali ini yaitu dengan cara :
1. Pemeriksaan mikroskopik Dari kedua sampel didapat : Bentuk koloni : coccus
Susunan : bergerombol diplokokus, satu kokus Sifat : gram positef
Tersangka : Staphylococcus sp 2. Isolasi
Sampel bahan pemeriksaan diisolasi dalam media dan diinkubasi dalam inkubator dengan suhu 37o C selama 24 jam. a. Biakan pada Agar Darah (BAP= Blood Agar Plate)
Media BAP untuk membedakan bakteri yang menghemolisa darah dan non hemolisa.
Pengamatan koloni pada media:
Media Agar Darah : Koloni berwarna putih, halus, dan basah. Pada sampel sa di sekitar koloni menjadi jernih atau transparan pada terjadi hemolisis. Kemudian Yang tumbuh pada media BAP dengan koloni hemolisa positif kemudian dilakukan pembuatan preparat dan pewarnaan metode Gram ( karena Streptococcus juga hemolisa positif ).
Hasil Pemeriksaan : Bentuknya Coccus/bulat, ungu gram positif. Susunannya bergerombol seperti buah anggur. b. Biakan pada MSA (Manitol Salt Agar).
Media MSA : Koloni berwarna merah berarti tidak memecah manitol.
c. Koloni pada subkultur dilakukan uji katalase dan parameter pemriksaan yang lain.
Uji Katalase : 1 ose koloni + 1 ose H2O2 3%. Hasil positif dengan indikasi dengan terbentuknya gelembung. Tes katalase menentukan apakah organisme menghasilkan enzim katalase yang menguraikan hidrogen peroksida menjadi
air dan oksigen.
Parameter pemriksaan lain :
No. Parameter pemeriksaan hasil 1. Plasma koagulase Negatif (-)
2. Gula manitol Negatif (-)
3. Gula glukosa Positif (+)
4. Resistensi terhadap novobiosin Sensitif (diameter 20 mm) VII. KESIMPULAN Diagnostik bakteriologik :
Dari bahan pemeriksaan dengan sampel se didapatkan bakteri Staphylococcus epedermidis sedangkan dari sampel sa didapatkan bakteri Staphylococcus aureus.
VIII. DAFTAR PUSTAKA
Cahtim, A., dan Suharto. 1993. Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran. Jakarta: Bina Aksara Rupa. hal.39-52.
Jawetz, E., J. L. Melnick, E. A. Adelberg, G. F. Brooks, J. S. Butel and L. N. Orston. 1996. Mikrobiologi Kedokteran. Edisi 20. Diterjemahkan oleh E. Nugroho & R.F. Maulany. Jakarta: Buku Kedokteran EGC. hal. 211-215.
Juuti, K. 2004. Surface protein Pls of methicillin-resistant Staphylococcus
aureus role in adhesion, invasion and pathogenesis, and
evolutionary aspects. [Disertation]. Helinski: Department of Biological and Environmental Sciences Faculty of Biosciences. p. 61-63.
Lowy, F. 2003. Gram positive : the example of Staphylococcus aureus.
J Clinic Invest. 111(9): 1265-1273.
Wahid, M. H. 2007. Pengambilan specimen mikrobiologi . Dalam: Andra. Jakarta, 29 Juni-1 Juli. Jakarta: Farmacia.
