28
3 BAHAN DAN METODE
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Pengumpulan contoh ayam dan serangga dilakukan di sepuluh peternakan ayam ras petelur komersial di wilayah Kabupaten Bogor. Pengolahan serta analisis hasil penelitian dilaksanakan di Laboratorium Helmintologi dan Laboratorium Entomologi, Bagian Parasitologi dan Entomologi Kesehatan, Departemen Ilmu Penyakit Hewan dan Kesehatan Masyarakat Veteriner dan Laboratorium Terpadu FKH-IPB. Waktu yang diperlukan untuk survei awal dan pengumpulan sampel penelitian dilakukan pada bulan Maret sampai Mei 2006. Analisis laboratorium meliputi prosesing, penghitungan, identifikasi sestoda dan sistiserkoid, interpretasi hasil infeksi lapangan maupun infeksi laboratorium , serta analisis data memerlukan waktu selama 12 bulan.
3.2 Tahapan Penelitian
Tahapan penelitian meliputi observasi lapangan (Gambar 2 dan 3) dan laboratorium (Gambar 4 dan 5). Observasi lapangan bertujuan untuk mengetahui kejadian sestodosis dan sistiserkoidosis hasil infeksi alami dengan mengumpulkan sampel ayam, serangga, dan manur dari peternakan. Adapun observasi laboratorium bertujuan untuk menjelaskan peranan kumbang Alphitobius diaperinus dan lalat Musca domestica sebagai inang antara sestoda pada ayam
dari setiap peternakan. Tahapan observasi laboratorium meliputi infeksi coba sistiserkoid asal lapangan pada ayam coba. Perlakuan infeksi pada tikus coba dilakukan sebagai kontrol positif. Analisis profil protein whole worm extract
(WWE) sistiserkoid maupun sestoda bertujuan untuk mempelajari diagnosis cepat melalui identifikasi stadium sistiserkoid yang diharapkan dapat menduga bahwa sistiserkoid lapangan merupakan stadium larva sestoda yang ditemukan pada ayam.
3.3 Lokasi Peternakan
Di antara sepuluh peternakan contoh pada penelitian ini secara geografis terletak pada tipe iklim yang berbeda menurut banyaknya bulan basah dan kering
29 di wilayah Kabupaten Bogor. Kecamatan Cigudeg, Nanggung, dan Leuwisadeng terletak di wilayah basah. Sedangkan enam kecamatan yang lain yaitu Cibinong, Parung, Kemang, Ciseeng, Gunung Sindur, dan Rumpin terletak di wilayah kering dengan rataan curah hujan berturut-turut 300 mm dan 286 mm setiap bulan dalam setahun pada lima tahun terakhir. Suhu maksimum-minimum serta kelembaban setiap bulan di wilayah Kabupaten Bogor sebesar 22,5-31,5ºC, dan 84,5% pada tahun yang sama (Badan Meteorologi dan Geofisika 2006).
3.4 Populasi Penelitian
Peternakan contoh pada penelitian ini adalah peternak berskala besar (usaha) dengan kisaran populasi sebanyak 30.000 sampai >100.000 ekor, terdiri dari beberapa kelompok dengan populasi sekitar 10.000 ekor/kelompok. Ayam dipelihara dengan sistem kandang baterai dari kawat dengan kepadatan antara enam ekor sampai 11 ekor setiap kandang dengan rata-rata jumlah kandang 250 buah setiap kelompok. Tempat pakan dan minum terbuat dari seng atau pipa PVC, beberapa telah dilengkapi dengan nipple. Sebagian peternak memelihara
ayamnya sejak ayam kutuk (ayam berumur sehari atau DOC), dengan lokasi pemeliharaannya berdekatan atau satu lokasi dengan kandang baterai, ada pula yang berjarak sekitar 500 m hingga 1 km dari lingkungan kandang baterai. Secara keseluruhan terdapat tiga variasi ras ayam petelur yang dipelihara para peternak yaitu Isa Brown, Lochmann, dan Hisex, beberapa peternak memelihara campuran
antara dua ras. Umur ayam berkisar antara pulet (14 minggu) sampai menjelang afkir (80 minggu). Sehubungan dengan pengendalian kecacingan, jenis dan waktu pemberian antelmintika berbeda-beda di antara peternak-peternak, sebagian hanya
mengobati ketika diketahui ada infeksi saja. Setiap pengumpulan ayam contoh, pada tempat dan waktu yang sama juga mengumpulkan kumbang dan lalat contoh dari masing-masing peternakan.
3.5 Jumlah dan Pengambilan Contoh
Penelitian observasional ini menggunakan metode Lintas Bagian ( cross-sectional). Pengumpulan ayam contoh dilakukan secara acak sederhana menurut
30 bahwa n = jumlah ayam contoh, z = tetapan bernilai 2, P = dugaan rataan prevalensi, Q = 1-P, dan L = 0,1 untuk derajat kepercayaan dugaan prevalensi sebesar 95%. Angka prevalensi sestodosis pada ayam petelur komersial yang dipelihara dalam kandang baterai belum diketahui. Untuk mencapai derajat kepercayaan sebesar 95% maka dugaan nilai prevalensi pada penelitian ini ditentukan sebesar 50%, dengan harapan jumlah contoh dapat mewakili. Dengan demikian jumlah ayam contoh adalah n = 2x[(2)2x0,5x0,5/0,102] = 192 ekor ayam contoh. Faktor pengali dua adalah pengamatan dua kelompok umur pulet dan produktif. Pengumpulan lalat dan kumbang dilakukan sebanyak-banyaknya di sekitar kandang baterai ayam contoh.
3.6 Pengamatan Parasitologi
3.6.1 Penghitungan telur cacing tiap gram tinja (ttgt)
Penghitungan ttgt menggunakan metode McMaster (Permin & Hansen 1998) dengan pengenceran tinja 1:30 dilakukan sebelum ayam dikurbankan. Selain pemeriksaan tinja, dilakukan juga pemeriksaan manur untuk mengetahui adanya telur sestoda/proglotida gravid menggunakan metode modifikasi flotasi menurut Shaikenov et al. (2004).
3.6.2 Pengumpulan, penghitungan, dan identifikasi sestoda
Seluruh ayam dikurbankan, saluran pencernaan yang meliputi esofagus sampai rektum dikeluarkan dari tubuh ayam, digunting longitudinal sehingga lumen terbuka. Sestoda yang ditemukan diambil secara hati-hati tanpa meninggalkan skoleks menggunakan jarum kolektor. Cacing yang terkumpul dibilas beberapa kali dengan NaCl 0,86%, sebagian spesimen disimpan dalam larutan alkohol 10% di dalam refrigerator selama 24 jam untuk relaksasi dilanjutkan dengan fiksasi dalam larutan alkohol 70% dingin. Jumlah cacing dihitung per individu ayam untuk mengetahui derajat infeksi. Sestoda yang terkumpul sebagian diwarnai dengan medium Berlese untuk skoleks dan semichon’s acetocarmin untuk proglotida dewasa menurut (Kruse & Pritchard
31 sestoda mengikuti ciri-ciri yang dideskripsikan oleh Yamaguti (1959), dan Wardle & McLeod (1952). Sebagian spesimen sestoda disimpan dalam larutan phosphat buffer saline (PBS) untuk keperluan analisis profil protein.
3.6.3 Pengumpulan lalat M. domestica
Pengumpulan lalat dilakukan sebanyak-banyaknya dengan menggunakan tangguk serangga (sweep net) di bawah kandang, di atas manur, dan di sekitar
tempat pakan ayam contoh (Beintema et al. 1990). Lalat yang terkumpul
dimasukkan ke dalam kurungan kain kasa nilon halus berkerangka kayu berukuran 40x40 cm dilengkapi dengan larutan gula dalam botol plastik yang diberi sumbu kapas. Lalat tersebut dibawa dalam keadaan hidup ke laboratorium. Secara bertahap lalat M. domestica dipisahkan melalui identifikasi di bawah
mikroskop stereo menggunakan kunci Tumrasvin & Shinonaga (1978). 3.6.4 Pengumpulan kumbang A. diaperinus
Kumbang A. diaperinus dikumpulkan sebanyak-banyaknya dengan
mengumpulkan manur sebagai media biologisnya. Manur dikumpulkan dari bawah kandang di sekitar tiang-tiang penyangga, serta tinja yang menempel dan mengering di kandang baterai ayam contoh. Pengumpulan sampel manur dilakukan secara manual menggunakan sekop kecil berukuran 300 cc sebanyak tiga sekop di bagian permukaan dan bagian agak dalam pada setiap lokasi (Geden & Stoffolano 1988 dalam: Watson et al. 2000). Kumbang yang terkumpul
dimasukkan ke dalam toples plastik bertutup kain kasa nilon halus, dibawa ke laboratorium dalam keadaan hidup. Tahap selanjutnya adalah pemisahan jenis kumbang A. diaperinus di bawah mikroskop stereo menggunakan kunci Bousquet
(1990).
3.6.5 Pengumpulan, penghitungan, dan identifikasi sistiserkoid
Sistiserkoid dikumpulkan dari hasil pembedahan M. domestica dan A. diaperinus dengan prosedur sama. Sebelum pembedahan spesimen serangga
dicuci dan dibilas tiga kali dalam larutan fisiologis NaCl 0,85% steril menggunakan pengocok elektrik selama 20 detik setiap bilasan. Selanjutnya
32 diletakkan di atas gelas obyek, bagian-bagian tungkai, dan sayap dipotong dan dibuang. Kemudian larutan fisiologis steril diteteskan pada gelas obyek sebanyak tiga tetes pada tempat terpisah. Tubuh spesimen serangga dipotong menjadi tiga bagian yaitu kepala, toraks dan abdomen, setiap bagian diletakkan pada tiap tetesan larutan fisiologis yang telah disiapkan. Dengan menggunakan jarum bedah serangga, bagian tubuh lalat tersebut dipotong-potong menjadi bagian-bagian kecil, sistiserkoid akan mudah dibebaskan dari rongga tubuh serangga ke dalam cairan fisiologis. Pengumpulan, identifikasi, dan penghitungan sistiserkoid dilakukan di bawah mikroskop stereo. Sistiserkoid yang terkumpul dari setiap lalat maupun kumbang dihitung dan disimpan dalam tabung-tabung eppendorf 1,5 ml berisi larutan PBS. Panjang dan lebar sistiserkoid, protoskoleks, serta batil hisap, panjang serkomer, dan posisi protoskoleks diukur. Spesimen sistiserkoid dibagi menjadi dua bagian masing-masing untuk keperluan infeksi coba dan analisis profil protein.
3.6.6 Infeksi coba sistisekoid lapangan pada ayam, tikus, dan mencit coba Sebanyak 20 ekor ayam petelur berumur delapan minggu yang telah dibebas cacingkan dibagi menjadi lima kelompok perlakuan infeksi. Satu kelompok diinfeksi dengan NaCl fisiologis sebagai kelompok kontrol. Empat kelompok yang lain masing-masing dua kelompok diinfeksi dengan sistiserkoid dari kumbang dan lalat coba berturut-turut dengan dosis lima dan 10 sistiserkoid dengan menggunakan sonde lambung. Sebelum diinfeksi ayam coba dipuasakan selama 12 jam. Ayam coba diberi pakan dan minum ad libitum di kandang baterai
individu berkelambu. Setelah tiga minggu ayam dikurbankan untuk mengumpulkan sestoda hasil infeksi yang dilanjutkan dengan identifikasi kemudian dicocokkan dengan jenis sestoda yang ditemukan pada infeksi alami.
Perlakuan infeksi sistiserkoid asal kumbang pada tikus dan mencit coba dilakukan dengan prosedur yang sama sebagai kontrol positif. Sebanyak masing-masing 27 ekor tikus dan mencit berumur enam minggu yang telah dibebas cacingkan dibagi menjadi sembilan kelompok perlakuan infeksi. Satu kelompok diinfeksi dengan NaCl fisiologis sebagai kelompok kontrol. Delapan kelompok yang lain diinfeksi dengan kelompok sistiserkoid gelembung besar dan
33 sistiserkoid gelembung kecil masing-masing lima ekor dan 10 ekor menggunakan sonde lambung. Sebelum diinfeksi tikus/mencit coba dipuasakan selama 24 jam. Tikus/mencit coba diberi pakan dan minum ad libitum di kandang individu berupa
bak plastik berukuran 30x40 cm dengan tutup kawat di atasnya kemudian dibungkus kain kasa. Setelah tiga minggu tikus/mencit dikurbankan dengan kapas-kloroform secara inhalasi untuk mengumpulan sestoda hasil infeksi yang dilanjutkan dengan identifikasi.
3.7 Identifikasi sistiserkoid melalui karakterisasi profil protein whole worm extract (WWE) dengan metode sodium dedocyl sulfat-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)
Sebanyak 12 sampel whole worm extract (WWE) terdiri dari sistiserkoid
asal lalat M. domestica, sistiserkoid asal kumbang A. diaperinus, sestoda ayam,
serta sestoda tikus dan mencit. Empat sampel WWE sistiserkoid asal lalat dan dua sampel WWE sistiserkoid asal kumbang berasal dari individu lalat dan kumbang yang berbeda. Demikian pula dua jenis sestoda ayam yaitu C. infundibulum dan Raillietina (Raillietina sp., R. tetragona, dan R. cesticillus) berasal dari individu
ayam berbeda. Adapun WWE sestoda tikus (Hymenolepis diminuta) dan mencit
(H. microstoma) diperoleh dari stok laboratorium Helmintologi .
3.7.1 Preparasi protein WWE sestoda dan sistiserkoid
Sestoda dan sistiserkoid yang telah dicuci dan dibilas PBS digerus dan diresuspensi dengan PBS pH 7,4. Suspensi tersebut kemudian disonikasi, dilanjutkan dengan sentrifugasi dengan 12.000 G selama 30 menit pada suhu 40C. Supernatan yang diperoleh dikumpulkan masing-masing sebagai suspensi
crude WWE sestoda dan crude WWE sistiserkoid (Kato et al. 2005). Tahapan
perlakuan pengendapan (Scopes 1987) hanya dilakukan pada sampel yang jumlahnya mencukupi untuk karakterisasi berikutnya.
3.7.2 Karakterisasi protein WWE sestoda dan sistiserkoid
Jumlah total sampel yang dianalisis sebanyak 18 sampel WWE terdiri dari 11 sampel sestoda ayam, satu sampel sestoda mencit, satu sampel sestoda tikus, empat sampel sistiserkoid asal M. domestica, dan dua sampel sistiserkoid asal
34
A. diaperinus. Karakterisasi protein WWE dilakukan dengan teknik elektroforesis
menggunakan metode SDS-PAGE (Bio Rad) menurut Laemmli (1970) yang dimodifikasi. Pada penelitian ini menggunakan 12% gel pemisah dan 4% gel pengumpul dalam Tris-HCl. Proses running selama 120 menit dengan arus listrik
bertegangan 40 volt/12mA pada suhu kamar. Polipeptida yang digunakan sebagai standar berat molekul (Sigma) terdiri dari beta-galactosidase (116,0 kDa), bovine serum albumin (66,2 kDa), ovalbumin (45,0 kDa), lactate dehydrogenase (35,0
kDa), REase Bsp981 (25 kDa), beta-lactoglobulin (18,4 kDa), dan lysozyme (14,4
kDa). Pewarnaan pita-pita protein menggunakan pewarnaan perak. Penghitungan estimasi berat molekul setiap fraksi protein sampel yang dapat diamati dengan membandingkan jarak migrasinya dengan jarak migrasi protein penanda.
3.8 Analisis Data
Jenis-jenis sestoda yang ditemukan pada setiap dan antar peternakan dianalisis secara deskriptif. Pengaruh faktor-faktor asal inang (umur, kelompok populasi, adanya ayam kutuk, dan ras ayam), tipe iklim, dan tata laksana peternakan (sistem pemeliharaan terbuka dan tertutup, struktur bangunan kandang, pemberian antelmintika, dan pembuangan manur) terhadap kejadian sestodosis/sistiserkoidosis di uji dengan Chi-square. Perbedaan derajat infeksi
serta distribusi infeksi setiap jenis sestoda antar peternakan dianalisis dengan uji T dan analisis ragam satu arah serta uji non parametrik Kruskal Wallis (Sokal & Rohlf 1981). Adapun untuk mengetahui besarnya pengaruh dari faktor-faktor tersebut terhadap kejadian sestodosis/sistiserkoidosis dianalisis dengan regresi logistik (Hosmer & Lemeshow 2000, Danardono 2006) dengan persamaan:
Logit (Pi) = β0 + β1X1 + β2X2 + ………. + βkXk
Pi = peluang kejadian sestodosis memiliki nilai Y=1 jika terinfeksi sestoda/metasestoda, Y=0 jika tidak terinfeksi sestoda/metasestoda
X1 sampai Xk = faktor penjelas terhadap Y, yaitu faktor-faktor
(risiko) yang mempengaruhi sestodosis
β1 sampai βk = besarnya pengaruh X1 sampai Xk terhadap nilai
Y (faktor-faktor risiko terhadap sestodo- sis)
35 Gambar 2 Bagan alur pengumpulan sampel ayam, manur, dan serangga
tersangka inang antara. 1 Observasi sestodosis pada ayam. 2 Observasi sistiserkoidosis pada inang antara. 3 Observasi telur/proglotida gravid sestoda dalam manur.
Gambar 3 Bagan alur perlakuan setiap ekor sampel ayam dan manur. 1 Pengumpulan sestoda. 2 Pemeriksaan telur dalam tinja ayam. 3 Pemeriksaan telur dalam manur. 4 Identifikasi, penghitungan prevalensi, dan derajat infeksi sestoda lapangan. 5 Menghitung ttgt infeksi lapangan. 6 Menghitung telur sestoda dalam manur.
ayam disembelih
5 gram manur
sestoda telur sestoda telur sestoda Jenis Prevalensi Derajat infeksi ttgt telur/gram manur 5 6 1 2 3 4 2 1 3
10 sampel peternakan ayam petelur komersial
ayam petelur tiap peternakan: 10 x 22 ekor
serangga tersangka inang antara: 81-491 ekor A. diaperinus dan
85-802 ekor M. domestica sampel manur
36 Gambar 4 Bagan alur infeksi sistiserkoid lapangan pada ayam dan tikus coba. 1 Pembedahan setiap jenis inang antara untuk mengum- pulkan sistiserkoid. 2 Infeksi sistiserkoid asal A. diaperinus
pada tikus coba. 3 Infeksi sistiserkoid asal A. diaperinus pada
ayam coba. 4 Infeksi sistiserkoid asal M. domestica pada ayam
coba. 5 Identifikasi sestoda hasil infeksi coba.
Gambar 5 Bagan alur analisis profil protein WWE sistiserkoid dan sestoda asal peternakan. 1 dan 2 Pengumpulan sestoda dari ayam. 3 dan 4 Pengumpulan sistiserkoid dari serangga. 5 Analisis profil protein WWE sestoda dan sistiserkoid dengan Metode SDS-PAGE.
4 5 1 1 2 4 3 1 3 5 5 2
hasil analisis profil protein WWE dengan metode SDS-PAGE
4 M. domestica sistiserkoid asal A. diaperinus tikus coba ayam coba identifikasi A. diaperinus d i sistiserkoid asal M. domestica
sestoda hasil infeksi sistiserkoid M. domestica
sestoda hasil infeksi sistiserkoid A. diaperinus
