Analisa Kafein Dengan Alat HPLC

(1)

"Analisa Kafein Dengan Alat HPLC" "Analisa Kafein Dengan Alat HPLC"

JURNAL - KCKT

"Analisa Kafein Dengan Alat HPLC"

ABSTRAK

Penentuan kadar kafein dalam sampel kafein.

Penentuan kadar kafein dalam sampel kafein. Sampel di Sampel di larutkanlarutkan dengan pelarut aquabidest, kemudian sampel di saring dengan pompa dengan pelarut aquabidest, kemudian sampel di saring dengan pompa vakum dengan menggunakan kertas saring khusus ( kertas saring 47 mm, vakum dengan menggunakan kertas saring khusus ( kertas saring 47 mm, 0,45 µm ),

0,45 µm ), hasil saringan dianalisa dengan alat hasil saringan dianalisa dengan alat HP! ( High Per"orman#eHP! ( High Per"orman#e iquid !hromatogr

iquid !hromatograph$ ) dimana "asa aph$ ) dimana "asa gerakn$a adalah methanol %gerakn$a adalah methanol % aquabidest ( &0 m % 70

aquabidest ( &0 m % 70 m ), menggunakan detektor S'500  denganm ), menggunakan detektor S'500  dengan pan*ang gelombang '7' nm, menggunakan kolom kromasil +005!

pan*ang gelombang '7' nm, menggunakan kolom kromasil +005! +-+-,, dengan sistem pengaliran "asa gerakn$a adalah isokratik. Hasil

dengan sistem pengaliran "asa gerakn$a adalah isokratik. Hasil per#obaanper#obaan menun*ukkan k

menun*ukkan konsentrasi larutan #ontoh $aitu 5,0-- onsentrasi larutan #ontoh $aitu 5,0-- ppm $ang di ppm $ang di in*eksiin*eksi seban$ak +5 µ dan

seban$ak +5 µ dan mempermemperoleh /aktu retensi selama +,000 menitoleh /aktu retensi selama +,000 menit dengan 12 3 4500&, 12  3 '4,&&, H26H 3 -'4-, H26H  3 dengan 12 3 4500&, 12  3 '4,&&, H26H 3 -'4-, H26H  3 7',45.

7',45.

ABSTRA

ABSTRACT

CT

Determination of caeine content in a sample

Determination of caeine content in a sample of caeine.of caeine. Samples Samples dissolved in a solvent aquabidest, then samples were fltered with a

dissolved in a solvent aquabidest, then samples were fltered with a vacuum pump by using a special flter paper (flter paper 47

vacuum pump by using a special flter paper (flter paper 47 mm, 0.45mm, 0.45 m!, the "ilter was a

m!, the "ilter was analy#ed by instrumnaly#ed by instrument o" $%&' ($igh %er"oent o" $%&' ($igh %er"ormancermance &iquid 'hromatography! in which the movement phase is

&iquid 'hromatography! in which the movement phase is methanol methanol  aquabidest ()0 m& 70 m&!, using the S*500 + detector with a

aquabidest ()0 m& 70 m&!, using the S*500 + detector with a wavelength o" *7* nm, using a column -romasil 00/5'

wavelength o" *7* nm, using a column -romasil 00/5', the drainage, the drainage system is an isocratic

system is an isocratic phase motion. 1he e2perimental results showed thephase motion. 1he e2perimental results showed the concentration o" sample solution is 5,0 ppm o" the in3ection

concentration o" sample solution is 5,0 ppm o" the in3ection o" 5 &o" 5 & and obtained during the retention time ,000 minutes with 6 8 and obtained during the retention time ,000 minutes with 6 8 4500), 69 8 *4,)), $:;$1 8 *4, $:;$1 8 7*,459. 4500), 69 8 *4,)), $:;$1 8 *4, $:;$1 8 7*,459.

BAB I

PENDAHULUAN

A .Latar Belakan A .Latar Belakan

(2)

HP! (High Per"orman#e iquid !h0an oromatoggraph$) atau biasa *uga disebut dengan kromatogra8 #air kiner*a tinggi (9!9) dikembangkan pada akhir tahun +:;0an dan a/al tahun +:70an, saat ini HP!

merupakan teknik pemisahan $ang diterima se#ara luas untuk analisis bahan obat ,baik dalam bulk atau dalam sediaan "armasetik.

nstrumentasi HP! pada dasarn$a terdiri atas % /adah "ase gerak,pompa,alat untuk memasukkan sampel(tempat in*eksi) kolom,dete#tor,/adah penampungbuangan "ase gerak,dan suatu #omputer atau integrator atau perekam. (http%<<en./ikipedia.org</iki< kromatogra8 #air kiner*a tinggi (9!9)

9a"eina atau populern$a ka"ein ialah sen$a/a alkaloid =antina berbentuk 9ristal dan berasa pahit $ang beker*a sebagai obat perasangsang

psikoakti" dan diureti# ringan.ka"eina ditemukan oleh seorang kimia/an *erman "riedri#h >erdinand runge pada tahun +-+:.a men#iptakan istilah

?ka@einA untuk meru*uk pada sen$a/a kimia pada kopi. B.R!m!san "asala#

• Peralatan $ang digunakan untuk analisa #ontoh dalam bentuk bulk

atau sediaan "armasetik

• Prinsip ker*a dari HP! • Sumber dari ka"ein

$. T!%!an

+..ntuk mengetahui #ara menggunakan HP!

'. ntuk dapat menentukan retention time,area,kadar area, height dan kadar dari ka"ein.

BAB II

PE"BAHASAN

9romatogra8 !air 9iner*a inggi (9!9) atau High Pressure iquid !hromatograph$ (HP!) merupakan salah satu metode kimia dan 8sikokimia. 9!9 termasuk metode analisis terbaru $aitu suatu teknik kromatogra8 dengan "asa gerak #airan dan "asa diam #airan atau padat. Ban$ak kelebihan metode ini *ika dibandingkan dengan metode lainn$a (Cone dkk, +:74D Sn$der dan 9irkland, +:7:D Hamilton dan Se/ell, +:-'D Eohnson dan Stevenson, +:7-). 9elebihan itu antara lain%

• _{Fampu memisahkan molekulmolekul dari suatu #ampuran} • _{Fudah melaksanakann$a}

• _{9e#epatan analisis dan kepekaan $ang tinggi}

• _{Capat dihindari ter*adin$a dekomposisi < kerusakan bahan $ang dianalisis} • _{1esolusi $ang baik}

(3)

• _{9olom dapat digunakan kembali}

• _{Fudah melakukan Gsample re#over$G}

Fetode HP! dapat digunakan untuk analisa kuantitati" dan

sekaliguskualitati". ntuk analisa kualitati" dengan membandingkan kromatogram sampel dengan kromatogram

baku pembanding berdasarkan /aktu retensin$a.

Sedangkan untuk analisa kuatitati" dapat digunakan dengan persamaan % $& ' A& ( Ap ) $p

9eterangan %

 3 Peak area 3 uas pun#ak !3 9onsentrasi

 3 sampel

P 3 pembanding

tau *ika ingin mendapatkan data $ang lebih valid dapat pula ditentukan dengan menggunakan kurva kalibrasi larutan standar.

1. _{*ENIS HPL$}

Pemisahan dengan HP! dapat dilakukan dengan "ase normal (*ika "ase diamn$a lebih polar dibanding dengan "ase gerakn$a) atau "ase terbalik (*ika "ase diamn$a kurang non polar dibanding dengan "ase gerakn$a). Berdasarkan pada kedua pemisahan ini, sering kali HP! dikelompokkan men*adi HP! "ase normal dan HP! "ase terbalik.

Selain klasi8kasi di atas, HP! *uga dapat dikelompokkan berdasarkan pada si"at "ase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solutD dengan *enis*enis HP! sebagai berikut%

+. Kromatora+ A,sor-si

Prinsip kromatogra8 adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam

kromatogra8 kolom dan kromatogra8 lapis tipis. Pemisahan kromatogra8 adsorbsi biasan$a menggunakan "ase normal dengan menggunakan "ase diam silika gel dan alumina, meskipun demikian sekitar :0 kromatogra8 ini memakai silika sebagai "ase diamn$a. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi $ang akan berinteraksi dengan solut. 6ugus silanol pada silika mempun$ai reakti8tas $ang berbeda, karenan$a solut dapat terikat se#ara kuat sehingga dapat men$ebabkan pun#ak $ang berekor&).

. Kromatora+ fase terikat

9eban$akan "ase diam kromatogra8 ini adalah silika $ang dimodi8kasi se#ara kimia/i atau "ase terikat. Se*auh ini $ang digunakan untuk memodi8kasi silika adalah hidrokarbonhidrokarbon nonpolar seperti dengan oktadesilsilana, oktasilana, atau dengan "enil. >ase diam $ang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ICS atau !+-) dan keban$akan pemisahann$aadalah"aseterbalik.

Sebagai "ase gerak adalah #ampuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bu"er. ntuk solut $ang bersi"at asam lemah atau basa lemah, peranan pH sangat krusial karena kalau pH "ase gerak tidak

(4)

diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. erbentukn$a spesies $ang terionisasi ini men$ebabkan ikatann$a dengan "ase diam men*adi lebih lemah dibanding *ika solut dalam bentuk spesies $ang tidak terionisasi karenan$a spesies $ang mengalami ionisasi akan terelusi lebih #epat

/. Kromatora+ pen!kar ion

9!9 penukar ion menggunakan "ase diam $ang dapat menukar kation atau anion dengan suatu "ase gerak. da ban$ak penukar ion $ang beredar di pasaran, meskipun demikian $ang

palingluaspenggunaann$aadalahpolistirenresin.

9eban$akan pemisahan kromatogra8 ion dilakukan dengan menggunakan media air karena si"at ionisasin$a. Calam beberapa hal digunakan pelarut #ampuran misaln$a airalkohol dan *uga pelarut organik. 9romatogra8 penukar ion dengan "ase gerak air, retensi pun#ak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH "ase gerak. 9enaikan kadar garam dalam "ase gerak menurunkan retensi solut. Hal ini disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion "ase gerak untuk gugus penukar ion pada resin.

0.Kromatora+ Pasanan ion

9romatogra8 pasangan ion *uga dapat digunakan untuk pemisahan

sampelsampel ionik dan mengatasi masalahmasalah $ang melekat pada metode penukaran ion. Sampel ionik ditutup dengan ion $ang mempun$ai muatan $ang berla/anan.

1. Kromatora+ Ekskl!si Uk!ran

9romatogra8 ini disebut *uga dengan kromatogra8 permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis sen$a/a dengan berat molekul J '000 dalton.

>ase diam $ang digunakan dapat berupa silika atau polimer $ang bersi"at porus sehingga solut dapat mele/ati porus (le/at diantara partikel), atau berdi"usi le/at "ase diam. Folekul solut $ang mempun$ai BF $ang *auh lebih besar, akan terelusi terlebih dahulu, kemudian molekulmolekul $ang ukuran medium, dan terakhir adalah molekul $ang *auh lebih ke#il. Hal ini disebabkan solut dengan BF $ang besar tidak mele/ati porus, akan tetapi le/at diantara partikel "ase diam. Cengan demikian, dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak ter*adi interaksi kimia antara solut dan "ase diam seperti tipe kromatogra8 $ang lain.

2. Kromatora+ A+nitas

Calam kasus ini, pemisahan ter*adi karena interaksiinteraksi biokimia/i $ang sangat spesi8k. >ase diam mengandung gugusgugus molekul $ang han$a dapat men$erap sampel *ika ada kondisikondisi $ang terkait

dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel $ang sesuai

(sebagaimana dalam interaksiantara antigen dan antibodi). 9romatogra8 *enis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enKim) dari

#ampuran $ang sangat kompleks).

(5)

nstrumentasi HP! pada dasarn$a terdiri atas% /adah "ase gerak,

pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat in*eksi), kolom, detektor, /adah penampung buangan "ase gerak, dan suatu komputer atau

integrator atau perekam. Ciagram skematik sistem kromatogra8 #air seperti ini %

1. _{Ladah >ase gerak dan >ase gerak}

Ladah "ase gerak harus bersih dan lembam (inert). Ladah pelarut kosong ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai /adah "ase gerak. Ladah ini biasan$a dapat menampung "ase gerak antara + sampai ' liter pelarut(+).

>ase gerak atau eluen biasan$a terdiri atas #ampuran pelarut $ang dapat ber#ampur $ang se#ara keseluruhan berperan dalam da$a elusi dan

resolusi. Ca$a elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas keseluruhan pelarut, polaritas "ase diam, dan si"at komponenkomponen sampel. ntuk "ase normal ("ase diam lebih polar daripada "ase gerak), kemampuan elusi meningkat dengan meningkatn$a polaritas pelarut. Sementara untuk "ase terbalik ("ase diam kurang polar daripada "ase gerak), kemampuan elusi menurun dengan meningkatn$apolaritaspelarut.

>ase gerak sebelum digunakan harus disaring terlebih dahulu untuk menghindari partikelpartikel ke#il ini. Selain itu, adan$a gas dalam "ase gerak *uga harus dihilangkan, sebab adan$a gas akan berkumpul dengan komponen lain terutama di pompa dan detektor sehingga akan

menga#aukan analisis.

2lusi dapat dilakukan dengan #ara isokratik (komposisi "ase gerak tetap selama elusi) atau dengan #ara bergradien (komposisi "ase gerak

berubahubah selama elusi) $ang analog dengan pemrograman suhu pada kromatogra8 gas. 2lusi bergradien digunakan untuk meningkatkan

resolusi #ampuran $ang kompleks terutama *ika sampel mempun$ai kisaran polaritas$angluas4).

>ase gerak $ang paling sering digunakan untuk pemisahan dengan "ase terbalik adalah #ampuran larutan bu"er dengan metanol atau #ampuran air dengan asetonitril. ntuk pemisahan dengan "ase normal, "ase gerak $ang paling sering digunakan adalah #ampuran pelarutpelarut

hidrokarbon dengan pelarut $ang terklorisasi atau menggunakan pelarut pelarut *enis alkohol. Pemisahan dengan "ase normal ini kurang umum dibanding dengan "ase terbalik.

'. Pompa

Pompa $ang #o#ok digunakan untuk HP! adalah pompa $ang

mempun$ai s$arat sebagaimana s$arat /adah pelarut $akni% pompa

harus inert terhadap "ase gerak. Bahan $ang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, ba*a tahan karat, eMon, dan batu nilam. Pompa $ang

digunakan sebaikn$a mampu memberikan tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan "ase gerak dengan ke#epatan alir & m<menit. ntuk tu*uan preparati", pompa $ang digunakan harus mampu mengalirkan "ase gerak dengan ke#epatan '0 m<menit

(6)

&. empat pen$untikan sampel

Sampelsampel #air dan larutan disuntikkan se#ara langsung ke dalam "ase gerak $ang mengalir di ba/ah tekanan menu*u kolom menggunakan alat pen$untik $ang terbuat dari tembaga tahan karat dan katup teMon $ang dilengkapi dengan keluk sampel (sample loop) internal atau

eksternal. Posisi pada saat memuat sampel Posisi pada saat men$untik sampel

4. 9olom dan >ase diam

da ' *enis kolom pada HP! $aitu kolom konvensional dan kolom

mikrobor. 9olom merupakan bagian HP! $ang mana terdapat "ase diam untuk berlangsungn$a proses pemisahan solut<analit. 9olom mikrobor mempun$ai & keuntungan $ang utama dibanding dengan kolom

konvensional, $akni%

• 9onsumsi "ase gerak kolom mikrobor han$a -0 atau lebih ke#il

dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor ke#epatan alir "ase gerak lebih lambat (+0 +00 Nl<menit).

• dan$a aliran "ase gerak $ang lebih lambat membuat kolom

mikrobor lebih ideal *ika digabung dengan spektrometer massa.

• Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,

karenan$a *enis kolom ini sangat berman"aat *ika *umlah sampel terbatas misal sampel klinis.

Feskipun demikian, dalam praktekn$a, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang berman"aat untuk analisis rutin.

9eban$akan "ase diam pada HP! berupa silika $ang dimodi8kasi se#ara kimia/i, silika $ang tidak dimodi8kasi, atau polimerpolimer stiren dan divinil benKen. Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adan$a residu gugus silanol (SiIH). Silika dapat dimodi8kasi se#ara

kimia/i dengan menggunakan reagenreagen seperti klorosilan. 1eagen reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantin$a dengan gugusgugus "ungsional $ang lain.

Iktadesil silika (ICS atau !+-) merupakan "ase diam $ang paling ban$ak digunakan karena mampu memisahkan sen$a/asen$a/a dengan

kepolaran $ang rendah, sedang, maupun tinggi. Iktil atau rantai alkil $ang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut $ang polar. Silikasilika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih #o#ok sebagai pengganti silika $ang tidak dimodi8kasi. Silika $ang tidak dimodi8kasi akan memberikan /aktu retensi $ang bervariasi disebabkan karena adan$a kandungan air $ang digunakan.

5.Cetektor HP!

Cetektor pada HP! dikelompokkan men*adi ' golongan $aitu% oluter universal ($ang mampu mendeteksi Kat se#ara umum, tidak bersi"at spesi8k, dan tidak bersi"at selekti") seperti oluter indeks bias dan oluter spektrometri massaD dan golongan oluter $ang spesi8k $ang han$a akan

(7)

mendeteksi analit se#ara spesi8k dan selekti", seperti oluter is, oluter Muoresensi, dan elektrokimia.

dealn$a, suatu oluter harus mempun$ai karakteristik sebagai berikut% (+) mempun$ai respon terhadap olute $ang #epat dan reprodusibelD (')

mempun$ai sensiti8tas $ang tinggi, $akni mampu mendeteksi olute pada kadar $ang sangat ke#ilD (&) stabil dalam pengopersiann$aD (4)

mempun$ai sel volume $ang ke#il sehingga mampu meminimalkan pelebaran pitaD (5) signal $ang dihasilkan berbanding lurus dengan

konsentrasi olute pada kisaran $ang luas (kisaran dinamis linier)D dan (;) tidak peka terhadap perubahan suhu dan ke#epatan alir "ase gerak').

2. _{ELUSI 3RADIEN}

2lusi 6radien dide8nisikan sebagai penambahan kekuatan "asa gerak selama analisis kromatogra8 berlangsung. 2"ek dari 2lusi 6radien adalah mempersingkat /aktu retensi dari sen$a/asen$a/a $ang tertahan kuat pada kolom. Casardasar elusi gradien di*elaskan oleh Sn$der.

2lusi 6radien mena/arkan beberapa keuntungan % a. otal /aktu analisis dapat direduksi

b. 1esolusi persatuan /aktu setiap sen$a/a dalam #ampuran bertambah #. 9eta*aman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

d. 2"ek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak

6radien dapat dihentikan se*enak atau dilan*utkan. Iptimasi 6radien dapat dipilih dengan #ara trial and error.

1. _{DATA HANDLIN3}

Hasil dari pemisahan kromatogra8 biasan$a ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada rekorder. /aktu retensi dan volume retensi dapat diketahui <dihitung. ni bisa digunakan untuk mengidenti8kasi se#ara

kualitati" suatu komponen, bila kondisi ker*a dapat dikontrol. ebar pun#ak dan tinggi pun#ak sebanding atau proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil se#ara kuantitati".

2. _{4ASA 3ERAK}

Ci dalam kromatogra8 #air komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah satu dari variabel $ang mempengaruhi pemisahan. erdapat variasi $ang sangat luas pada solven $ang digunakan untuk 9!9, tetapi ada beberapa si"at umum $ang sangat disukai, $aitu rasa gerak harus % +. Furni, tidak terdapat kontaminan

'. dak bereaksi dengan /adah (pa#king) &. Sesuai dengan de"ektor

4. Felarutkan sampel

5. Femiliki visikositas rendah

;. Bila diperlukan, memudahkan Gsample re#over$G

(8)

mumn$a, semua solven $ang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiann$a kembali sangat membosankan dan mahal

bia$an$a. Cari semua pers$aratan di atas, pers$aratan +) s<d 4) merupakan $ang sangat penting.

Fenghilangkan gas (gelembung udara) dari solven, terutama untuk 9!9 $ang menggunakan pompa bolak balik (re#ipro#ating pump) sangat

diperlukan terutama bila detektor tidak tahan kiner*a sampai +00 psi. dara $ang terlarut $ang tidak dikeluarkan akan men$ebabkan gangguan $ang besar di dalam detektor sehingga data $ang diperoleh tidak dapat digunakan (the data ma$ be useless). Fenghilangkan gas (degassing) *uga sangat baik bila menggunakan kolom $ang sangat sensiti"terhadap

udara (#ontoh % kolom berikatan dengan OH'). (1u#ker, 6 +:--)

Perangkat Alat HPLC Di Laboratorium Instrumen SMAK (Sekolah Menengah Analis Kimia) Makassar

BAB III

"ET5DE ANALISA

Alat ,an Ba#an  %

+. 6elas Piala 50 ml

(9)

&. !orong 4. Pengaduk 5. Fikroburet ;. 9ertas Saring 7. Oera#a Cigital -. HP! :. Pompa vakum BHO % +. 9a"ein '. quabidestilata steril $ARA KER*A A. _{Preparasi Sampel}

 Citimbang 0,0'+' gram ka"ein

Ta-el penamatan 6

Bobot sampel (ka"ein) 3 0,0'+' gram Perhitungan %

• Bobot ka"ein $ang ditimbang untuk larutan induk '00 ppm

ppm 3 '00ppm 3

3 '0 mg 3 0,0' g

• 9onsentrasi larutan stok sebenarn$a

ppm 3 3 3 '+' ppm • Pengen#eran untuk 5 ppm +!+ 3 '!' +. '+' ppm 3 50 ml . 5ppm +

• 9onsentrasi larutan standar ka"ein sebenarn$a

+!+ 3 '!'

+,'0 ml. '+' ppm 3 50 ml . !' 5,0-- ppm 3 !'

(10)

BAB 7

KESI"PULAN DAN SARAN

Kesimp!lan

Cari hasil analisa ka"ein 5 ppm dengan alat HP! dapat disimpulkan bah/a %

1etention time % +,000 menit rea % 4500&

rea % '4,&&  Height %