6
III. METODE PENELITIAN
A. Materi, Lokasi dan Waktu Penelitian 1. Materi
1.1 Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalahmortardanpestle, kompor gas, autoklaf, gelas ukur, labu Erlenmeyer, tabung reaksi, oven, Laminar Air Flow (LAF), cawan petri, gelas ukur, rak tabung, beaker glass, Hot Plate Stirer, bor gabus, sprayer, jarum ose, shaker orbital, kertas saring Whatman No. 41, corong Buchner; pompa vakum, Chamber, timbangan analitik dan UVcabinet.
1.2 Bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian adalah isolat L. edodes Yogyakarta, isolat W4, LW26 dan Jambo, Potato Dextrose Agar(PDA), ekstrak yeast, agar, kloroform, etil asetat, pelat KLT silica gel, akuades, ekstrak malt, ekstrak yeast, glukosa, alkohol 70%, akuabides, CaSO4,
bekatul, alkohol, alummunium foil, tissue, pereaksi AlCl3, vanillin asam
sulfat dan Dragendorff. 2. Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Mikologi-Fitopatologi, Fakultas Biologi dan Laboratorium Kimia Organik, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (MIPA), Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto. Penelitian dilaksanakan selama 5 bulan, dimulai pada bulan Juni-Oktober 2014.
B. Metode Penelitian
1. Metode dan Rancangan Percobaan
Metode penelitian pertama yang digunakan yaitu eksperimental dengan menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL), dengan 4 perlakuan yang terdiri atas :
t1 : Isolat Yogya t2 : Isolat LW26 t3 : Isolat W4 t4 : Isolat Jambo
7
Masing-masing perlakuan ditumbuhkan pada medium Yeast Extract, Malt Extract, Rice Bran (YEMR) dan diulang sebanyak 3 kali, sehingga terdiri atas 12 unit percobaan.
2. Variabel penelitian
Variabel yang digunakan dalam penelitian ini ada dua macam yaitu variabel bebas dan variabel tergantung. Variabel bebas adalah empat isolatL. edodes, sedangkan variabel tergantung yaitu bobot miselium kering dan
golongan senyawa metabolit sekunder. 3. Parameter penelitian
Parameter utama yang diukur berupa bobot biomassa miselium kering dan golongan senyawa terpenoid, flavonoid dan alkaloid. Parameter pendukung berupa pH awal dan akhir medium fermentasi cair.
4. Cara kerja
4.1 Sterilisasi alat (Adji et al., 2007)
Alat yang digunakan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 1210C selama 20 menit.
4.2 Pembuatan mediumPotato Dextrose Agar(PDA) (Hagemur, 2009) Kentang sebanyak 200 g dikupas dan dipotong kecil-kecil kemudian direbus dalam beaker glass berisi akuades sebanyak 500 ml hingga lunak dan ekstraknya diambil. Agar batang dipotong kecil-kecil, kemudian dilarutkan dalam akuades dengan cara dipanaskan dan diaduk. Ekstrak kentang dan agar dicampur menjadi satu kemudian ditambahkan dekstrose 20 g lalu diaduk hingga larut. Medium dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer untuk di sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 1210C, tekanan 2 atm selama 15 menit.
4.3 Peremajaan biakan murniL. edodes(Aminuddin, 2013)
Biakan murni dari keempat isolat L. edodes diinokulasikan pada medium PDA di dalam cawan petri dan diinkubasi pada suhu ruang selama 2 minggu sampai miselium memenuhi cawan.
4.4 Pembuatan medium fermentasi cair YEMR (Quimio, 1978)
Bahan-bahan berupa ekstrak malt 10 g, ekstrak yeast 2 g, dekstrosa 10 g, CaSO4 1 g dan bekatul 5 g dilarutkan dengan akuades sebanyak
1000 ml dan dihomogenkan dengan hot plate dan stirrer. Medium dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, kemudian medium disterilisasi
8
menggunakan autoklaf pada suhu 1210C dengan tekanan 2 atm selama 20
menit.
4.5 Kultivasi miseliumL. edodes(Thongklang et al., 2010)
Kultivasi miselium menggunakan medium YEMR yang sudah dibuat sebelumnya, diinokulasikan dengan keempat isolat koloni L. edodessebanyak 5 plug dengan diameter 5 mm ke dalam masing-masing labu Erlenmeyer berukuran 250 ml dengan volume 100ml. Medium yang sudah diinokulasi, kemudian diinkubasi pada shaker orbital dengan kecepatan pengocokan 150 rpm selama 40 hari pada suhu ruang.
4.6 Pembuatan ekstrak miseliumL. edodes(Ekowati et al., 2011)
Kultur miselium empat isolat L. edodes yang sudah berumur 40 hari disaring menggunakan kertas saring Whatman No. 41, kemudian dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 500C, kemudian miselium yang sudah kering dihaluskan, dan ditimbang bobotnya menggunakan timbangan analitik. Miselium yang sudah ditimbang diekstraksi dengan metode maserasi menggunakan 25 ml kloroform dan 25 ml etil asetat selama 24 jam. Maserasi dilakukan sebanyak dua kali beruturut-turut. Hasil ekstrak kloroform dan etil asetat pertama dan ke dua dipindahkan ke dalam masing-masing labu Erlenmeyer kemudian diuapkan dengan hot plate.
4.7 Pembuatan ekstrak filtrat kulturL. edodes(Ekowati et al., 2011) Filtrat kultur miselium empat isolat L. edodes diekstraksi empat kali dengan masing-masing dua kali berurut-turut dengan kloroform dan etil asetat. Pada tahap ekstrak yang pertama, filtrat kultur sebanyak 50 ml dimasukkan kedalam corong pemisah dan ditambah 25 ml kloroform kemudian digojog dengan kedua tangan selama 10 menit kemudian corong pemisah dipasang dengan statif dan didiamkan selama 5 menit sampai terjadi pemisahan antara kloroform dengan filtrat, kemudian hasil ekstraksi dipisahkan dan ditampung dengan labu Erlenmeyer, demikian juga pada etil asetat. Kloroform akan berada pada lapisan bawah sedangkan etil asetat akan berada pada lapisan atas, kemudian etil asetat dan kloroform diuapkan denganhot plate.
9
4.8 Identifikasi golongan senyawa metabolit sekunder empat isolat L. edodes(Wagner et al., 1984)
Identifikasi golongan senyawa metabolit sekunder dari biomassa miselium dan filtrat medium terlampir pada Lampiran 3.
4.9 Pembuatan pereaksi golongan senyawa metabolit sekunder empat isolatL. edodes (Harborne, 1987)
Pembuatan pereaksi golongan senyawa metabolit sekunder untuk penyemprotan golongan senyawa pada lempeng KLT terlampir pada Lampiran 4.
4.10 Metode analisis
Data bobot biomassa miselium kering yang diperoleh dianalisis menggunakan analisis ragam (ANOVA) pada taraf kepercayaan 95% dan 99%.
