KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LB.

(1)

Rabbani, Nur Rahim 2014

KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LB

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LB

SKRIPSI

diajukan untuk memenuhi sebagian dari syarat memperoleh gelar Sarjana Sains Jurusan Pendidikan Biologi

Program Studi Biologi

disusun oleh:

Nur Rahim Rabbani NIM. 1006883

PROGRAM STUDI BIOLOGI JURUSAN PENDIDIKAN BIOLOGI

(2)

Rabbani, Nur Rahim 2014

KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LB

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

UNIVERSITAS PENDIDIKAN INDONESIA 2014

Kinetika Pertumbuhan dan Isolasi Genomik Konsorsium Bakteri Hydrothermal Vent Kawio Menggunakan Medium Modifikasi LB

Oleh

Nur Rahim Rabbani

1006883

Sebuah skripsi yang diajukan untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Sains pada Fakultas Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

@Nur Rahim Rabbani 2014

Universitas Pendidikan Indonesia

(3)

Rabbani, Nur Rahim 2014

KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LB

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

Hak Cipta dilindungi undang-undang

(4)

Rabbani, Nur Rahim 2014

KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LB

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

LEMBAR PENGESAHAN

KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LB

Oleh:

Nur Rahim Rabbani NIM. 1006883

DISETUJUI DAN DISAHKAN OLEH:

Pembimbing I

Dr. Topik Hidayat, M. Si. NIP. 197004101997021001

Pembimbing II

Dr. Hj. Widi Purwianingsih, M. Si. NIP. 196209621991012001

Pembimbing III

Elvi Restiawaty, ST. Ph.D. NIP. 1975072720010122001

Mengetahui,

Ketua Jurusan Pendidikan Biologi

(5)

KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LB

Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

(6)

KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LB Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

ABSTRAK

Indonesia merupakan negara yang memiliki banyak daerah dengan aktivitas geotermal salah satunya laut dalam kawasan hydrothermal vent kepulauan Kawio Sulawesi Utara. Daerah ini merupakan salah satu tempat keragaman bakteri termofilik yang berpotensi dengan enzim termostabilnya. Penelitian mengenai kinetika pertumbuhan dan isolasi genom dari konsorsium bakteri asal perairan laut dalam kawasan hydrothermal vent Kawio Sulawesi Utara telah dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui kinetika pertumbuhan dan hasil isolasi genom dari konsorsium bakteri termofilik menggunakan medium modifikasi Luria Bertani.Pengamatan pertumbuhan bakteri dilakukan selama 24 jam dengan pengecekan setiap 2 jam sekali. Setelah diketahui waktu pertumbuhan bakteri yang optimum, dilakukan isolasi genom. Metode isolasi genom yang dilakukan yaitu metode isolasi kloroform isoamil alkohol dengan beberapa modifikasi. Hasil menunjukkan bahwa bakteri ini memiliki nilai OD maksimum sebesar 0,576 dengan berat kering sel 6 g/l. Fase logaritmik pertumbuhan bakteri ini terjadi pada waktu pertumbuhan jam ke 2 sampai dengan jam ke 12. Nilai laju pertumbuhan spesifik (µ) bakteri ini adalah 0,2 jam-1. Hasil kuantitatif dari isolasi genom mencapai rasio 1,294 dengan konsentrasi 52,5 ng/µl.

(7)

Rabbani, Nur Rahim 2014

ABSTRACT

Indonesia is a country that has many areas with geothermal activity, one of thedeep-sea hydrothermal vent area is Kawio North Sulawesi islands. This area is one of the potential diversity of thermophilic bacteria with thermostable enzymes. Study of kinetics of growth and genomic isolationof consortium marine bacterial from hydrothermal vent area, Kawio North Sulawesi has been done. The purpose of this study was to determine the kinetics of growth and result of genomic isolation from thermophilic bacteria using a modified Luria Bertani medium. The observation of bacteria growth has been done for 24 hours and has been checked in every 2 hours. After the optimum time of bacteria growth was found, then the isolation of the genome was done. Genome isolation method was performed by the isolation method of chloroform isoamyl alcohol with some modifications. The results showed that the bacterium had a maximum OD value with 0.576 and dry weight of cells 6 g/l. Logarithmic phase of bacterial growth occured in the growth time of 2nd hours until 12nd. The specific value of growth rate (μ) of this bacterium is 0.2 hours-1. Quantitative results from isolation of genomic reachedthe ratio 1.294and the concentration52,5 ng / ml .

(8)

Rabbani, Nur Rahim 2014

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ... i

DAFTAR TABEL ... ii

DAFTAR GAMBAR ... iii

BAB I PENDAHULUAN ... 1

A. LatarBelakang ... 1

B. RumusanMasalah ... 5

C. Batasan Masalah... 6

D. Tujuan Penelitian ... 6

E. ManfaatPenelitian ... 6

BAB II KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK BAKTERI TERMOFILIK HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LURIA BERTANI .... 7

A. Kinetika Pertumbuhan Bakteri ... 7

B. Bakteri Termofilik ... 11

1. Suhu Pertumbuhan Bakteri Termofilik ... 12

2. Habitat Bakteri Termofilik ... 14

3. Struktur Bakteri Termofilik ... 15

4. Pemanfaatan Bakteri Termofilik ... 18

C. Konsorsium Bakteri ... 20

D. Hydrothermal Vent Kawio ... 21

E. Medium Luria Bertani – Magnesium Sulfat ... 24

1. Luria Bertani ... 24

2. Magnesium Sulfat ... 25

F. Genom ... 27

G. Isolasi DNA Genom ... 29

H. Elektroforesis ... 34

(9)

Rabbani, Nur Rahim 2014

A. JenisPenelitian ... 38

B. Subjek dan Sampel Penelitian ... 38

C. Waktu dan LokasiPenelitian ... 38

D. AlatdanBahan ... 38

E. Prosedur Penelitian... 39

1. Tahap Persiapan ... 39

2. Tahap Penelitian ... 39

a. Enrichment ... 39

b. Pengukuran Optical Density (OD) ... 40

c. Analisa Kadar Biomassa ... 40

d. Isolasi Genom Bakteri ... 41

e. Uji Kemurnian ... 41

f. Elektroforesis Gel Agarosa ... 42

g. Analisis Data ... 44

F. Alur Penelitian ... 45

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ... 46

A. Kinetika Laju Pertumbuhan ... 46

B. Isolasi DNA Genom dan Spektrofotometer ... 52

C. Elektroforesis Hasil Isolasi Genom ... 55

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ... 57

A. Kesimpulan ... 57

B. Saran ... 57

DAFTAR PUSTAKA ... 58

(10)

Rabbani, Nur Rahim 2014

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

2.1 Hidro-oseanografi Perairan Hydrothermal Vent Kawio ... 23

2.2 Makroelemen dan Fungsi Fisiologisnya ... 26

4.1 Perbandingan Nilai OD dengan Berat Basah dan Berat Kering Sel dari

Konsorsium Bakteri Hydrothermal Vent Kawio ... 50

4.2 Hasil Spektrofotometer DNA Genom Konsorsium Bakteri

(11)

KINETIKA PERTUMBUHAN DAN ISOLASI GENOMIK KONSORSIUM BAKTERI HYDROTHERMAL VENT KAWIO MENGGUNAKAN MEDIUM MODIFIKASI LB Universitas Pendidikan Indonesia | repository.upi.edu | perpustakaan.upi.edu

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1 Fase Pertumbuhan Bakteri ... 9

2.2 Struktur Sel Bakteri ... 12

2.3 Hubungan Suhu dan Pertumbuhan pada Kelompok Mikroorganisme dengan Temperatur yang Berbeda ... 13

2.4 White Smokersmuncul dari Celah Kerak Bumi di Dasar Laut ... 21

2.5 Black Smokersmuncul dari Celah Kerak Bumi di Dasar Laut ... 21

2.6 Lokasi Ekspedisi Index Satal Hydrothermal Vent Kawio Sulawesi Utara 23 2.7 Struktur Genom ... 28

2.8 Fasa Atas, Interfasa dan Fasa Bawah ... 31

2.9 Proses Elektroforesis Gel Agarose ... 34

3.1 Sampel Air Laut Dalam Kawasan Hydrothermal Vent Kawio Sulawesi Utara ... 39

3.2 Alur Cara Kerja Enrichment ... 40

3.3 Alur Cara Kerja Analisis Kadar Biomassa... 41

3.4 Alur Cara Kerja Isolasi Genom ... 42

3.5 Alat untuk Elektroforesis ... 43

3.6 UV Transilluminator ... 44

3.7 Diagram Alur Penelitian ... 45

4.1 Kurva Pertumbuhan Konsorsium Bakteri Hydrothermal Vent Kawio ... 46

4.2 Kurva Berat Kering Sel dan Berat Basah Sel dari Konsorsium Bakteri Hydrothermal Vent Kawio ... 52

(12)

Rabbani, Nur Rahim 2014

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Selama beberapa dekade ini, manusia beranggapan laut dalam itu merupakan

lingkungan yang tidak layak huni untuk berbagai jenis organisme. Hal ini

disebabkan antara lain tidak terdapatnya cahaya matahari yang masuk dan

kandungan oksigen yang sangat rendah (Rositasari, 1992). Namun, dalam

beberapa tahun terakhir ini pendapat-pendapat tersebut mulai berubah setelah

beberapa peneliti geologi pada tahun 1977 secara tidak sengaja menemukan

keajaiban alam di kawasan hydrothermal vent, berupa oasis makhluk hidup pada

kedalaman 2600 meter di bawah permukaan laut (Felbeck, 1981). Penemuan laut

dalam hydrothermal vent di sepanjang Pasifik Timur itu telah secara signifikan

mengubah pandangan terhadap laut dalam yang sudah lama dikenal dengan

dingin, gelap, bertekanan tinggi dan lingkungan yang miskin hara (Corliss et al.,

1979).

Indonesia merupakan salah satu negara yang memiliki laut dalam

kawasanhydrothermal vent yang berlokasi di kepulauan Kawio provinsi Sulawesi

Utara. Pulau Kawio telah dijadikan sebagai tempat ekspedisi karena terbilang unik

secara tektonik dimana tidak banyak daerah di dunia yang mempunyai

karakteristik seperti ini. Wilayah ini merupakan pertemuan dua jalur gunung api

besar di dunia dan pertemuan jalur gempa wilayah timur dan pasifik. Selain itu

juga wilayah ini merupakan wilayah laut dalam yang belum banyak dieksplorasi

potensinya (BPPT, 2010). Eksplorasi ini berhasil mengungkap adanya kehidupan

yang unik di kedalaman lebih dari 4.000 meter di bawah laut. Pada kedalaman

1.900 meter di bawah laut Sangihe telah diketahui keberadaan sebuah gunung api

aktif setinggi 3.200 meter. Gunung api tersebut membentuk sebuah kawasan

komunitas baru di areal geotermal. Banyak mikroorganisme termofilik dan

hipertermofilik yang hidup di laut dalam hydrothermal vent termasuk bakteri dan

(13)

2

Bakteri termofilik selain banyak ditemukan di air panas daerah pegunungan,

juga terdapat di lautan, tepatnya laut dalam kawasan hydrothermal vent. Beberapa

kondisi lingkungan yang berbeda dalam setiap lokasi memungkinkan adanya

heterogenitas bakteri termofilik yang tinggi. Hingga saat ini, lebih dari 70 genus

dan 140 spesies termofil telah diisolasi dari berbagai lingkungan termis (George,

2001; Adiguzel et al., 2010). Eksplorasi terhadap bakteri-bakteri termofilik yang

berasal dari kawasan ini masih sangat terbatas sehingga perlu adanya penelitian

lebih lanjut agar potensi bakteri di kawasan hydrothermal vent ini dapat

dimanfaatkan dengan baik.

Penelitian mengenai bakteri termofilik saat ini cukup menarik untuk

dilakukan. Sifat termofilik yang terdapat dalam bakteri ini merupakan fenomena

yang unik karena kemampuannya untuk hidup pada temperatur yang relatif tinggi,

juga kemampuan beradaptasinya dalam lingkungan ekstrim (Kato et al., 1995).

Pemanfaatan bakteri termofilik misalnya yaitu sebagai sumber enzim tahan panas.

Mikroorganisme termofilik mampu mensintesis molekul stabil pada kondisi

panas, termasuk molekul enzim. Faktor utama yang paling merusak enzim adalah

suhu. Enzim dari mikroorganisme ini mendukung untuk bekerja di bawah kondisi

normal dimana enzim dari mikroorganisme mesofilik akan mengalami denaturasi.

Enzim tahan panas atau enzim termostabil banyak dieksplorasi dalam dasawarsa

terakhir karena perannya yang sangat luas dan penting bagi pengembangan ilmu

dasar maupun industri. Enzim termostabil memiliki beberapa keunggulan

dibanding enzim termolabil karena penerapannya umumnya memiliki kestabilan

yang lebih tinggi dan ketahanan yang cukup baik terhadap zat-zat kimia serta

lebih mudah diisolasi. Hal ini berkaitan dengan keuntungan yang akan diperoleh

bila proses produksi dilakukan pada suhu tinggi, diantaranya mengurangi

kontaminasi, meningkatkan kecepatan transfer massa dan menurunkan viskositas

dari larutan. Aplikasi pada bidang bioteknologi dan industri seperti dalam

teknik-teknik biologi molekuler untuk kegunaan penelitian dan diagnostik (enzim yang

memproses DNA dan RNA) dan kemampuan enzim mengubah tepung, makanan,

pengelolaan sampah, sintesis organik, pembuatan kertas dan industri kulit.

(14)

3

model untuk penelitian dan penyelidikan protein-protein yang bersifat termostabil

dan kemampuannya sebagai biokatalis pada bioteknologi modern(Andrade C.,

1999; Kamelia T., 2005; Madigan et al., 2009; Suhartono M.T., 2000).

Untuk memanfaatkan dan mempelajari potensi enzim termostabil bakteri

termofilik, tahap awal yang perlu dilakukan yaitu mengisolasi DNA genom. Asam

deoksiribonukleat (DNA) merupakan persenyawaan kimia yang paling penting

pada makhluk hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau

dari makhluk dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya.

DNA sangat menarik perhatian para Biologiwan modern dalam abad ini. Hal ini

disebabkan karena DNA sangat erat hubungannya dengan hampir semua aktivitas

biologi (Suryo, 2005). Genom adalah keseluruhan informasi genetik yang dimiliki

suatu sel atau organisme, atau khususnya keseluruhan asam nukleat yang memuat

informasi tersebut (Alberts et al., 2002). Konstruksi pustaka genom dan

pengklonan DNA membutuhkan DNA yang utuh agar fragmen DNA betul-betul

berasal dari proses pemotongan enzimatik yang sangat spesifik. Bila terpotongnya

DNA bukan karena reaksi enzimatik, maka fragmen DNA tersebut sulit

disambungkan dengan DNA dari vektor pengklonan. Oleh sebab itu isolasi DNA

genom yang utuh sangat diperlukan bila DNA tersebut akan diproses untuk

pengklonan (Suharsono dan Widyastuti, 2006). Kemurnian dan kualitas DNA

yang diperoleh dari tahap ini akan sangat menentukan dalam penelitian-penelitian

biologi molekuler. Tiga langkah utama dalam isolasi DNA adalah perusakan

dinding sel atau lisis, pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan

protein, serta pemurnian DNA. Ada beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam

proses isolasi DNA antara lain harus menghasilkan DNA tanpa adanya

kontaminan seperti protein dan RNA, metodenya harus efektif dan bisa dilakukan

untuk semua spesies, metode yang dilakukan tidak boleh mengubah struktur dan

fungsi molekul DNA serta metodenya harus sederhana dan cepat (Surzycki,

2000).

Pengujian kuantitatif dan kualitatif isolat DNA dapat dilakukan dengan

pengukuran menggunakan spektrofotometer UV dan elektroforesis gel agarosa.

(15)

4

panjang gelombang sinar UV 260 nm akan menangkap molekul DNA sehingga

terukur nilai arbsorbansinya. Uji kualitatif dengan gel agarosa dapat mengukur

kualitas kemurnian DNA, dimana konsentrasi gel agarosa yang digunakan

berbanding terbalik dengan panjang/pendeknya pita DNA atau bentuk struktur

DNA. Makin pendek urutan basa DNA-nya maka konsentrasi gelnya tinggi.

Struktur DNA sirkuler lebih ringan dibanding DNA linier (Fatchiyah, 2011).

Informasi mengenai kinetika pertumbuhan dapat digunakan untuk

menentukan waktu isolasi DNA genom. Pertumbuhan bakteri mengacu pada

pertambahan total massa sel. Pertambahan massa bakteri berbanding lurus dengan

pertambahan komponen seluler yang lain seperti DNA (Deoxyribosa Nucleotida

Acid), RNA (Ribosa Nucleotida Acid) dan protein (Pelczar & Chan, 2005). Untuk

mendapatkan waktu panen bakteri yang optimal, maka perlu diketahui kinetika

pertumbuhan suatu bakteri.Pertumbuhan bakteri dapat diukur dengan melihat

kenaikan biomassa atau jumlah sel. Pertumbuhan bakteri biasanya mengikuti

suatu pola pertumbuhan tertentu berupa kurva pertumbuhan sigmoid. Studi

mengenai kinetika pertumbuhan kultur bakteri dapat digunakan untuk menduga

efisiensi biaya produksi dalam sekala besar. Selain itu setiap bakteri akan

menunjukkan perbedaan pola pertumbuhan, periode waktu yang dibutuhkan untuk

tumbuh maupun beradaptasi, dan metabolit yang dihasilkan. Kinetika

pertumbuhan dapat memberikan informasi tentang kecepatan produksi biomasa

sel dan pengaruh lingkungan terhadap kecepatan pertumbuhan (Pramono et al.,

2003).

Untuk menumbuhkan dan mempelajari sifat-sifat suatu bakteri diperlukan

suatu substansi yang sudah diatur komposisi nutrisinya, yaitu berupa medium.

Laju pertumbuhan bakteri dipengaruhi oleh kondisi lingkungan medium

pertumbuhan tersebut. Medium yang sesuai akan mengoptimalkan pertumbuhan

bakteri.Semua bentuk kehidupan, mulai dari jasad renik (mikroorganisme) sampai

manusia mempunyai persamaan dalam persyaratan nutrisi tertentu dalam bentuk

zat-zat kimia yang diperlukan untuk pertumbuhan dan fungsinya yang normal

(Lestari, 1998). Namun perlu diketahui jenis-jenis nutrisi yang disyaratkan oleh

(16)

5

pertumbuhannya. Berbagai macam jenis media tersedia dan dikenal untuk isolasi,

identifikasi dan pemeliharaan bakteri (Cowan, 1975; Collin & Lyne, 1987),

namun tidak semua media dapat mendorong pertumbuhan bakteri. Bakteri sangat

beragam, baik dalam persyaratan nutrisinya maupun fisiknya, beberapa ada yang

mempunyai persyaratan nurtisi yang sederhana adapula yang mempunyai

persyaratan yang agak rumit.

Luria Bertani (LB) adalah medium cair yang paling umum digunakan untuk

menumbuhkan berbagai jenis bakteri (Peanut, 2013). LB digunakan sebagai

media pertumbuhan karena sangat efisien dalam merangsang pertumbuhan dan

cocok untuk berbagai mikroorganisme. Resep pembuatan LB sering diubah atau

dimodifikasi tergantung pada bakteri dan kondisinya. Menurut Restiawaty (2013),

penambahan MgSO4 pada media pertumbuhan dapat meningkatkan pertumbuhan

bakteri asal perairan hydrothermal vent Kawio. Oleh karena itu dalam peneitian

ini digunakan LB dengan penambahan MgSO4 sebagai medium pertumbuhan.

Berdasarkan uraian tersebut maka penelitian ini dimaksudkan untuk

mengetahui kinetika pertumbuhan dan hasil isolasi genom bakteri konsorsium dari

air laut dalam kawasan hydrothermal vent Kawio pada medium modifikasi LB.

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan di atas, dapat dirumuskan masalah dari penelitian ini, yaitu: “Bagaimana kinetika pertumbuhan dan hasil isolasi genomik konsorsium bakteri asal perairan hydrothermal vent Kawio pada medium modifikasi LB?”

Dari rumusan masalah tersebut dapat dituliskan pertanyaan penelitian,yaitu:

1. Bagaimana kurva pertumbuhan konsorsium bakteri hydrothermal vent Kawio

yang ditumbuhkan pada medium modifikasi LB?

2. Berapakah nilai laju pertumbuhan spesifik dari konsorsium bakteri

hydrothermal vent Kawio yang ditumbuhkan pada medium modifikasi LB?

3. Bagaimana hasil isolasi DNA genom secara kuantitatif dan kualitatif dari

konsorsium bakteri hydrothermal vent Kawio yang ditumbuhkan pada

(17)

6

C. Batasan Masalah

Agar permasalahan dalam penelitian ini terfokus pada hal yang diharapkan,

ruang lingkup dibatasi pada:

1. Sampel bakteri yang diujikan dalam penelitian ini diambil dari laut dalam

kawasan hydrothermal vent kepulauan Kawio provinsi Sulawesi Utara yang

telah tersedia di PAU ITB.

2. Konsentrasi MgSO4 yang ditambahkan dalam medium Luria Bertani yaitu

sebanyak 0,5%.

3. Konsorsium bakteri yang diisolasi merupakan konsorsium bakteri termofilik

yang bersifat aerob.

D. Tujuan Penelitian

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui kinetika laju pertumbuhan

dan mengisolasi DNA genom konsorsium bakteri dari perairan hydrothermal vent

Kawio menggunakan medium modifikasi LB, yang dapat dirinci sebagai berikut:

1. Mengetahui kurva pertumbuhan konsorsium bakteri hydrothermal vent

Kawio yang ditumbuhkan pada medium modifikasi LB.

2. Mengetahui laju pertumbuhan spesifik dari konsorsium bakteri hydrothermal

vent Kawioyang ditumbuhkan pada medium modifikasi LB.

3. Mengetahui hasil isolasi genom konsorsium bakteri termofilik hydrothermal

vent Kawio secara kuantitatif dan kualitatif yang ditumbuhkan pada medium

modifikasi LB.

E. Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini adalah memberikan informasi mengenai pengaruh

lingkungan dan kecepatan pertumbuhan konsorsium bakteri laut dalam

hydrothermal vent Kawio pada medium modifikasi LB. Hasil isolasi genom yang

didapatkan dapat digunakan sebagai acuan untuk penelitian lebih lanjut seperti

(18)

Rabbani, Nur Rahim 2014

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian murni yang dilakukan dengan metode

deskriptif, yaitu suatu metode penelitian untuk membuat deskripsi, gambaran atau

lukisan secara sistematis, faktual, dan akurat mengenai fakta-fakta, sifat-sifat,

serta hubungan antar fenomena yang diselidiki (Nazir, 1988).

B. Subjek dan Sampel Populasi

Populasi pada penelitian ini adalah konsorsium bakteri yang berasal dari

perairan laut dalam kawasan hydrothermal vent Kawio provinsiSulawesi Utara.

Sampel air laut yang digunakan diambil dari perairan hydrothermal vent

kedalaman 1500 – 3000 m dengan tekanan 317 atm. Temperatur kawasan ini

berkisar 25 – 80oC dan keadaan pH 2,8 – 6,5 dengan salinitas sekitar 35 – 40 ppt.

Jenis sampelnya merupakan campuran dari air laut dengan sedikit sediemen.

C. Waktu dan Lokasi Penelitian

Waktu penelitian ini dimulai dari bulan Maret 2014 sampai bulan September

2014. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Rekayasa Genetika,Pusat

Penelitian Pangan, Kesehatan, Obat-obatan dan Kesehatan, gedung Pusat Antar

Universitas Institut Teknologi Bandung dan Laboratorium Mikrobiologi Fakultas

Pendidikan Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan

Indonesia.

D. Alat dan Bahan

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdapat di Laboratorium

Rekayasa Genetika, gedung Pusat Antar Universitas Institut Teknologi Bandung

(19)

39

Pengetahuan Alam Universitas Pendidikan Indonesia. Daftar alat dan bahan dapat

dilihat pada Lampiran 1.

E. Prosedur Penelitian 1. Tahap Persiapan

Persiapan penelitian meliputi sterilisasi alat dan bahan, pembuatan larutan

stok untuk medium, isolasi genom dan elektroforesis. Medium tumbuh yang

digunakan adalah medium Luria Bertani yang dimodifikasi. Alat-alat yang

digunakan dicuci terlebih dahulu dan dikeringkan kemudian dibungkus. Setelah

itu disterilisasi panas lembab dengan cara diautoklaf selama 15-20 menit pada

suhu 121oC.

2. Tahap Penelitian a. Enrichment

Sampel air laut dalam (Gambar 3.1.) telah diambil dari kawasan

hydrothermal vent Kawio. Sampel yang dikumpulkan berupa air laut dan

jumlahnya terbatas. Maka untuk memperkaya sampel dan menghindari terjadinya

degradasi jumlah bakteri, dilakukan metode pengayaan (enrichment).

Gambar3.1. Sampel Air Laut Dalam Kawasan Hydrothermal Vent Kawio Sulawesi Utara

(Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2014)

Pengayaan dilakukan dengan menggunakan medium Luria Bertani (LB) +

0,5% MgSO4. Sebanyak 10% sampel air laut dalam Kawio ditambahkan ke dalam

(20)

40

flow untuk mencegah adanya kontaminasi. Kemudian diinkubasi dalam inkubator

shaker dengan kecepatan 175 rpm dan suhu 60oC.Setelah inkubasi overnight atau

hingga sampel terlihat keruh, sebanyak 10% sampel hasil inkubasi diinokulasikan

kembali ke dalam 50 ml medium LB + 0,5% MgSO4dengan inkubasi pada

keadaan yang sama. Baru setelah itu sampel hasil inkubasi diperbanyak dengan

menginokulasikan 10% sampel ke dalam 250 ml medium LB + 0,5% MgSO4

yang kemudian digunakan untuk pengamatan dengan inkubasi pada keadaan yang

sama.Alur pengerjaan proses enrichment dapat dilihat padaGambar 3.2.

Gambar3.2. Alur Cara Kerja Enrichment

b. Pengukuran Optical Density (OD)

Pengukuran OD dilakukan dengan metode langsung berdasarkan turbiditas.

Alat yang digunakan yaitu spektrofotometer. Pengecekan OD dilakukan setiap 1 -

2 jam sekali dengan cara 1 ml sampel dimasukkan ke dalam kuvet. Panjang

gelombang yang digunakan yaitu 600 nm.

c. Analisa Kadar Biomassa

Biomassa diukur berdasarkan berat kering sel. Sebanyak 1 ml sampel

dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang sebelumnya telah ditimbang

beratnya, kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14.000 rpm selama 15 menit.

Supernatan yang terbentuk dibuang dan pelet yang tersisa ditimbang untuk

(21)

41

atau beratnya konstan. Alur pengerjaan analisis kadar biomassa dapat dilihat

padaGambar 3.3.

Gambar 3.3. Alur Cara Kerja Analisis Kadar Biomassa

Berat kering sel dan berat basah sel(x) dihitung dengan rumus sebagai

berikut:

X (g/l) = Berat tabung berisi sel kering/basah (g) – berat tabung kosong (g) x 103

Volume sampel (ml)

d. Isolasi Genom Bakteri

Isolasi genom bakteri ini mengacu pada metode kloroform isoamil alkohol

(Sambrook et al., 1989) dengan beberapa modifikasi pada beberapa langkah

proses isolasi. Sampel yang digunakan merupakan hasil inkubasi yang telah

diketahui waktu pertumbuhan optimumnya.

Pertama-tama dilakukan dengan sentrifugasi sampel untuk memisahkan sel

dengan medium. Sebanyak 3 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung eppendorf

(masing-masing dua kali) kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 14.000xg

selama 1 menit. Supernatan yang terbentuk dibuang sehingga hanya pelet yang

tersisa. Pelet hasil sentrifugasi ditambahkan 750 µl buffer lisis dan 750 µl

kloroform : isoamil alkohol (24:1), kemudian diresuspensi menggunakan tips

hingga tercampur rata. Hal ini dimaksudkan untuk melisiskan membran sel

bakteri agar isi selnya keluar. Setelah homogen kemudian disimpan dalam freezer

-20oC selama 40 menit. Setelah itu disentrifugasi 14.000xg selama 3 menit.

Setelah disentrifugasi, pada tabung terbentuk tiga lapisan, yaitu fasa atas,

tengah dan bawah. Fasa atas diambil dengan menggunakan tips dan dipindahkan

ke tabung baru dan ditambahkan 750 µl kloroform : isoamil alkohol. Tabung

(22)

42

14.000xg selama 3 menit. Fasa atas diambil dan dimasukkan ke tabung baru.

Ditambahkan LiCl sebanyak 1/10 volume dan alkohol absolut sebanyak 1x

volume lalu tabung dibolak-balik hingga homogen, kemudian disimpan di dalam

freezer -20oC selama 30 menit dan setelah itu disentrifugasi.

Setelah disentrifugasi dengan kecepatan 14.000xg selama 3 menit, supernatan

yang terbentuk dibuang hingga yang tersisa peletnya, kemudian ditambahkan 200

µl alkohol 70%. Flick menggunakan jari hingga homogen dan disentrifugasi

dengan kecepatan 14.000xg selama 3 menit. Selanjutnya supernatan yang

terbentuk dibuang dan peletnya dikeringkan pada suhu ruang untuk menguapkan

sisa-sisa etanol. Setelah itu dilarutkan dengan menambahkan 50 µl TE buffer pH

8,0 dan flick hingga homogen. Disimpan pada suhu -20oC. Alur pengerjaan proses

isolasi genom dapat dilihat pada Gambar 3.4.

Gambar 3.4. Alur Cara Kerja Isolasi Genom

e. Uji Kemurnian

Uji kemurnian dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer. Kemurnian

DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan

nilai absorbansi 280 nm (Å 260 / Å 280), sedangkan untuk mengukur konsentrasi

DNA digunakan rumus sebagai berikut:

[DNA] = Å 260 x 50 x faktor pengenceran

(23)

43

Å 260 = Nilai absorbansi pada 260 nm

50 = Larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 µg untai ganda

DNA per ml

f. Elektroforesis Gel Agarosa

Hasil isolasi DNA genom kemudian dilakukan runningdengan menggunakan

alat elektroforesis (Gambar 3.5.) dengan konsentrasi gel agarosa sebanyak 0,7%.

Sebelum melakukan elektroforesis, terlebih dahulu disiapkan gel agarosa untuk

dicetak pada cetakan gel yang telah dipasang sisir sebagai sumur. Gel agarose

yang baru dibuat atau dipanaskan didiamkan hingga hangat-hangat kuku

kemudian dituangkan ke dalam cetakan. Setelah gel sudah dingin atau beku

kemudian gel diletakkan pada kolom elektroforesis. Buffer TAE 1x dituangkan

dalam kolom elektroforesis hingga gel terendam. Line pertama pada sumur

dimasukkan 8 µl marker (ladder 1 kb DNA), line berikutnya diisi dengan 3 µl

sampel hasil isolasi genom yang dicampurkan dengan 2 µl loading dye. Setelah

itu tegangan dipasang 100 volt dengan waktu elektroforesis selama 25 menit.

Gambar 3.5. Alat untuk Elektroforesis (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2014)

Gel berisi DNA hasil running pada elektroforesis kemudian diambil dan

direndam dalam larutan Ethidium Bromide (EtBr) selama 3 menit, kemudian

(24)

44

pada UV transilluminator (Gambar 3.6.). Fragmen DNA yang muncul

didokumentasikan dengan menggunakan kamera digital.

Gambar 3.6. UV Transilluminator (Sumber: Dokumentasi Pribadi, 2014)

Hasil positif elektroforesis gel agarosa adalah munculnya pita yang berpendar

jika gel dilihat di bawah sinar UV. Hasil negatif elektroforesis gel agarosa adalah

tidak adanya pita yang berpendar jika gel agarosa dilihat di bawah sinar UV.

g. Analisis Data

Analisis data pada penelitian ini dimulai dengan membuat kurva pertumbuhan

dari nilai optical density (OD) yang diperoleh dari hasil pengamatan. Laju

pertumbuhan spesifik (µ) konsorsium bakteri dihitung dari data berat kering sel

(g/l) yang telah diperoleh per satuan waktu pada pengamatan laju pertumbuhan

konsorsium bakteri dengan menggunakan persamaan sebagai berikut:

µ = ln (Xt– X0)/ (t - t0)

Keterangan:

µ = Laju pertumbuhan spesifik (jam-1)

X = Konsentrasi biomassa (g/l)

t = Waktu pertumbuhan (jam)

DNA genom hasil isolasi dianalisis secara kualitatif dan kuantitatif. Secara

kualitatif dilakukan dengan elektroforesis pada gel agarosa dan secara kuantitatif

(25)

45

menghitung konsentrasi DNA. Data yang diperoleh kemudian dibahas sesuai

(26)

46

F. Alur Penelitian

Penjelasan mengenai prosedur penelitian dapat dilihat dalam bentuk diagram,

yaitu sebagai berikut:

Gambar 3.7. Diagram Alur Penelitian Preparasi medium, alat dan bahan penelitian

Enrichment

Pengukuran OD

Analisa Kadar Biomassa

Isolasi genom

Uji kemurnian

Elektroforesis hasil isolasi genom

Analisis Data

Kesimpulan

(27)

Rabbani, Nur Rahim 2014

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian tentang kinetika pertumbuhan dan isolasi

genomik konsorsium bakteri asal perairan hydrothermal vent Kawio pada medium

modifikasi Luria Bertani, dapat disimpulkan bahwa:

1. Kurva pertumbuhan menunjukkan empat fase yang terdiri dari fase lag, fase

logaritma atau eksponensial, fase stasioner dan fase kematian. Fase logaritmik

terjadi dari waktu pertumbuhan jam ke-2 hingga jam ke-12. Nilai OD

maksimum mencapai 0,576 dengan berat basah dan berat kering sel

berturut-turut sebesar 57 g/l dan 6 g/l.

2. Laju pertumbuhan spesifik dari konsorsium bakteri termofilik hydrothermal

vent Kawio adalah 0,2 jam-1.

3. Secara kuantitatif pada hasil spektrofotometri yang telah dilakukan, rasio

konsorsium bakteri termofilik hydrothermal vent Kawio yang didapat yaitu

1,294 dengan konsentrasi 52,5 ng/µl. Sedangkan secara kualitatif DNA

genom diketahui memiliki ukuran lebih dari 10000 bp.

B. Saran

Berdasarka npenelitian yang telah dilakukan, saran untuk penelitian

selanjutnya yaitu perlu dilakukan PCR untuk mengidentifikasi enzim-enzim

termostabil yang potensinya dapat dimanfaatkan dalam berbagai bidang. Selain itu

disarankan jugapenelitian lebih lanjut mengenai karakteristik spesifik dari

konsorsium bakteri asal perairan hydrothermal vent Kawio selain ditinjau dari

segi kinetika pertumbuhannya. Untuk mendapatkan nilai kemurnian yang tinggi,

perlu adanya optimasi kembali dari metode isolasi genom yang telah dilakukan

(28)

Rabbani, Nur Rahim 2014

DAFTAR PUSTAKA

Adiguzel, A. et al. (2010). Molecular diversity of thermophilic bacteria isolated from Pasinler hot spring (Erzurum, Turkey). Turkey Journal Biology, 35, hlm, 267-274.

Alberts, B. et al. (2002). Molecular Biology of the Cell. (edisi keempat). New York: Garland Science.

Andrade C., Jr pereira N., Antranikian G. (1999). Extremely thermophilic microorganisms and their polymer hidrolytic enzymes. Rev de. Microbiol. 30, hlm. 287-298.

Andrade, C.,M.M.C Nei Pereira Jr., & G. Antranikian.(1999).Extremely thermophilic microorganisms and their polymerhidrolytic enzyme.(A reviews, Department of Technical Microbiology). Germany: Technical University Hamburg.

Ausubel, et al. (2003). Current protocols in Molecular Biology. United Kingdom: John Wiley & Sons Ltd.

Baig M.M.V., Big M.L.B., Yasmaen M. (2004). Saccharification of banana agrowaste by cellulolytic enzymes. Afr J. Biotechnol. 3, hlm. 447-450.

Bailey James E. and David F. Ollis. (1987). Biochemical Engineering Fundamentals. New York: McGraw-Hill Book Company.

Barnet, Margaret. (1997). Microbiology Laboratory Exercises. (edisi kedua). London: WM.C. Brown Publisher.

Bertani, G. (1952). Studies on Lysogenesis I. The mode of phage liberation by lysogenic Escherichia coli. Bacteriology, 62, hlm. 293-300.

Bertani, G. (2004). Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems. Bacteriology, 186, hlm. 595-600.

Bettelheim, F.A., & Landesberg, J. (1984). Laboratory Experiments for General, Organic, and Biochemistry. (edisi keempat). New Jersey: John Wiley and Sons Inc.

Birren, B. et al. (1997). Genome analysis: A Laboratory Manual Volume 1. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

(29)

59

BPPT. (2010). Baruna Jaya IV mulai Berlayar lakukan Ekspedisi. [Online]. Diakses dari http://www.bppt.go.id/index.php/teknologi-sumberdaya-alam-dan-kebencanaan/489-baruna-jaya-iv-mulai-berlayar-lakukan-index-satal.

Brown, T.A. (2002). Genomes. (edisi kedua). Oxford: Wiley-Liss.

Büchel K. H. et al. (2000). Industrial Inorganic Chemistry. (edisi kedua). ISBN.

Campbell, N.A. et al. (2008). Biology. (edisi kedelapan). San Francisco: Pearson Benjamin Cummings.

Cappuccino, J.G. & Sherman, N (1987). Microbiology:A Laboratory Manual. California: The Benjamin Comings Publishing Company.Inc.

Collin, C.H and Lyne, P. M. (1987). Microbiological Method. (edisi kelima). London: Butterworths.

Corkill, G., Rapley, R. (2008). The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques. In: Molecular Biomethods Handbook. (edisi kedua). USA: Humana Press, NJ.

Corliss, J. B., et al. (1979).Submarine thermal springs on the Galapagos Rift. Science, 203, hlm.1073–1082.

Cowan, S.T. (1975). Cowan and Steel's Manual for Identification of Medical Bacteria. (edisi kedua). Cambridge: Cambridge University Press.

Cummings, B. (2006). Growth. [Online]. Diakses dari http://academic.pgcc.edu/~kroberts/Lecture/Chapter%206/growth.html.

D’Auria, S., F. La Cara, F. Nazzaro, N. Vespa, and M. Rossi. (1996). A thermophilic alcoholdehydrogenase from Bacillus acidocaldarius not reactive towards ketones. J. Biochem. 120, 498−504.

Dessy, C. S. (2008). Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatra Utara. (Tesis). Medan: Universitas Sumatra Utara.

Dirnawan H. (1999). Isolasi bakteri termofil penghasil enzim hidrolitik ekstraseluler dari sumber air panas Gunung Pancar. (skripsi). Institut Pertanian Bogor.

Dwidjoseputro, D. (1985). Dasar-dasar Mikrobiologi. Malang: Djembatan.

Edwards C. (1990). Microbiology of Extreme Environments. New York: Mc Graw-Hill Publishing Company.

(30)

60

Fardiaz, S. (1998). Fisiologi Fermentasi. Bogor : Lembaga Sumberdaya Informasi, IPB.

Fatchiyah, et al. (2011). Biologi Molekular Prinsip Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.

Felbeck, H., et al. (1981). Calvin - Benson cycle and sulphid-oxidation enzymes in animals from sulphide-rich habitats.Nature, 293, hlm. 291 - 293.

Fikrinda. (2000). Isolasi dan karakterisasi bakteri penghasil selulase ekstermofilik dari ekosistem air hitam. (tesis). Institut Pertanian Bogor.

Frederick A. Bettelheim, Joseph Marvin Landesberg. (2007). Laboratory Experiments for General, Organic and Biochemistry. USA: Brooks

Gerhardt, P., R.G.E. Murray, W.A. Wood and N.R. Krieg. (1994). Methods for General and Molecular Bacteriology. Washington D.C.: ASM Press.

Gottschal, J.C., Harder W., & Prins R.A. (2000). Principles of Enrichment, Isolation, Cultivation, and Preservation of Bacteria. [Online]. Diakses dari http://rizzo.springer-ny.com:6336/dynaweb/verlagprok/prokbook/IDMATCH (CHP2NDED,6/@BrowserPrint__BookTextView/;uf=0;ts=chapters;cs=brwp rint.

Handelsman, J. (2004). Metagenomics: Application of Genomics to Uncultured Microorganisms. Microbiology and Molecular Biology, 68 (4), hlm. 669– 685.

Harahap E.S. (2007). Amplifikasi gen 16SrRNA bakteri termofilik dari kawah air panas, Gunung Pancar Bogor. (skripsi). Institut Pertanian Bogor.

Helin, et al. (2010). Identifikasi Fragmen Gen 16S rRNA Bakteri Termofilik Hasil Isolasi dari Air Panas Gedong Songo. (Laporan Penelitian).

Hoelzel A.R, et al. (1994). Rapid Evolution of aheteroplasmic repetitive in the Mitochondrial DNA Control Region of Carnivores. Microbiology and Molecular Biology. 39, hlm. 191-199.

Ibrahim ASS, El-diwany AI. (2007). Isolation and identification of new cellulases producing thermophilic bacteria from an Egyptian hot spring and some properties of the crude enzyme. J Appl Sci. 1, hlm. 473-478.

Index Satal. (2010). EM302 Multibeam Survey of the Sangihe‐Talaud Region, North Sulawesi, Indonesia NOAA Office of Ocean Exploration and Research. University of New Hampshire, Department of Earth Sciences.

(31)

61

Jeanthon, C. (2000). Molecular ecology of hydrothermal vent microbial communities. Antonie van Leeuwenhoek. Microbiology and Molecular Biology. 77, hlm. 117–133.

Joannefox. (2013). The Human Genome Project: The Impact Of Genome Sequencing Technology On Human Health. [Online]. Diakses dari http://www.scq.ubc.ca/the-human-genome-project-the-impact-of-genome-sequencing-technology-on-human-health/.

Jude, Brooke. (2012). Agarose Gel Electrophoresis (basic methode). Bard College.

Judoamidjojo, M., A.A. Darwis, dan E.G. Sa’id. (1990). Teknolologi Fermentasi. Rajawali Pers: Jakarta.

Kamelia, R., M. Sidumarta & D. Natalia. (2005). Isolasi dan Karakterisasi Protease Intraselular Termostabil dan Bakteri Bacillus stearothermophilus RP1.(Makalah Seminar Nasional MIPA). Jakarta: Universitas Indonesia.

Karina, dkk. (2010). Isolasi Bakteri Termofilik dari Sumber Air Panas di Songgoriti. (Prosiding Tugas Akhir Semester Genap). Institut Teknologi 10 November.

Karp, Gerald. (2008). Cell and Molecular Biology. (edisi kelima). Wiley.

Kathleen. (2008). Foundations in Microbiology. New York: Prentice Hall.

Kato, et al. (1999). Analyses of microbial diversity in the sediment obtained from Japan Trench at a depth of 7326 m and high pressure cultivation. Biology Molecular, 15, hlm. 47–52.

Keller, G. H dan Mark M. M. (1989). DNA Probe. Macmilan: University Michgan.

Kennedy J, Marchesi JR, and Dobson ADW. 2008. Marine Metagenomics: Strategies for the Discovery of Novel Enzymes with Biotechnological Applications from Marine Environments. Microbial Cell Factories, 7 (27).

Kimura. (2006). DNA repair in plants. Chemistry, 106, hlm. 753-766.

Lay, B.W. (1996). Analisis Mikroba di Laboratorium. Jakarta: Raja Grafindo Persada. Hal. 57-58, 109.

Lederberg, J. & McCray, A.T. (2001). Ome Sweet ‘Omics—A Genealogical Treasury of Words. The Scientist,15 (7), hlm. 8.

(32)

62

Leja, Darryl. (2013). National Human Genome Research Institute (NHGRI). [Online]. Diakses dari http://www.scimathmn.org/stemtc/frameworks/9431-genes-proteins.

Lennox, E.S. (1955). Transduction of linked genetic characters of the host by bacteriophage P1. Virology, 1, hlm. 190-206.

Lestari, Y. (1998). Persiapan dan Pengenalan Bahan Laboratorium Mikrobiologi. (Pelatihan Peningkatan Pengetahuan dan Keterampilan Teknisi Litkayasa Pertanian). Bogor: IPB.

Lewin, B. (2008). Genes IX (dalam bahasa Inggris). Sudbury: Jones and Bartlett Publishers.

Luria, S. E. & Burrous, J. W.. (1957). Hybridization between Escherichia coli and Shigella. J. Bacteriol. 74, hal. 461-476.

Madigan, M.T., J.M. Martinko, and J. Parker. (2009). Biology of Microorganisms. (edisi kedua belas). New York: Prentice Hall International.

Mangunwidjaja, D. dan A. Suryani. (1994). Teknologi Bioproses. Swadaya: Jakarta.

Maryanti, B. dan Ariesyady, H.D. (2009). Indentifikasi keberagaman bakteri pada commercial seed pengolah limbah cair cat. Institut Teknologi Bandung.

Mayende L., Wilhelmi B.S., Pletschke B.I.. (2006). Cellulase (CMCase) and polyphenol oxidase from thermophilic Bacillus spp. Isolated from compost. Soil Biol Biochem. 38, hlm. 2963-2966.

Middlebeek, E.J., R.O. Jenkins and J.S. Drijver-de Haas. (1992). Growth in batch culture. In Vitro Cultivation of Micro-organisms. Biotechnology by Open Learning.

Molecular Station. (2008). Southern Blot.

http://www.molecularstation.com/dna/southern-blot/.

Nandi. B., R. K. Nandy, S. Mukhopadhyay, G. B. Nair, T. Shimada, and A. C. Ghose1. (2000). Rapid Method for Species-Specific Identification of Vibrio cholerae Using Primers Targeted to the Gene of Outer Membrane Protein OmpW. Clinical Microbiology. 38, hlm. 4145–4151.

National Oceanic and Atmospheric Administration. (2010). Vents. [Online]. Diakses dari http://www.pmel.noaa.gov/vents/chemocean.html.

(33)

63

Nazir, M. (1998). Metode Penelitian. Jakarta: Ghalia Indonesia.

NIehaus F, Bertoldo, Kahler M, Antranikian G. (1999). Extremophiles as a source of novel enzymes for industrial application. Applied Microbiol Biotechnol. 51 (6), hlm. 711-729.

Ningrum, E. P. (2008). Keragaman Gejala dan Penyebab Penyakit Keriting Kuning Cabai. (Skripsi). Universitas Gadjah Mada.

Okoh, Al. (2006). Biodegradation alternative in the cleanup of petroleum hydrocarbon pollutants. Biotechnol. And Molecular Biology Review. 1, (2), hlm. 38-50.

Panikov N.S. (1995). Microbial Growth Kinetics. London: Chapman & Hall.

Peanut. (2013). Luria Bertani broth. [Online]. Diakses dari http://everything2.com/title/Luria-Bertani+broth.

Pearce, Evelyn C. (2002). Anatomi dan Fisiologi untuk Paramedis. Jakarta : Gramedia Pustaka Umum.

Pelczar, M.J. & Chan, E.C.S. (1986). Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Penerbit Universitas Indonesia (UI-Press).

Pramono Y.B., Harmayani E., dan Utami T. (2003). Kinetika Pertumbuhan Lactobacillus plantarum dan Lactobacillus sp. pada Media MRS Cair. Jurnal Teknol. dan Industri Pangan. 14, (1), hlm. 46-50.

Pratiwi, S.T. (2008). Mikrobiologi Farmasi. Yogyakarta: Erlangga. Hal. 23,106-108,111-117,142.

Purwantara, A. (2001). Principles of DNA Isolation and Manipulation. (Workshop on Plant Pathogens Detection by Moleculae Tehniques).

Radjasa, O.K. 2004. Deep-Sea Bacteria and Their Biotechnological Potential. J. Of CoastalDevelopment. 7 (3), hlm. 109–118.

Restiawaty, E., Pertiwi, W., Insani, N., Aryantha, I.N.P., Natalia, D. (2013). Screening Bakteri untuk Biokonversi Limbah Biodiesel dari Diversitas Bakteri Indonesia. Seminar dan Pameran Inovasi dan Konstribusi Perempuan Peneliti ITB bagi Industri dan Masyarakat. Bandung, Indonesia.

Richardson, B. J, P. R. Baverstock and M. Adams. (1986). Allozyme Electro-phoresis. San Diego: Aca-demic Press.

Riesenfeld CS, Schloss PD, and Handelsman J. (2004). Metagenomics: Genomic Analysis of Microbial Communities. Annu. Rev. Genet. 38, hlm. 525–52.

(34)

64

Rondon, et al. (1999). Toward functional genomics in bacteria: analysis of gene expression in Escherichia coli from a bacterial artiﬁcial chromosome library of Bacillus cereus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, hlm. 6451– 6455.

Rositasari. (1992). Keunikan Komunitas Sumur Hidrotermal. Oseana. 17 (1), hlm. 21 – 34.

Ryu S. & Yun J. (2005). Screening for novel enzymes from metagenome and SIGEX, as a way to improve it. Microbial Cell Factories. 4, hlm. 8.

Sa’id, E.G. (1987). Bioindustri Penerapan Teknologi Fermentasi. PT. Melton Putra: Jakarta.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniati T. (1989). Molecular Cloning A Laboratory Manual. USA: Cold Spring Harbor Lab Press.

Sambrook, J., & Russel. (2001). Molecular Cloning-A Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Sandro. (2012). Hyrothermal Vents Deep Oceanic Hotsprings. [Online]. Diakses dari http:// unpad.ac.id/ronasandro/2012/10/31/hydrothermal-vents-deep-oceanic-hotsprings/.

Sari W.W. (2008). Karakterisasi selulase bakteri asal tanah pertanian Jawa Tengah dan Jawa Barat. (skripsi Institut Pertanian Bogor.

Scearce, C. 2006. Hydrothermal Vent Communities. [Online]. Diakses dari http://www.csa.com/discoveryguides/discoveryguides-main.php.

Schloss, P. D., and J. Handelsman. (2003). Biotechnological prospects from metagenomics. Curr. Opin. Biotechnol. 14, hlm. 303–310.

Schmeisser, C., Steele, H., Streit, W. R. (2007). Metagenomics: Biotechnology with Non-Culturable Microbes. Journal of Applied. Microbiol Biotechnol. 75, hlm. 955–962.

Shuler Michael L. dan Fikret Kargi. (1992) Bioprocess Engineering Basic Concepts. New Jersey: Prentice-Hall International Inc.

Sleator RD, Shortall C, and Hill C. (2008). Metagenomics. Applied Microbiology. hlm. 361– 366.

Sterrit, R.M., J.N. Lester. (1988). Microbiology for Environmental and Public Health Engineers. London: E&FN Spon Ltd.

Suckale, Jakob. (2009). DNA extraction with phenol chloroform. [Online].

Diakses dari

(35)

65

Sudarsono. (1996). Retricsion Fragmen Length Polymorphism (RFLP). (Tugas Akhir). Institut Pertanian Bogor.

Suharsono dan Widyastuti, U. (2006). Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi. Institut Pertanian Bogor.

Suhartono, M.T. (2000). Exploration Of Indonesian Thermophiles Producing Thermostable Chitinolytic Enzymes.(Report, Research Center For Biotechnology). Bogor:IPB.

Suryo. (2005). Genetika. Yogyakarta: Gadjah Mada University Press.

Surzycki, S. (2000). Basic Techniques in Molecular Biology. Spinger-Verlag. Berlin. Heidelberg. New York. [Online]. Diakses dari

http://www.palmta.org/uploads/132561702960108human-Molecular-Biology-Manual.pdf

Susanti H.E. (2007). Isolasi dan optimasi flokulasi bakteri penghasil bioflokulan dari sumber perairan di daerah Bogor (skripsi). Institut Pertanian Bogor.

Sutarma. (2000). Kultur Media Bakteri. (Temu Teknis Fungsional non Peneliti). Bogor: Balai Penelitian Veteriner.

Sutiamiharja, N. (2008). Isolasi Bakteri dan Uji Aktivitas Amilase Kasar Termofilik dari Sumber Air Panas Gurukinayan Karo Sumatra Utara. (Tesis). Universitas Sumatra Utara.

Suyono et al. (2008). Isolasi bakteri termofilik asam laktat dari kawah air panas Gunung Pancar Bogor (laporan akhir PKM). Institut Pertanian Bogor.

Tjahjoleksono, A. (2009). Plasmid.[Online]. Diakses dari http://web.ipb.ac.id/tpb/files/materi/genetika/dnarekombinan/plasmid.pdf

Uchiyama, T., & Miyazaki, K. (2009). Functional Metagenomics for Enzyme Discovery. Challenges.

Uria AR, Fawzya YN, dan Chasanah E. (2005). Eksplorasi Enzim Mikroba dari Lingkungan Laut Melalui Pendekatan Metagenomika. WPPI, 11 (7), hlm. 17-24.

Van Dover, C. L. (2000). The Ecology of Deep-Sea Hydrothermal Vents. Princeton University Press. 424 pp.

Verkuil, et al. (2008). Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. Berlin: Springer Science + Business Media.

(36)

66

Westerheide SD,and R.I Morimoto. (2005). Heat shock resonse modulators as therapeutic tools for disease of protein conformation. J. Biol Chem. 9, (5), 97-100.

Williams, M.P.M. & Liao, M.K. (2013). Luria Broth LB and Luria Agar LA media and their uses protocol. [Online]. Diakses dari http://www.microbelibrary.org/component/resource/laboratory-test/3031-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-protocol.