VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE ANALISA. FFS UHAMKA dan D4 Analis TLM. Hurip Budi Riyanti 2022

(1)

VALIDASI DAN VERIFIKASI METODE ANALISA

FFS UHAMKA dan D4 Analis TLM

Hurip Budi Riyanti 2022

(2)

GLOBALISASI PER DAGANGAN BEBAS

PERLU DIDUKUNG HASIL UJI LAB.

HASIL UJI YANG VALID

TIDAK BERGAN TUNG PADA LAB.

DIAKUI SECARA INTERNASIONAL

DIHINDARI DUPLI KASI PENGUJIAN

KESEHATAN PENEGAKKAN

HUKUM

(3)

KOMPONEN YANG MEMPENGARUHI UNTUK MENDAPATKAN HASIL UJI YANG VALID

1. Personil yang kompeten: diklat dan pengalaman kerja yang cukup.

2. Peralatan yang handal: dirawat, dikalibrasi, diverifikasi.

3. Metode yang sesuai : divaladasi / verifikasi.

4. Bahan yang memenuhi persyaratan: contoh uji, baku/standar, pereaksi.

5. Informasi dan penunjang laboratorium: data,

laporan, pustaka.

(4)

SNI - 17025 - 2017

6.2 Seleksi, Verifikasi dan Validasi Metode

Dalam melaksanakan mandat kegiatan laboratorium, salah satu faktor yang memengaruhi hasil pengujian atau kalibrasi adalah seleksi, verifikasi dan validasi metode.

Center for Drug Evaluation and Research (CEDAR), U.S.

Food and Drug Administration (FDA) menyatakan empat komponen yang harus dipenuhi untuk menghasilkan data pengujian bermutu yaitu:

kualifikasi/kinerja peralatan yang sesuai,

validasi metode, uji kesesuaian sistem, dan pengendalian mutu.

(5)

Seleksi :

• Sebelum melakukan pengujian,

laboratorium harus melakukan pemilihan metode pengujian yang akan digunakan

• Pemilihan metode pengujian didasarkan

pada banyak faktor sepeti biaya, peralatan,

bahan kimia, sumber daya manusia, kondisi

akomodasi dan lingkungan.

(6)

Lanjutan...seleksi

• Setiap laboratorium dapat memutuskan

sendiri metode pengujian mana yang akan digunakan yang disesuaikan dengan kondisi dan kemampuan laboratorium.

• Verifikasi :

penyediaan bukti objektif bahwa barang

tertentu memenuhi persyaratan yang

ditentukan

(7)

DEFINISI

SNI ISO 9000:2015 dan SNI ISO/IEC 17025:2017 mendefinisikan :

* validasi sebagai proses konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan bukti objektif bahwa persyaratan tertentu untuk maksud tertentu dipenuhi.

Dalam melakukan pengujian atau kalibrasi,

laboratorium harus menggunakan metode yang

tepat, sesuai maksud pengujian atau kalibrasi.

(8)

TUJUAN

Didapat hasil analisis :

 Absah / valid

 Dapat dipercaya

 Dapat dipertanggungjawabkan secara ilmiah

 Kesesuaian dengan tujuan

(9)

KLASIFIKASI METODE ANALISA

1. Metode standar / baku / acuan 2. Metode resmi

3. Metode pustaka

4. Metode yang dikembangkan oleh laboratorium

5. Metode yang dikembangkan oleh

organisasi profesional

(10)

METODE STANDAR

 Definisi: metode yang dikembangkan oleh organisasi / badan standarisasi baik nasional maupun internasional.

 Sifat :

 Dikerjakan oleh banyak ahli

 Divalidasi oleh banyak laboratorium

 Terbukti akurat dan yang paling terbaik.

 Contoh :

 SNI : dikembangkan oleh BSN

 ASTM: dikembangkan oleh American Society for Testing and Materials.

 ISO : dikembangkan oleh International Organization for Standarization

(11)

METODE RESMI

 Definisi: metode yang dipersyaratkan oleh undang-undang atau peraturan untuk digunakan oleh pemerintah atau organisasi / lembaga / industri yang diatur oleh pemerintah.

 Sifat:

• Karena pentingnya metode ini dalam pemberlakuan undang- undang, maka metode ini sebelum digunakan sudah divalidasi dahulu dengan teliti.

• Laboratorium yang terlibat dalam pemberlakuan metode ini tidak perlu melakuakan validasi lagi, tetapi cukup melakuan verifikasi.

 Contoh:

• FI dan KMI

• USP

• BP

(12)

METODE PUSTAKA

 Definisi: metode yang dipublikasikan dalam berbagai majalah ilmiah yang terspesilalisasi, seperti: kimia analitik, kimia makanan, kimia farmasi, dan lain-lain

 Sifat:

 Seringkali penulis artikel orisinil melakukan bias dalam asesmen kegunaannya

 Sebelum digunakan wajib divalidasi dengan teliti.

 Contoh:

 Jurnal-jurnal

 Buku Pustaka

(13)

METODE YANG DIKEMBANGKAN OLEH LABORATORIUM

 Definisi: metode yang dirancang, diuji coba, dan divalidasi secara luas oleh suatu laboratorium sehingga metode

tersebut dapat dipercaya dan memberikan hasil yang akurat.

 Sifat:

• Metode ini dapat merupakan karya orisinil laboratorium tertentu atau hasil modifikasi dari metode yang lainnya (metode standar, resmi atau pustaka).

• Sebaiknya dilakukan uji banding antar laboratorium.

 Contoh:

• Metode Analisa PPOMN

(14)

METODE YANG DIKEMBANGKAN OLEH ORGANISASI PROFESIONAL

 Definisi: metode yang dikembangkan oleh suatu organisa si profesional ilmiah yang penggunaanya relevan dengan bidang ilmu profesional tersebut.

 Sifat:

 Pada umumnya telah digunakan dalam uji profisiensi antar laboratorium baik nasional maupun internasional.

 Biasanya akurat dan telah divalidasi antar laboratorium

 Contoh:

 AOAC: dikembangkan oleh Association of Analitycal Chemists.

(15)

PARAMETER VALIDASI

1. Presisi (Ketelitian / Keseksamaan) 2. Akurasi (Ketepatan / kecermatan) 3. Sensitifitas (LOD dan LOQ)

4. Spesifisitas / Selektifitas 5. Linieritas

6. Range (Rentang)

7. Ruggednes (Kekasaran)

8. Robustness (Ketahanan)

(16)

PARAMETER VERIFIKASI

1. KUALITATIF : a. Batas deteksi b. Spesifisitas

2. KUANTITATIF : a. Presisi

b. Akurasi

(17)

PRESISI / KETELITIAN

Kedekatan hasil uji yang diperoleh dari beberapa pengulang an (replikasi) pada penetapan contoh yang sama (homogen).

Cara penetapan:

 Dilakukan pengujian berulang kali (mulai dari penyiapan sampel sampai perhitungan akhir) sebanyak 6 x atau lebih terhadap contoh yang sama.

 Presisi dinyatakan sebagai RSD.

 Nilai RSD yang dapat diterima tergantung dari konsentrasi analit dalam matriks contoh.

(18)

TINGKATAN PRESISI

1. Presisi metode (Repeatabilitas) : pengujian ulang de ngan kondisi contoh, metode, laboratorium, analis, alat dan waktu yang sama.

2. Presisi antara (Reprodusibilitas internal) : pengujian ulang terhadap contoh, metode, laboratorium dan alat yang sama, tetapi analis dan waktu pengujiannya ber beda.

3. Presisi antar laboratorium (Reprodusibilitas eksternal atau Ruggedness) : pengujian ulang dengan mengguna kan contoh dan metode yang sama, tetapi laboratorium, alat, analis dan waktu pengujiannya berbeda.

(19)

UKURAN PRESISI DAN PENETAPANNYA

 Presisi Sistem (Replikabilitas) :

Penyuntikan berulang minimum 6 kali dari contoh homogen untuk menunjukkan kinerja alat pada kondisi dan hari pengujian.

 Presisi Metode (Repeatabilitas) :

Minimum 3 konsentrasi analit dalam rentang

tertentu, masing-masing 3 replikasi atau minimum 6

penetapan pada konsentrasi pengujian 100 %

(20)

Presisi (Lanjutan)

SD = √ [ ∑ ( X_i– X_rata-rata )] / N – 1 RSD = [ SD / X_rata-rata )]

Reproduksibilitas menurut Horwitz :

RSD = 2

(1-0.5 log C )

C = fraksi konsentrasi

Semakin kecil konsentrasi analit, nilai RSD atau CV

yang dapat diterima semakin besar.

(21)

FRAKSI KONSENTRASI ( C )

• C harus ditulis dalam satuan yang sama, misalnya :

b/b b/v

kg/kg kg/L

g/g g/mL

mg/mg mg/10 ^–3 mL

• Dengan demikian apabila konsentrasi dalam ppm, misalnya 1 ppm maka :

• Konsentrasi = 1 mg/L

• Fraksi konsentrasi (C) = 1.10 –6 kg/L

• RSD (%) = 2 1-0,5 log 0,000001

(22)

HASIL PRESISI YANG MASIH DAPAT DITERIMA

No. Konsentrasi Analit Dalam Matriks Contoh

% RSD

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

100 g / kg 10 g / kg 1 g / kg 100 mg / kg

10 mg / kg 1 mg / kg 100 μg / kg 10 ug / kg

1 ug / kg 0,1 ug / kg

2 3 4 5 7 11 15 21 30 43

(23)

AKURASI / KETEPATAN

 Kedekatan hasil uji yang diperoleh (menggunakan metode yang sedang divalidasi) dengan nilai sebenarnya yang ter dapat dalam contoh uji.

 Akurasi biasanya dinyatakan sebagai prosen Recovery.

 Metode penetapan Akurasi :

• Recovery analit : untuk contoh yang komposisinya diketahui.

• Standar adisi : untuk contoh yang komposisinya tidak diketahui.

• Membandingkan hasil yang diperoleh dengan menggunakan metode yang telah valid

(24)

CARA PENETAPAN AKURASI

 Recovery Analit dan Metode Standard Adisi :

Minimum 3 konsentrasi analit / baku pembanding yang ditambahkan dalam rentang 80 % – 120 % , masing-masing 3 replikasi.

 Pembandingan Metode :

Minimum 6 kali pengujian menggunakan metode

analisis yang sedang divalidasi dan 6 kali pengujian

menggunakan metode standard atau metode resmi

(25)

HASIL AKURASI YANG MASIH DAPAT DITERIMA

No. Konsentrasi Analit Dalam Matriks Contoh

Rentang % Recavery 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

100 %

> 10 %

> 1 %

> 1000 ppm

> 100 ppm

> 10 ppm

> 1 ppm

> 100 ppb

> 10 ppb

> 1 ppb

98 - 102 98 - 102 97 - 103 95 - 105 90 - 107 80 - 110 80 - 110 80 - 110 60 - 115 40 - 120

(26)

Contoh metode standard adisi

Berat rata-rata tablet Aspirin yang mengandung 100 mg aspirin (etiket) = 300 mg. Rentang spesifik : 80%, 100%, 120% dan setiap rentang mengandung 70% analit contoh dan 30% baku pembanding.

- Rentang 80% = 80% .100 mg = 80 mg aspirin.

70% analit = 70% . 80 mg = 56 mg aspirin = (56/100) . 300 mg = 168 mg serbuk tab Aspirin.

Baku pembanding = 30% . 80 mg = 24 mg.

(27)

Contoh metode standard adisi (Lanjutan)

- Rentang 100% = 100% .100 mg = 100 mg aspirin.

70% analit = 70% . 100 mg = 70 mg aspirin = (70/100) . 300 mg = 210 mg serbuk tab Aspirin.

Baku pembanding = 30% . 100 mg = 30 mg

- Rentang 120% = 120% .100 mg = 120 mg aspirin.

70% analit = 70% . 120 mg = 84 mg aspirin = (84/100) . 300 mg = 252 mg serbuk tab Aspirin.

Baku pembanding = 30% . 120 mg = 36 mg

(28)

No Berat yang ditimbang ( mg )

Rentang % aspirin

80% 100% 120%

1.

2.

Serbuk tab. Aspirin Baku pembanding

168 24

210 30

252 36

Contoh metode standard adisi (Lanjutan)

Jadi berat serbuk tablet Aspirin dan baku

pembanding Aspirin yang harus ditimbang

adalah sebagai berikut :

(29)

Contoh metode standard adisi (Lanjutan)

Tetapkan kadar contoh produk obat, misalnya didapat B unit analit.

Baku pembanding analit yang ditambahkan ke dalam contoh produk obat misalnya X unit.

Tetapkan kadar dari jumlah total analit, misalnya didapat A unit analit.

Hitung % recovery ( R ) adalah

% Recovery ( R ) = [ ( A − B ) / X ] . 100 %

(30)

SENSITIFITAS

1. Batas deteksi (LOD)

kadar terendah analit dalam contoh yang masih dapat diteteksi, namun tidak harus kuantitatif.

2. Batas kuantitasi (LOQ)

kadar terendah analit dalam contoh yang masih

dapat ditetapkan kadarnya dengan presisi dan

akurasi yang masih dapat diterima.

(31)

CARA PENETAPAN SENSITIFITAS

• Prosedur non instrumen

Contoh dengan konsentrasi yang diketahui dilakukan analisa melalui evaluasi visual.

• Prosedur instrumen

– Rasio signal to noise: membamdingkan hasil uji contoh yang mengandung analit dengan kadar rendah terhadap hasil uji blanko

LOD = 3x noise LOQ = 10 x noise – Berdasarkan simpangan baku respon analit dengan

slope kurva kalibrasi

(32)

Contoh penetapan sensitifitas

No µg/ml

Analit (x

_i

) Area (y

_i

) (y

_i

)

^topi

[(y

_i

)

^topi

- (y

_i

)]

²

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7. 12.9 25.7 51.5 102.9 206.0 308.9 411.9

3910 7686 17875 33336 61759 92103 123794

4966.7 8767.5 16428.6 31691.3 62305.8 92860.9 123445.7

1116614.89

1169642.25

2092072.96

2705038.09

298990.24

574412.41

121312.89

(33)

Contoh penetapan sensitifitas (Lanjutan)

No µg/ml Analit (x_i) (x_i) ² [(x_i)- (x_rata2)] ² 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

12.9 25.7 51.5 102.9 206.0 308.9 411.9

(x_rata2) = 159.97

166.41 660.49 2652.25 10588.41 42446.0 95419.21 169661.61

∑ = 321584.38

21629.5849 18028.4329 11765.7409 3256.9849 2118.7609 22180.1449 63468.7249

∑ = 142448.3743

(34)

Contoh penetapan

sensitifitas (Lanjutan)

Koefisien korelasi = r = 0.9996786 ≈ 0.99968

Persamaan regresi : y = a + b x = 1136.16 + 296.94 x (y

_i

)

^topi

didapat dari persamaan regresi, misalnya untuk

x = 12.9 maka (y_i)^topi = [1136.16] + [(296.94).( 12.9

)]

S

_y/x ²

adalah variansi variabel respon (y)

S_y/x = √ ∑ [(y_i)^topi- (y_i)] ²/ N – 2

S

_a

adalah simpangan baku dari intersept (a)

S_a = S _y/x . √ ∑ x_i² / N ∑ ( x_i– x _rata-rata ) ²

(35)

Contoh penetapan sensitifitas (Lanjutan)

Menurut Miller : LOD = 3 . S

_y/x

/ b LOQ = 10 . S

_y/x

/ b Menurut IUPAC : LOD = 3 . S

_a

/ b

LOQ = 10 . S

_a

/ b

Dari data didapat :

Menurut Miller : Menurut IUPAC : LOD = 12.84 µg/ml LOD = 7.29 µg/ml LOQ = 42.81 µg/ml LOQ = 24.31µg/ml

(36)

SPESIFISITAS / SELEKTIFITAS

 Spesifisitas : Kemampuan metode analisis membe dakan suatu analit yang ditetapkan dari kompo nen lain yang berada dalam matriks contoh.

 Selektifitas : Kemampuan metode analisis memberi kan signal analit pada campuran analit dalam contoh tanpa adanya interaksi antar analit.

 Metode selektif merupakan seri metode spesifik.

 Prosedur spesifisitas tergantung pada tujuan

penggunaan

prosedur analisis.

(37)

Spesifisitas / Selektifitas (Lanjutan)

 Metode yang memiliki kespesifikan rendah, dapat berakibat pada analisa kualitatif akan terjadi kekeliruan positif (positive false) dan pada analisa kuantitatif akan terjadi hasil pengujian lebih besar dari sebenarnya.

 Contoh metode yang memiliki kespesifikan tinggi

adalah penetapan logam dalam berbagai matriks

sampel secara Spektrofotometri Serapan Atom

(AAS).

(38)

CARA PENETAPAN SPESIFISITAS

 Untuk uji identifikasi dan penetapan kadar :

Contoh blangko dan contoh yang ditambah sejumlah analit untuk mengetahui tidak adanya gangguan dari komponen lain (produk hasil urai, metabolit, senyawa aditif dll) dalam contoh terhadap analit.

 Untuk uji kemurnian :

- Cemaran/impurity tersedia

- Cemaran/impurity tidak tersedia

(39)

Cara penetapan Spesifitas ( Lanjutan )

 Cemaran / impurity tersedia : dibandingkan hasil uji contoh yang mengandung cemaran dengan contoh tanpa cemaran. Spesifisitas merupakan derajat bias / penyimpangan perbedaan hasil uji tersebut.

 Cemaran/impurity tidak tersedia : diuji kemurnian contoh misalnya secara kemurnian kromatografi.

Uji kemurnian puncak menunjukkan puncak

analit yang tidak diakibatkan oleh lebih dari satu

komponen / komponen lain.

(40)

LINIERITAS

 Definisi : kemampuan untuk menghasilkan hasil uji yang sebanding / berbanding lurus terhadap konsentrasi analit dalam contoh pada kisaran konsentrasi tertentu.

 Cara penetapan :

• Ditetapkan terhadap min. 6 konsentrasi pada rentang 50 – 150 % dari kadar analit.

• Hitung regresi linier dan koefesien korelasi (R)

• Harga R menunjukkan linieritas.

Kriteria : R > 0.997 (bahan aktif)

R > 0.98 (cemaran / impurity)

(41)

RANGE / RENTANG

• Kemampuan untuk memperoleh hasil uji yang kadar analitnya masih linier dengan presisi dan akurasi yang masih dapat diterima.

• Ditetapkan bersamaan dengan penetapan linieritas dengan melakukan pengujian terhadap contoh

yang kadarnya dibawah dan diatas normal.

• Buat kurva regresinya dan tentukan batas bawah dan batas atas dari kadar analit yang masih

memberikan garis linier.

(42)

RUGGEDNESS / KEKASARAN

 Definisi : kemampuan untuk memberikan hasil uji yang sama pada contoh yang sama, tetapi keragaman kondisi pengujian berbeda.

 Tujuan: untuk mengetahui pengaruh faktor eksternal terhadap metode (contoh dan metode sama, tetapi

laboratorium, alat, analis dan waktu pengujian berbeda).

 Cara penetapan : melakukan uji kolaborasi antar

labotorium, lalu membandingkan presisi dan akurasi dari hasil uji antar laboratorium tersebut.

(43)

ROBUSTNESS / KETAHANAN

• Definisi : ukuran kemampuan metode untuk tidak terpengaruh oleh perubahan kecil dari parameter metode yang sengaja dibuat.

• Tujuan : untuk mengetahui pengaruh faktor internal terhadap metode (dilakukan sedikit

pengubahan pada metode seperti: kecepatan laju alir pada kolom, komposisi fase gerak, suhu

kolom, lama penguapan).

• Cara penetapan : membandingkan presisi dan

akurasi hasil yang diperoleh dengan hasil yang

dilakukan pada kondisi normal.

(44)

Karakteristik validasi menurut USP 27 dan ICH

Metode analisis memerlukan karakteristik validasi, tergantung tujuan metode atau jenis pengujiannya.

USP 27 dan ICH memberikan batasan yang

sama terhadap karakteristik validasi yang

diperlukan saat metode analisis divalidasi.

(45)

Karakteristik validasi menurut USP 27

Karakteristik Validasi

Ka dar

Uji kemurnian Uji

Performance karakteristik

Identi fikasi Kuantitatif Uji

Batas Akurasi

Presisi

Spesifisitas LOD

LOQ

Linieritas Rentang

Yes Yes Yes No No Yes Yes

Yes Yes Yes No Yes Yes Yes

* No Yes Yes No No

*

* Yes

*

No No Yes

No No No No

(46)

Karakteristik validasi menurut ICH

Karakteristik Validasi

Identi fikasi

Uji kemurnian

Kuantitatif (kadar,disolusi) Kuantitatif Uji

Batas Akurasi

Repeatabilitas Presisi Antara Spesifisitas ^$ LOD

LOQ

Linieritas Rentang

No No No Yes

No No No No

Yes Yes Yes ^#

Yes

* Yes Yes Yes

No No No Yes Yes No No No

Yes Yes Yes ^#

Yes No No Yes Yes

(47)

Karakteristik validasi (Lanjutan)

Keterangan Tabel :

* = mungkin diperlukan, tergantung jenis/sifat.

# = bila telah dilakukan reproduksibilitas, presisi antara tidak perlu dievaluasi.

$ = metode analisis yang kurang spesifik, harus

ditunjang oleh metode analisis lain untuk

memperbaiki spesifisitasnya.

(48)

Metode analisis yang memerlukan validasi

 Metode analisis yang baru dikembangkan : karakteristik unjuk kerja metodenya belum diketahui (terkait dengan persyaratan dan penggunaannya).

 Metode analisis yang dimodifikasi dan atau diterap kan pada matriks / bentuk sediaan yang berbeda.

 Metode baku dan metode resmi yang akan

diadopsi, tidak perlu divalidasi tetapi cukup

diverifikasi.

(49)